CC BY
1132
Известия Тихоокеанского научно-исследовательского рыбохозяйственного центра 200Г Том 128
С.А.Черкашин
БИОТЕСТИРОВАНИЕ: ТЕРМИНОЛОГИЯ, ЗАДАЧИ, ОСНОВНЫЕ ТРЕБОВАНИЯ И ПРИМЕНЕНИЕ В РЫБОХОЗЯЙСТВЕННОЙ ТОКСИКОЛОГИИ
Рост масштабов освоения морского шельфа, в том числе разведка и эксплуатация нефтегазоносных месторождений, порождает опасность увеличения загрязнения дальневосточных морей. Наибольший ущерб экологические нарушения наносят рыбохозяйственной отрасли. Неблагоприятные биологические последствия загрязнения выходят за пределы локального воздействия, приобретая региональный и даже глобальный характер.
На современном этапе развития природоохранной деятельности очевидна недостаточность определения состояния водоемов с помощью гидрохимических методов на основе системы предельно допустимых концентраций (ПДК) для отдельных веществ. Весьма актуально выявление ранних последствий воздействия загрязнения на водные экосистемы, наступающих до изменения численности индикаторных организмов или их видового разнообразия. Поэтому первостепенное значение приобретает разработка экспериментальных методов оперативной оценки биологических эффектов на индивидуальном и популяционно-ценотическом уровнях (Лукьяненко, 1992).
В настоящее время при оценке качества морской среды и состояния ее обитателей всё большее внимание уделяется биотестированию - методическому приему, который используется для определения действия веществ на живые организмы в экспериментальных условиях. При этом регистрируются изменения каких-либо биологических или физиологобиохимических показателей исследуемого объекта по сравнению с контролем.
Биотестирование является не простым дополнением к существующей системе химико-аналитического контроля природных вод, а средством получения принципиально новой информации о составе и свойствах загрязнения, которая не может быть получена другими методами. Его результаты дают интегральную характеристику качества среды и состояния гидробионтов. В соответствии с нормативными документами Госкомприрода: РФ биотестирование является обязательным элементом системы оценки и контроля качества вод.
Некоторые исследователи утверждают, что при помощи биотестирования решается важное направление охраны водных экосистем - установление рыбохозяйственных ПДК (Данильченко, 1983; Флеров, 1983; Патин, 1984). Б.А.Флеров (1983), однако, считает, что процедура и результаты биотестирования отличаются от таковых при нахождении величины ПДК, прежде всего своей простотой и быстротой. Под главной задачей, которую решает биотестирование он понимает получение быстрого ответа,
1020
есть или нет токсичность. Другие ученые также видят основную цель биотестирования в получении оперативного сигнала о степени токсичности вод. Выявление слабой токсичности в этом случае никак не согласуется с основной задачей биотестирования и имеет отношение к биологической регламентации поступающих токсических веществ с помощью ПДК (Лукьяненко, 1983). В то же время, по мнению дальневосточных ученых, основная задача любого токсикологического опыта - определение максимальной недействующей (или безвредной, подпороговой, неэффективной) концентрации веществ, при которой не обнаруживается изменений в организмах (Тюрин, Христофорова, 1995).
Эти дискуссии в основном связаны с разными трактовками термина "биотестирование".
Слово "тест" означает опыт, исследование, испытание. У западноевропейских и американских токсикологов существуют термины "biossay" и "biotest", которые в переводе означают практически одно и то же, а именно: оценка действия веществ на живые организмы в стандартных условиях. Сходное определение дано отечественной Временной научно-технической комиссией (цит. по Б.А.Флерову, 1983): под биотестом понимается оценка (испытание) в строго определенных условиях действия вещества или комплекса веществ на водные организмы путем регистрации изменений того или иного биологического (физиолого-био-химического) показателя исследуемого объекта по сравнению с контролем.
Широта данного определения позволяет подвести под задачи биотестирования почти все вопросы экспериментальной токсикологии и многие направления ряда других научных дисциплин. Поэтому, по мнению К.С.Бурдина (1985), биотестирование включает:
1) изучение на живых организмах зависимости "доза загрязнителя
- его влияние";
2) изучение порога реакции; острые (кратковременные), подострые, хронические опыты на генетическом, клеточном, организменном уровнях; зависимость продолжительности жизни от дозы вещества; влияние на плодовитость и потомство;
3) изучение механизмов токсичности и интоксикации.
Встречаются предложения о еще большем расширении понятия
биотестирования и включении в его задачи исследований надорганиз-менного уровня. В качестве тест-объектов в этом случае предполагается использовать искусственные лабораторные экосистемы, экспериментальные пруды и изолированные части естественных биогеоценозов (Строганов и др., 1983; Брагинский и др., 1987).
Мы считаем, что действие загрязняющих веществ на сообщества и составляющие их популяции не может быть понято без знания индивидуальных ответов, ведь особи в первую очередь подвергаются воздействию измененной среды обитания.
Критерии оценки качества вод по показателям более высоких уровней организации экосистем — популяций и сообществ — имеют более расплывчатые границы по сравнению с показателями состояния особей, поскольку их ответы на стресс формируются при сложных механизмах взаимодействия с изменяющейся средой. Это затрудняет использование биологических критериев на уровне популяций и сообщества в численных расчетах (Моисеенко, 1998).
Биотестирование в наиболее широком понимании представляет собой методический прием, основанный на оценке действия факторов среды, в том числе и токсических, на организм, его отдельные функции или систему
1021
организмов (Филенко, 1985). Экспериментальные биологические методы анализа выходят на первый план везде, где требуется охарактеризовать взаимодействия между веществами и организмами: в фармакологии, токсикологии и т.д.
Подобные работы с гидробионтами могут быть использованы для следующих целей:
- оценка нарушения состояния живых организмов, биоценозов и экосистем;
- определение степени опасности загрязненных природных и сточных вод для здоровья людей, животного и растительного мира;
- оценка биологической активности разнообразных веществ (Те-литченко, Остроумов, 1990);
- разработка мер контроля, стандартов качества, ПДК, предельно допустимых нагрузок (ПДН) и конкретных программ мониторинга;
- ускоренная оценка токсичности каких-либо соединений для санитарно-гигиенических целей и др.
Внедрение биотестирования позволяет существенно сократить объем регулярно выполняемых детальных химических анализов (Филенко, 1989).
В отличие от физических и химических подходов к оценке загрязнения биологическое тестирование имеет прогностическое значение. По состоянию организмов, способности к развитию можно предсказывать изменения, ожидающие биоту при данном уровне загрязнения.
Все же большинство исследователей основными задачами биотестирования в области экспериментальной токсикологии считают оценку качества природных и сточных вод (Лесников, 1983а; Строганов и др., 1983; Лукьяненко, Карпович, 1989).
Проведенный нами анализ отечественной и зарубежной литературы, а также собственный опыт работы в данном направлении позволил выявить основные характеристики, относящиеся к различным направлениям биотестирования, которые свидетельствуют об общности их методической основы.
Сегодня под биотестом понимается система или определенный набор взаимосвязанных элементов, состоящий из трех основных частей: тест-объекта, который подвергается соответствующему воздействию со стороны экспериментатора; метода или набора методов для регистрации (фиксации) исследуемой реакции или характеристики (тест-функции); метода обработки получаемой информации (Короленко, 1981; Брагинский и др., 1987).
Выбор тест-организмов определяется их распространенностью, простотой содержания и культивирования в лаборатории, низкой стоимостью, легкостью наблюдений эффектов ксенобиотиков на организм и разработанностью простых методик таких наблюдений (Тюрин, Христофорова, 1995). В то же время при оценке растворов с низким содержанием токсикантов тест-объект должен быть достаточно чувствительным к присутствию в среде чужеродного химического вещества. Кроме этого, необходимо определить правила обработки данных и интерпретации полученных результатов, а также разработать руководство по практическому использованию выбранного объекта и функции.
При выборе объектов и показателей, методов биотестирования должны учитываться некоторые условия, основные из них - системность оценки, экологическая значимость, оперативность, разрешающая способность показателя и метода, воспроизводимость ответа тест-функции, практичность метода.
Под системностью подразумевается проведение оценок с использованием комплекса объектов и показателей, объединенных логически в
1022
некоторую систему. В качестве объектов для биотестирования применяются разнообразные гидробионты: бактерии, водоросли, высшие растения, пиявки, ракообразные, моллюски, рыбы. Каждый из этих тест-объектов заслуживает внимания и, по мнению разработчиков, имеет специфические преимущества. Однако ни один из организмов не является универсальным, самым чувствительным ко всем веществам в равной степени (Филенко, 1989). Исследование каких-либо отдельных групп гид-робионтов для оценки качества вод не позволяет сделать достоверных выводов о состоянии биоценозов в целом (Черкашин, Кандинский, 1985; Черкашин, Вейдеман, 1986; Волков и др., 1998; Методические указания..., 1998). Из-за видовых особенностей восприимчивости обитателей вод к загрязнителям должен использоваться набор объектов, представляющих различные таксономические группы. Целесообразно совместное использование для экспериментальной оценки воздействия загрязнителей на качество водной среды и непосредственно на гидробионтов организмов основных трофических уровней (Васьковец, Крайнюкова, 1990), в частности рыб и ракообразных, поскольку они обладают различной чувствительностью к разным группам токсикантов (Черкашин, Терновенко, 1989).
Опыт токсикологических исследований свидетельствует, что рыбы и дафнии оказываются лимитирующим объектом в 77 % случаев (Филенко, 1989). Анализ токсикометрии 160 веществ различной природы (Волков и др., 1998) показал, что приоритетно по ихтиологическому тест-объекту было установлено 33 % рыбохозяйственных ПДК, по дафнии магна — 18 %, по хирономидам — 7 %. Далее идут в порядке убывания роли в установлении ПДК сценодесмус, сапрофитная микрофлора, инфузории, элодея и др., что в целом согласуется с аналогичным анализом С.А.Патина (цит. по И.В.Волкову и др., 1998), получившим следующий ряд возрастания ток-сикорезистентности гидробионтов при установлении ПДК: рыбы — зоопланктон — сапрофитная микрофлора — зообентос — фитопланктон. Поэтому при формировании набора биотестов для комплексной оценки токсичности воды основная роль должна принадлежать тестам на рыбах и зоопланктоне, вспомогательная — на микрофлоре, зообентосе и фитопланктоне (Васьковец, Крайнюкова, 1990).
Для выбора в качестве тест-объекта организмов определенного вида надо знать не только стратегию жизненного цикла этого вида в целом (Лоренс, 1995), но и его способность переносить неблагоприятные условия на ранних стадиях онтогенеза. Использование местных тест-объектов является благоприятным обстоятельством, повышающим экологический реализм оценки (Филенко, 1989). Желательно, чтобы выбранные виды были ценными промысловыми или кормовыми объектами.
Степень информативности биологических критериев и их численных значений, способных адекватно отражать последствия загрязнения, определяет эффективность регламентирования антропогенных нагрузок. Способность индивидуальных биологических показателей однозначно отражать ход процессов в популяциях и биосообществах называют экологической значимостью этого показателя (Филенко, 1989). Эта наиболее сложная и объемная характеристика биотестов прежде всего отвечает на вопросы: насколько регистрируемая тест-функция важна для экосистемы в целом, насколько эффект, полученный в лабораторных экспериментах, будет наблюдаться в естественных условиях (Брагинский, 1981; Cherry, Caims, 1982).
При биотестировании растворов, в которых концентрации токсических веществ малы, необходима высокая разрешающая способность опытов. Она соответствует чувствительности тест-функции организма
1023
или его устойчивости, если регистрируемым откликом является смертность тест-объектов. Под разрешающей способностью биотестов мы подразумеваем наименьшую концентрацию токсиканта, вызывающую достоверное отклонение значения тест-функции от контроля. Существуют различные способы улучшения этой характеристики. В первую очередь это выбор тест-организмов, реагирующих на минимальное изменение окружающей среды. Увеличению разрешающих параметров биотеста во многом способствует поиск наименее устойчивых животных и растений разных систематических групп, наименее токсикорезистентных стадий развития животных. Обычно это эмбриональные и другие ранние стадии развития организмов (Патин, 1979; Шгаока, 1985; Щеглов и др., 1988; Тюрин, Христофорова, 1995).
Устойчивость живых организмов к воздействию неблагоприятных факторов в значительной степени зависит от их размеров. Наиболее уязвимы к загрязнению мелкие организмы (Патин, 1979). К ним относится планктон, в том числе икра и личинки большинства гидробионтов. Минимальные размеры, а следовательно и наибольшая удельная поверхность контакта с окружающей средой, являются одной из причин пониженной устойчивости к токсическим воздействиям. Механизмы низкой резистентности на ранних стадиях онтогенеза, вероятнее всего, связаны со спецификой морфофизиологических процессов в быстро развивающемся организме. Следствием этого является не только высокая интенсивность процессов жизнедеятельности на эмбриональных и личиночных стадиях развития, но и благоприятные физико-химические условия для активного включения токсикантов в физиолого-биохими-ческие процессы и последующего их ингибирования. Указанные выше процессы и явления, как и малые размеры организмов, в сочетании с высокой сорбционной способностью и относительной проницаемостью защитных оболочек предопределяют низкую токсикорезистентность ранних этапов онтогенеза.
На достижение высокой разрешающей способности направлен и метод функциональных нагрузок, основанный на предварительном ослаблении тест-организма каким-либо неблагоприятным воздействием (Лукьяненко, 1967; Брагинский, 1981; Флеров, 1983; Лукьяненко, Карпович, 1989; Черкашин, 1994). Особенно эффективен в этом случае резкий перепад температур.
В последнее время все чаще на смену альтернативному показателю "жизнь - смерть", обладающему недостаточной разрешающей способностью, приходят современные биохимические, физиологические методы. В связи с поиском чувствительных функций все большее внимание исследователей привлекает поведение животных и возможность с его помощью оценивать сублетальные уровни загрязнения (Лукьяненко, 1967; Флеров, 1983; Черкашин, 1986; Лукьяненко, Черкашин, 1987).
Разрешающую способность биотеста повышает и увеличение длительности опыта. Однако такой прием снижает оперативность оценки токсичности.
Под оперативностью, или экспрессностью, понимается время, необходимое для того, чтобы с заданным уровнем достоверности обнаружить величину воздействия с помощью выбранной тест-реакции. На крайнюю важность данной характеристики указывают практически все исследователи. Тем не менее рекомендуемые сроки тестирования у различных авторов значительно расходятся. В зависимости от целей исследования длительность опытов варьирует от нескольких минут до нескольких месяцев. Так, указывается, что при разработке биологических
1024
систем оповещения о токсичности необходимо оперативное получение информации о токсичности воды. Для этого целесообразно использовать "быстрые реакции", которые проявляются в пределах одного часа (Laad, 1976; Крайнюкова и др., 1983). По мнению других авторитетных специалистов, общая длительность экспериментальной оценки может измеряться часами, сутками, во всяком случае, не должна превышать 10 дней (Лесников, 19836). Считается, что для биотестирования качества сточных вод, поступающих в водоем после очистки, обычно достаточен краткосрочный лабораторный опыт в течение 5 сут. Определение качества воды природных водоемов осуществляют не менее 30 сут (Строганов и др., 1983).
Для биологических объектов характерно изменение ответов на воздействие с течением времени и изменением условий. Поэтому большое значение при биотестировании приобретает проблема воспроизводимости опытов. В связи с этим тест-функции, отбираемые для биотестирования, должны давать четкую и ясную реакцию на токсическое воздействие и мало зависеть от времени и условий исследований. Статистически значимые результаты обеспечиваются использованием в оценках повторяющихся измерений всегда или почти всегда на совокупности организмов (Филенко, 1989).
Большое значение для исследователей имеет адекватность биотестирования и его универсальность, которая определяет круг веществ или факторов среды, определяемых в опытах с достаточно высокой чувствительностью. Введение данной характеристики связано с тем, что разрешающая возможность экспериментальных работ может быть достаточно высокой по отношению к одной группе токсикантов и низкой по отношению к другой.
Очевидно, что требования, предъявляемые к биотестам, включают все перечисленные характеристики, причем в зависимости от области применения биотестирования значимость различных характеристик меняется. Так, в работах по определению ПДК, основное значение приобретает экологическая значимость и разрешающая способность теста. При биотестировании вод промышленных предприятий наибольшее значение имеют оперативность, чувствительность, технологичность метода, его низкая себестоимость. Наконец, при использовании биотестов в системе мониторинга загрязнения природных вод характеристики выстраиваются в следующем порядке: разрешающая способность, универсальность, экологическая значимость, адекватность.
Проведенный анализ результатов экспериментальных исследований подтверждает позицию основателей современной отечественной рыбохозяйственной токсикологии Е.А.Веселова (цит. по Волкову и др., 1998) и В.И.Лукьяненко (1967) о бесперспективности поисков универсальных тест-объектов при решении практических природоохранных проблем. В связи с этим возникает вопрос, можно ли ограничить число тест-объектов в разумных пределах, несмотря на видовое разнообразие.
Лишь немногие гидробионты проявляют заметные нарушения жизнедеятельности при низких концентрациях большинства токсикантов, встречающихся в водоемах. Нам представляется, что оптимальный список видов тестируемых гидробионтов для оценки токсичности отдельных загрязнителей и смесевых препаратов должен включать и такие чувствительные объекты, как рыбы на разных стадиях онтогенеза, и столь быстро размножающиеся организмы, как сапрофитная микрофлора. Необходимо использовать в системе разработки ПДК и представителей фито-и зоопланктона, а также бентосных организмов. Все это нашло отраже-
1025
ние в действующих Методических указаниях... (1998). Однако мы разделяем мнение И.В.Волкова с соавторами (1998), что методической базой при этом могут стать региональные ряды токсобности представительных олиготоксобных гидробионтов и соотнесение их с устойчивостью стандартизированных общепринятых обязательных тест-объектов. Такой подход "не вызывает особых возражений" и у В.И.Лукьяненко (1998). Всего же для разработки рыбохозяйственных ПДК загрязнителей, по нашему мнению, достаточно использовать 5-7 видов тест-объектов, а для биотестирования природных вод — 2-3 представительных вида, обладающих достаточной разрешающей способностью и относящихся к двум трофическим уровням.
Временная научно-техническая комиссия под председательством Л.П.Брагинского и А.Н.Крайнюковой показала, что более эффективно разрабатывались методы биотестирования сточных вод и отдельных токсических веществ, а в отношении природных вод остается еще много неясностей и нерешенных вопросов (Брагинский, Крайнюкова, 1989). Ранее считалось, что при исследовании состояния какого-либо водоема, когда еще не установлен факт загрязнения или источник и состав возможного загрязнения не известны, определение качества вод должно проводиться с помощью 3-4 тест-объектов, представителей пищевой цепи изучаемого водного объекта. Если нужно определить границы зоны устойчивого загрязнения и еще в ряде случаев, можно оценить ситуацию по реакциям всего лишь одного вида гидробионтов (Филенко, 1989). Из представленных комиссии методов к числу биотестов, которые могут быть использованы при биотестировании природных вод, можно отнести биолюминесцент-ный тест на светящихся бактериях, поведенческий биотест на пиявках, биотест по регенерации гидры, но все это пресноводные объекты (Брагинский, Крайнюкова, 1989).
Различия в избирательной чувствительности тест-объектов к отдельным химическим ингредиентам вызывают необходимость применять для биотестирования природных вод, по крайней мере, 3-4 биотеста: на животных, водорослях и бактериях. По-видимому, сочетание таких биотестов, как биолюминесцентный метод, дафниевый тест и один из альго-тестов, основанный на оценке эффективности фотосинтеза или флюоресценции водорослей, могло быть в 80-е гг. наиболее приемлемым сочетанием (Брагинский, Крайнюкова, 1989).
При выборе тест-объектов для биотестирования важна распространенность и численность того или иного вида и форм гидробионтов в данном регионе. От этого зависят возможность получения нужного количества материала для выполнения исследований и представительность данного тест-объекта. Необходимым условием биотестирования природных вод является использование набора объектов, представителей различных трофических уровней. Предпочтительно использовать местные виды, прежде всего промысловые и кормовые объекты, биология и физиология которых лучше изучены. При этом надо учитывать не только ареалы обитания и экологическую значимость представителей тех или иных звеньев пищевой цепи, но и их доступность и удобство использования в опытах (Патин, 1979). К числу наиболее уязвимых и быстро реагирующих на загрязнение относятся виды и формы гидробионтов малых размеров, в том числе одноклеточные водоросли, зоопланктонные фильтраторы и ранние стадии развития бентосных и нектонных животных (Патин, 1979). По этим признакам в качестве представительных тест-объектов для оценки воздействия на морские экосистемы мы оста-
1026
новились на организмах, принадлежащих к широко распространенным видам и основным трофическим уровням в море, включая планктонных и эпибентосных ракообразных (копепод, мизид) и ранние стадии онтогенеза рыб.
Выбираемые показатели эффекта должны отвечать, по крайней мере, на два основных требования - быстроту проявления и максимально высокий уровень биологической организации, возможной при этом. В пределах каждого уровня наибольшей экологической значимостью обладают интегральные параметры. На организменном уровне такими показателями обычно служат выживаемость и поведение. Оперативность реакции определяется требованиями исследования. Свидетельством токсического воздействия, выходящим за допустимые пределы, целесообразно считать достоверное угнетение интегральной функции хотя бы у одного из основных объектов (Филенко, 1989).
Введение технических средств должно быть преимущественно связано с упрощением учета таких интегральных на уровне организма тест-функций, как выживаемость, поведение и передвижение гидробионтов, рост особей (Филенко, 1989), поскольку визуальное наблюдение снижает объективность полученной информации. В то же время сейчас не так важно оснащение новых методов все более сложными системами и устройствами, как вопросы апробации, отбора и повышения чувствительности биотестов (Брагинский, Крайнюкова, 1989).
Вместе с тем в отличие от промышленности, для применения биотестирования на водоемах вряд ли следует дожидаться, пока будет проведена стандартизация. Задачи биотестирования на природных водах в основном сводятся к получению информации о загрязняемых акваториях и оценке степени неблагополучия, не затрачивая больших средств на химические анализы. Такую информацию можно получить независимо от того, стандартизированы биотесты или нет, а при необходимости в дальнейшем вести исследования стандартными методами (Брагинский, Крайнюкова, 1989).
На 1-м этапе работ лаборатории прикладной экологии и токсикологии ТИНРО в области биотестирования, в связи с огромным видовым разнообразием морских гидробионтов, было важно выбрать тест-объекты и тест-функции в соответствии с основными требованиями, приведенными выше. Первоначально для выбора наименее устойчивых животных и наиболее чувствительных реакций изучалась молодь 7 видов рыб, относящихся к 6 семействам (Черкашин, Кандинский, 1979; Черкашин,
1986) и два вида мизид рода Neomysis (Черкашин, Кандинский, 1978; Чер-кашин, 1986). Из органических загрязнителей исследовались водорастворимые компоненты дизельного топлива и фенола, а из неорганических — хлориды меди и цинка (Черкашин, 1986). Эти весьма распространенные и токсичные соединения представляют существенную опасность для биоты Японского моря (Румянцев, 1973).
В кратковременных опытах показано, что исследованные поллю-танты можно расположить в порядке убывания токсичности в следующий ряд: для молоди рыб — дизельное топливо — медь — фенол = цинк; для мизид — медь — дизельное топливо — фенол — цинк. Мизиды оказались менее устойчивы к воздействию почти всех изученных веществ. Устойчивость гидробионтов к цинку и дизельному топливу с возрастом повышается. Резистентность половозрелых рачков и их молоди к фенолу примерно одинакова (Черкашин, 1986).
Проведенные экспериментальные работы показали перспективность использования для биотестирования безусловных поведенческих реак-
1027
ций, формирующихся на основе хеморецепции. Результаты исследований позволяют рекомендовать реакцию избегания половозрелых животных при достаточно высокой температуре в качестве одного из элементов экспериментального обоснования ПДК тяжелых металлов и углеводородов, а также для биотестирования природных и сточных вод. Предложенная установка и способ биотестирования на основе использования реакции избегания позволяют достоверно оценить воздействие растворов и пригодны для интегральной оценки качества природных вод. Степень токсичности проб выявляется за 8 ч при использовании 8-10 животных (Черкашин, 1986; Лукьяненко, Черкашин, 1987).
Собственно биотестирование не является новым методологическим подходом даже при анализе состояния водоемов. С 1956 г. в ГосНИОРХе регулярно используется биотестирование качества природных вод с помощью ветвистоусых ракообразных — дафний. Этот метод был описан Л.А.Лесниковым в 1971 г. (цит. по Лесникову, 1983а). Данные исследования, как минимум, помогали понять причины изменений в составе и количестве природного зоопланктона на изучаемой акватории. Однако следует учитывать, что когда тест-организмы помещаются в пробу воды, взятую из водоема, определяется "мгновенный показатель", как и в случаях гидрохимических анализов.
Начиная с 1979 г. Отделом водных проблем Карельского филиала АН впервые в практике научных исследований биотестирование использовалось в комплексе с гидрохимическими, гидробиологическими и гидрологическими параметрами. Для получения экспрессной информации о токсичности водной среды в качестве "эталонного индикатора" применяли дафний. Предварительные результаты не выявили четкой зависимости между химическими показателями и данными биотестирования (Помазовская и др., 1990).
Практика применения биотестов показала, что зачастую причиной изменения реакций и даже гибели организмов может являться не только присутствие токсикантов, но и изменение основных абиотических параметров среды. Особенно сложно проводить оценку качества морских прибрежных вод, так как экосистемам этих районов, испытывающих интенсивную антропогенную нагрузку, свойственна значительная изменчивость абиотических условий. В данном случае для адекватной оценки качества вод требуется отсеять воздействие абиотических факторов и вычленить таким образом антропогенное воздействие из совокупного влияния всех факторов среды. Для этого необходимо установить ответ тест-организма на изменение важнейших абиотических факторов (Общие рекомендации..., 1989).
Первой попыткой в этом направлении явилось изучение реакции мизид на комплекс абиотических факторов с выраженным градиентом в прибрежных акваториях — соленость, взвешенное вещество и загрязнение цинком. Эти эксперименты позволили получить линейные уравнения множественной регрессии, из которых следовало, что наибольшее влияние на поведение рачков оказывали цинк и взвешенное вещество (Вейдеман и др., 1987).
Проведенные нами исследования показали, что эвригалинные гид-робионты с присущей им широкой нормой реакции на изменение солености малопригодны для целей биотестирования при оценке качества среды в районах смешения морских и пресных вод. В качестве тест-объектов следует использовать виды, относящиеся к одной локальной популяции и принадлежащие к одной возрастной и размерной группе. Необходим достаточный период акклимации животных к эксперимен-
1028
тальным условиям. Для повышения разрешающей способности биотеста следует отлавливать гидробионтов в районах с фоновым содержанием загрязнителей.
С 1984 г. биотестирование входит в комплекс мониторинга состояния зал. Петра Великого Японского моря (Вейдеман и др., 1987; Терно-венко, 1989). Экспериментальная оценка интегрального качества среды слабозагрязненных районов показала, что мизиды избегали воду, вызывающую их гибель в кратковременных опытах, а также ее разведения. Однако часто на возникновение реакции доминирующее влияние оказывали распреснение и взвешенное вещество. В этих условиях лишь использование подхода, включающего элементы моделирования, позволило выявить в ряде случаев дополнительное влияние загрязнения, его источники и область распространения.
Сопоставление экспериментальных данных с полевыми наблюдениями за распределением мизид во внутренних районах зал. Петра Великого подтвердило влияние загрязнения на пространственную структуру популяций подвижных животных и показало экологическую значимость реакции избегания (Черкашин, Терновенко, 1989). В целях более адекватного определения токсичности среды целесообразно использовать несколько тест-реакций стенобионтных видов ракообразных и рыб, в том числе выживаемость (Общие рекомендации..., 1989).
Предлагаемый подход к оценке качества вод в районах со значительными флюктуациями абиотических параметров является необходимым и весьма чувствительным инструментом экологического мониторинга, но он должен использоваться в сочетании с другими направлениями биологического и физико-химического мониторинга. Область применения данного подхода может быть значительно шире рамок эколо-го-токсикологического анализа влияния загрязнения на состояние экосистем (Общие рекомендации..., 1989).
Экспериментальные токсикологические исследования в открытых морских водах Дальневосточного региона начаты в 1981 г. в районе Берингова моря на борту НИС "Академик Ширшов" (Всесторонний анализ...,
1987) и в 1984 г. на НИС "Академик Королев" (Исследование экосистемы..., 1990).
В 1981 г. в качестве тест-объектов использовали лабораторные штаммы пресноводных культур сине-зеленых водорослей и культуру морской одноклеточной водоросли Platimonas viridis. В 1984 г. в том же районе Берингова моря изучалась экологическая устойчивость природных сообществ фито- и микрозоопланктона в краткосрочных экспериментах по схеме "доза-эффект". Кроме того, проводились многофакторные эксперименты с природными популяциями микрозоопланктона (бесцветные жгутиковые, инфузориевые, фито- и бактериопланктон) по исследованию комбинированного воздействия цинка, кадмия, ПХБ и бенз(а)пирена. На сообществах инфузорий изучалось влияние меди, кадмия, свинца, а также биогенов. Получена общая закономерность - отсутствие токсичности исследуемых проб воды и наличие некоторого токсического эффекта в отдельных исследуемых пробах грунта, что вполне закономерно для незагрязненных вод Берингова моря.
В 1988 г. на НИС "Академик Королев" (Исследование экосистем..., 1992) в Беринговом и Чукотских морях американскими учеными проводилось биотестирование проб донных отложений с помощью двух морских тест-организмов: 2-3-суточных науплиусов жаброногого рачка и морских динофлагелят (одноклеточная водоросль).
1029
В 1993 г. в лабораториях НИС "Академик Несмеянов" проводились комплексные экспериментальные исследования с использованием гид-робионтов различных систематических групп (лабораторных культур морских одноклеточных водорослей, эмбрионов морских ежей, планктонных ракообразных).
Основная масса проб поверхностного слоя воды, поверхностного микрослоя и донных отложений в исследованных районах Охотского и Берингова морей не проявляла токсического эффекта при биотестировании с помощью морской одноклеточной водоросли. Однако для икры морских ежей на двух станциях в южной части Камчатского залива и на одной станции южнее центральной части Олюторского залива отмечена токсичность воды. На этих же станциях вода была токсична и для микроводорослей, но в меньшей степени (Соколова и др., 1995). Слабый эмб-риотоксический эффект на развитие эмбрионов морских ежей оказала вода, отобранная из поверхностного слоя в районе Пильтун-Астохского нефтегазоносного месторождения. Вода из поверхностного и придонного слоев в районе Луньского нефтегазоконденсатного месторождения на северо-восточном шельфе о.Сахалин была высокотоксичной для личинок ежей (Мойсейченко, Черкашин, 1995).
В том же рейсе была выполнена серия опытов с веслоногими рачками. В токсикологических исследованиях фактор времени зачастую имеет решающее значение, поэтому для сокращения продолжительности опытов целесообразно использовать метод функциональных нагрузок и на этом фоне определять состояние индикаторной функции. Такой подход позволяет выявить не только уже имеющиеся нарушения в деятельности той или иной функциональной системы, но и возможности организма адаптироваться к стрессирующим воздействиям факторов внешней среды в условиях хронического действия малых концентраций токсических веществ.
Ухудшение условий существования гидробионтов выступает в роли дополнительной функциональной нагрузки при оценке общего состояния организма. Изменения качества водной среды снижают общую резистентность гидробионтов, в том числе устойчивость к токсикантам.
В целях отработки метода функциональных нагрузок в основном мы использовали массового и широко распространенного килеватого каля-нуса ^еоса1ап^ cristatus). Рачки, отловленные в Тихом океане у северных Курильских островов и в Беринговом море, мало отличались друг от друга по своей резистентности к снижению солености. Наименее устойчивым к распреснению оказался килеватый калянус из тихоокеанских вод южных Курильских островов (Черкашин, 1994; Соколова и др., 1995). Вероятно, среда обитания для этого вида планктонных ракообразных здесь менее пригодна. Остротоксичной для рачков оказалась вода у г. Петропавловск-Камчатский, в то время как вода бухты Русской, расположенной неподалеку, но загрязненной значительно меньше, лишь ненамного снижала выживаемость копепод по сравнению с контролем (Черкашин, 1994).
Проведенные в 1994 г. исследования показали, что в прикурильских водах токсикорезистентность массовых видов копепод из различных водных масс существенно варьировала и в то же время была несколько выше, чем в зал. Петра Великого Японского моря. Наибольшее влияние на их жизнестойкость оказывало физиологическое состояние (в частности, процесс линьки), температура и лишь затем загрязненность акватории.
Очевидно, условия обитания не оказывали значительного отрицательного воздействия на состояние копепод, т.е. экологическая ситуация для них в большинстве исследованных районов существенно не различалась.
Таким образом, полученные результаты описывают благополучное состояние веслоногих ракообразных как в прикурильских водах, так и в относительно чистых районах зал. Петра Великого. Учитывая широкую распространенность исследованных видов копепод, их многочисленность и важную роль в питании рыб, мы рекомендуем использовать данных веслоногих ракообразных для постоянного мониторинга состояния морских экосистем и оценки изменения кормовой базы промысловых гид-робионтов. Вместе с тем эти работы целесообразно вести в комплексе с другими вариантами биотестирования, биоиндикацией и физико-химическим мониторингом.
Показано, что для разных по качеству вод более или менее чувствительными являются различные виды ракообразных (Щербань, 1990). Поэтому, изучая состояние природных водоемов, следует проводить наблюдения не на одном тест-объекте, а на нескольких для выявления наиболее результативных показателей и наиболее чувствительных видов, которые в дальнейшем следует использовать при мониторинге.
Проведенные нами исследования токсикорезистентности копепо-дитов веслоногих рачков трех видов показали их большую устойчивость к загрязнителям по сравнению с молодью мизид. Появилась задача поиска более подходящих тест-объектов открытых морских вод.
Выше было показано, что отрицательное воздействие токсикантов быстрее проявляется в опытах с мелкими организмами, в том числе на икре и личинках большинства морских животных. В то же время численность поколения определяется именно условиями выживания икры и личинок на ранних стадиях развития (Дехник, Расс, 1987). Поэтому целью наших дальнейших исследований явилось изучение устойчивости массовых видов ихтиопланктона из нескольких акваторий северозападной части Тихого океана и дальневосточных морей.
Экспериментальное изучение жизнестойкости личинок 5 видов рыб выявило существенное влияние их видовых особенностей на выживаемость в условиях воздействия экстремальных факторов. Наиболее уязвимой к воздействию повышенного содержания цинка оказалась сайра. Концентрация 0,2 мг/л вызывала через сутки гибель всех ее предличи-нок, выклюнувшихся последними. Для более жизнестойких предличинок этого вида рыб летальная концентрация для 50 % тест-объектов (ЛК50) за 24 ч составляла 3,8 мг/л, а 48 ч ЛК50 - 0,7 мг/л. С увеличением длительности воздействия минимальная токсичная концентрация будет значительно меньше, т.е. безопасные концентрации этого металла для сайры составляют лишь десятки микрограммов на литр.
Наиболее устойчивыми к цинку в наших экспериментах оказались личинки летучих рыб. Жизнестойкость тест-объектов изменялась в процессе их развития, причем видоспецифично. У личинок большинства исследованных видов рыб она значительно снижалась после резорбции желточного мешка. Для сайры этот период наступал на вторые сутки после выклева, для летучих рыб и японского анчоуса - на четвертые-пятые сутки в зависимости от температуры растворов.
Данные о зависимости токсичности различных веществ и устойчивости гидробионтов от абиотических факторов водной среды известны уже давно (Лукьяненко, 1967; O'Hara, 1973; Христофорова, 1989), однако они все еще не находят должного применения при экспериментальных
работах. Между тем умелое использование этих сведений позволило бы не только существенно сократить продолжительность опытов, проводя их в дискомфортных для избранных тест-объектов условиях (своего рода метод функциональных нагрузок), но и разрабатывать ПДК с запасом экологической прочности, т.е. с учетом диапазона колебаний физикохимических факторов водной среды в естественных водоемах (Лукьяненко, 1998). Нам удалось показать, что использование функциональных нагрузок значительно понижает устойчивость предличинок японского анчоуса к кадмию, позволяя выявить в острых опытах недействующие концентрации, ниже официально утвержденных в нашей стране ПДК для катионов этого металла, но сопоставимые с данными дальневосточных (Тюрин, Христофорова, 1995) и зарубежных исследователей (Мур, Рамамурти, 1987).
В настоящее время в систему охраны водоемов от загрязнения входят как регламентации поступления в водоем загрязнителей с помощью разработки ПДК, так и мониторинг состояния экосистем. В обоих случаях используется биотестирование, высокая эффективность и целесообразность широкого применения которого доказана опытом природоохранных мероприятий стран Западной Европы и США.
Однако разработанные методы биотестирования созданы главным образом для оценки токсичности сточных вод либо для установления ПДК различных химических соединений. Это привело к тому, что биотестирование способно в основном выявлять высокие концентрации загрязняющих веществ, что чаще всего не дает возможности использовать его для исследования состояния водоемов, особенно слабозагрязненных, таких как открытые моря.
Задача в последние годы сводится к тому, чтобы разработать систему биотестирования естественных водоемов, пригодную для экологического мониторинга. Она должна состоять из нескольких методов (вследствие разной чувствительности видов к различного класса токсикантам) с тест-организмами из основных групп гидробионтов данного водоема (Брызгало и др., 1989). К основным проблемам биотестирования природных вод следует отнеси трудности количественного выражения и интерпретации результатов. Необходимо различать естественную токсичность, обусловленную природными процессами, протекающими в водоеме, и токсичность, возникающую в результате деятельности человека.
Становится все более актуальной широкая апробация методов биотестирования в природных условиях, непосредственно на водных объектах, определение и конкретизация области их использования. Успешное применение этих методов в системе экологического мониторинга может быть осуществлено при условии установления четких взаимосвязей с изменениями соответствующих параметров среды обитания, вызванными внешними воздействиями. Эта задача может быть решена прежде всего путем привлечения результатов физико-химического мониторинга. Мы разделяем мнение, что "биотесты — не панацея и не самоцель, а лишь один из важных компонентов комплексной оценки качества гидросферы, которые наряду с гидрохимическими, санитарно-гидробиологическими и другими данными в недалеком будущем должны быть включены в банки данных экологического мониторинга и составят тот фундамент, на основе которого директивные органы будут принимать конкретные управляющие решения о водоохранных мероприятиях..." (Брагинский, Крайнюкова, 1989, с. 202).
Литература
Брагинский Л.П. Теоретические аспекты проблем "нормы и патологии" в водной экотоксикологии // Теоретические вопросы водной токсикологии: Мат-лы 3-го сов.-амер. симпоз. - Л.: Наука, 1981. — С. 29-40.
Брагинский Л.П., Величко И.М., Щербань Э.П. Пресноводный планктон в токсической среде. - Киев: Наук. думка, 1987. - 179 с.
Брагинский Л.П., Крайнюкова А.Н. Методы оценки токсичности сточных вод и перспективы их использования в контроле природных вод // Методы биоиндикации и биотестирования природных вод. - Л.: Гидрометеоиздат, 1989.
- С. 194-203.
Брызгало В.А., Соколова Л.П., Бражникова Л.В. Пути развития гидробиологического контроля поверхностных вод // Методы биоиндикации и биотестирования природных вод. - Л.: Гидрометеоиздат, 1989. - С. 216-261.
Бурдин К.С. Основы биологического мониторинга. - М.: Изд-во МГУ, 1985.
- 158 с.
Васьковец Л.А., Крайнюкова А.Н. Перспективы разработки комплексной оценки токсичности воды для целей экологического нормирования // Методология экологического нормирования. Ч. II, секция 3: Тез. докл. Всесоюз. конф.
- Харьков, 1990. - С. 134-135.
Вейдеман Е.Л., Черкашин С.А., Щеглов В.В. Комплексные исследования воздействия загрязнения на морские прибрежные экосистемы // Тр. ДВНИИ: Вопросы мониторинга природной среды. - Л.: Гидрометеоиздат, 1987. - Вып. 131. - С. 30-40.
Волков И.В., Заличева И.Н., Моисеева В.П. и др. Региональные аспекты водной токсикологии // Экологические аспекты регламентирования антропогенного загрязнения водоемов России (региональные ПДК). — Ярославль: ВВО РЭА, 1998. - С. 3-20.
Всесторонний анализ экосистемы Берингова моря / Ред. Ю.А.Израэль, А.В.Цыбань. - Л.: Гидрометеоиздат, 1987. - 264 с.
Данильченко О.П. Место биотестирования в системе охраны водоемов от загрязнения // Всесоюз. симпоз. "Обобщенные показатели качества вод. Практические вопросы биотестирования и биоиндикации": Тез. докл. - Черноголовка: Отдел ин-та хим. физики АН СССР, 1983. — С. 13-16.
Дехник Т.В., Расс Т.С. Основные аспекты исследований ихтиопланктона // Вопр. ихтиол. - 1987. - Т. 27, вып. 5. - С. 721-728.
Исследование экосистемы Берингова моря / Ред. Ю.А.Израэль, А.В.Цы-бань. - Л.: Гидрометеоиздат, 1990. - Вып. 2. - 334 с.
Исследование экосистем Берингова и Чукотского морей / Ред. Ю.А.Израэль, А.В.Цыбань. - Л.: Гидрометеоиздат, 1992. - Вып. 3. - 656 с.
Короленко П.И. К вопросу терминологии в области водной токсикологии // Гидрохимические материалы. — 1981. - Т. 82. — С. 118-129.
Крайнюкова Л.Н., Смирнова А.Н., Носикова Н.С. Результаты опытной эксплуатации экспериментальных образцов биосигнализаторов токсичности // Все-союз. симпоз. "Обобщенные показатели качества вод". Практические вопросы биотестирования и биоиндикации": Тез. докл. - Черноголовка: Отдел ин-та хим. физики АН СССР, 1983. — С. 77-79.
Лесников Л.А. Основные задачи, возможности и ограничения биотестирования // Теоретические вопросы биотестирования. - Волгоград: Ин-т биол. внутр. вод АН СССР, 1983а. - С. 3-12.
Лесников Л.А. Биотестирование в системе охраны вод // Всесоюз. симпоз. "Обобщенные показатели качества вод. Практические вопросы биотестирования и биоиндикации": Тез. докл. - Черноголовка: Отдел ин-та хим. физики АН СССР, 1983б. — С. 23-27.
Лоренс Дж.М. Использование стратегии жизненного цикла вида в оценке морских беспозвоночных для биотестирования // Биол. моря. - 1995. - Т. 21, № 6. - С. 386-389.
Лукьяненко В.И. Токсикология рыб. — М.: Пищ. пром-сть, 1967. — 116 с.
Лукьяненко В.И. Биохимические тесты в ихтиотоксикологии // Теоретические вопросы биотестирования. - Волгоград: Ин-т биол. внутр. вод АН СССР, 1983. - С. 38-45.
Лукьяненко B.^ Комплексный физиолого-биохимический мониторинг природных популяций рыб и качества водной среды // 8-я науч. конф. по экол. физиол. и биохимии рыб: Тез. докл. Т. 1. - Петрозаводск: Кар. науч. центр РAH. Ин-т биол., 1992. - С. 192-195.
Лукьяненко B.^ Экологические основы регламентирования антропогенного загрязнения водоемов России // Экологические аспекты регламентирования антропогенного загрязнения водоемов России (региональные ПДК). - Ярославль: ВВО РЭ^ 1998. - С. 37-62.
Лукьяненко B.№, Карпович T.A. Биотестирование на рыбах: Методические рекомендации. - Рыбинск: Aкадемия наук СССР, 1989. - 96 с.
Лукьяненко B.№, Черкашин C.A. Экспериментальное обоснование возможности использования реакции избегания гидробионтами токсикантов для биотестирования качества водной среды // Физиология и биохимия гидроби-онтов. - Ярославль: Яросл. гос. ун-т, 1987. - С. 48-57.
Meтодичeскиe указания по установлению эколого-рыбохозяйственных нормативов (ПДК и OБУB) загрязняющих веществ для воды водных объектов, имеющих рыбохозяйственное значение. - М.: ВНИРО, 1998. - 148 с.
Mоисeeнко ЪИ. Экотоксикологический подход к нормированию антропогенных нагрузок на водоемы севера // Экология. - 1998. - № 6. - С. 452-461.
Mойсeйчeнко T.B., Черкашин C.A. Использование гамет, эмбрионов и личинок морского ежа для оценки токсичности буровых растворов и их компонентов // Биол. моря. - 1995. - Т. 21, № 6. - С. 419.
Mуp Дж., Рамамурти C. Тяжелые металлы в природных водах: Контроль и оценка влияния. - М.: Мир, 1987. - 288 с. (Пер. с англ.).
Oбщиe рекомендации по использованию функционального моделирования для оценки качества водной среды. - Владивосток: ТИНРО, 1989. - 19 с.
Патин C.A. Влияние загрязнения на биологические ресурсы и продуктивность Мирового океана. - М.: Пищ. пром-сть, 1979. - 304 с.
Патин C.A. Биологические и рыбохозяйственные аспекты проблемы охраны водоемов от загрязнения // Биогеохимические и токсикологические исследования загрязнения водоемов. — М.: Наука, 1984. - С. 3-8.
Помазовская И^., Дубровина A.B., Флинк E.B. Роль экологических исследований в оценке состояния экосистем // Методология экологического нормирования. Ч. II, секция 3: Тез. докл. Всесоюз. конф. - Харьков, 1990. — С. 144.
Румянцев A.^ Степень загрязнения, изученность и задачи исследования загрязненности биологических ресурсов дальневосточных морей // Защита моря и береговой полосы от загрязнения: Тез. докл. Всесоюз. науч.-техн. конф. -Батуми, 1973. - С. 15-16.
Уколова C.A., Огарцева Л.И., Mойсeйчeнко T.B., Черкашин C.A. Исследование воды и донных отложений в западной части Берингова моря методом биотестирования. // Комплексные исследования экосистемы Берингова моря: Сб. науч. статей. - М.: ВНИРО, 1995. - С. 241-247.
Броганов H.C., Филенко OÆ., Лебедева Г.Д. и др. Основные принципы биотестирования сточных вод и оценка качества вод природных водоемов // Теоретические вопросы биотестирования. - Волгоград: Ин-т биол. внутр. вод AH СССР, 1983. - С. 21-29.
Teлитчeнко M.M., Oстpоумов C.A. Введение в проблемы биохимической экологии: Биотехнология, сельское хозяйство, охрана среды. — М.: Наука, 1990. — 288 с.
Tepновeнко B.A. Биотестирование морской среды с помощью поведенческих реакций ракообразных: Aвтореф. дис.... канд. биол. наук. - Севастополь, 1989. - 24 с.
Tюpин A.H., Христофорова H.R Выбор тестов для оценки загрязнения морской среды // Биол. моря. - 1995. - Т. 21, № 6. - С. 361-368.
Филенко OÆ. Взаимосвязь биотестирования с нормированием и токсикологическим контролем загрязнения водоемов // Водные ресурсы. - 1985. -№ 3. — С. 130-134.
Филенко OÆ. Биотестирование: возможности и перспективы использования в контроле поверхностных вод // Методы биоиндикации и биотестирования природных вод. - Л.: Гидрометеоиздат, 1989. - С. 185-193.
Флеров Б.А. Биотестирование: терминология, задачи, перспективы // Теоретические вопросы биотестирования. — Волгоград: Ин-т биол. внутр. вод АН СССР, 1983. — С. 13 — 20.
Христофорова Н.К. Биоиндикация и мониторинг загрязнения морских вод тяжелыми металлами. — Л.: Наука, 1989. — 192 с.
Черкашин С.А. Реакция избегания гидробионтами (молодь рыб и ракообразные) некоторых токсикантов: Автореф. дис.... канд. биол. наук. — Севастополь, 1986. — 17 с.
Черкашин С.А. Использование метода функциональных нагрузок для оценки состояния зоопланктона и качества вод дальневосточных морей // Всерос. конф. “Экосистемы морей России в условиях антропогенного пресса (включая промысел)": Тез. докл. — Калининград, 1994. — С. 541—543.
Черкашин С.А., Вейдеман Е.Л. Мониторинг загрязнения морских прибрежных вод по гидробиологическим показателям // Тез. докл. Всесоюз. совещ. “Охрана природной среды морей и устьев рек". — Владивосток, 1986. — Т. 1. — С. 18 — 20.
Черкашин С.А., Кандинский П.А. Влияние цинка на поведение мизид // Тез. докл. науч.-практ. конф. “Проблемы защиты моря от загрязнения". — Владивосток, 1978. — С. 38.
Черкашин С.А., Кандинский П.А. Влияние цинка на поведение молоди некоторых видов рыб Японского моря / / Экологическая физиология и биохимия рыб: Тез. докл. 4-й Всесоюз. конф. — Астрахань, 1979. — Т. 2. — С. 184—185.
Черкашин С.А., Кандинский П.А. Место экологического мониторинга загрязнения среды при рациональном использовании биоресурсов морей, его ос — новные задачи и направления // Исследование и рациональное использование биоресурсов дальневосточных и северных морей СССР и перспективы создания технических средств для освоения неиспользуемых биоресурсов открытого океана: Тез. докл. — Владивосток, 1985. — С. 137—138.
Черкашин С.А., Терновенко В.А. Избегание гидробионтами токсикантов в экспериментальных и естественных условиях // Тез. докл. Первой Всесоюз. конф. по рыбохозяйственной токсикологии. — Рига, 1989. — Ч. 2. — С. 184 — 187.
Щеглов В.В., Мойсейченко Г.В., Черкашин С.А., Огородникова А.А. Общие закономерности изменения устойчивости разных стадий онтогенеза морских гидробионтов к токсическому действию тяжелых металлов и нефтепродуктов // 5-я Всесоюз. конф. по водной токсикологии: Тез. докл. — М.: ВНИРО, 1988. — С. 86.
Щербань Э.П. Эффективность биотестирования природных вод на вет — вистоусых ракообразных // Методология экологического нормирования. Ч. II, секция 3: Тез докл. Всесоюз. конф. — Харьков, 1990. — С. 162.
Cherry D.S., Cairns G.Jr. Biological monitoring. P. V. — Preference and avoidance studies // Water Res. — 1982. — Vol. 16. — P. 263 — 301.
Hiraoka Y. A re-examination of the toxicity test for water pollutants // J. Med. Sci. - Hiroshima, 1985. — Vol. 34. - P. 323 — 326.
Laad E.C. Industrial view of biological monitoring // Bull. Soc. Hist. Nat. — Toulouse, 1976. — Vol. 112. — P. 88 — 96.
O'Hara J. The influence of temperature and salinity on the toxicity of cadmium to the fiddler crab, Uca pugilator // Fish. Bull. — 1973. — Vol. 71. — P. 149—153.
Поступила в редакцию 21.08.2000 г.
