Разработка тест-системы для биотестирования солоноватых вод Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

УДК 574.24: 574. 64

А. О. Смуров, О. С. Попова

РАЗРАБОТКА ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ БИОТЕСТИРОВАНИЯ СОЛОНОВАТЫХ ВОД

ЗИН РАН, Санкт-Петербург

Сегодня разнообразие токсикантов, попадающих в воду, исчисляется тысячами наименований, и их число продолжает расти. Оценка концентрации каждого химического вещества и прогнозирование их воздействия на живые организмы становится трудно разрешимой задачей . Поэтому в экологических исследованиях, наряду с методами химического и физико-химического анализа, все шире применяются методы биотестирования, позволяющие получить интегральную (обобщенную) оценку качества воды как среды обитания живых организмов . Для выявления интегральной токсичности водной среды применяются методики, основанные на выживаемости, поведенческих, морфологических и физиологических реакциях тест-организмов, которые культивируются в лабораторных условиях

Результаты, полученные с применением биотестирования, считаются адекватными, если исследуемые пробы тестировались на нескольких тест-объектах. Это требование вызвано тем, что не существует организма, одинаково чувствительного ко всем токсикантам [11] . Лучшими тест-объектами считаются местные виды, играющие заметную роль в экосистемах водоемов . Использование местных видов — благоприятное обстоятельство, повышающее экологический реализм оценки [8] . Поэтому каждый крупный регион мира имеет свой апробированный набор видов для биотестирования . В качестве тест-объектов в настоящее время используются гидробионты многих таксономических групп: от бактерий до рыб [8, 13] .

Большая часть методик биотестирования, принятых в Российской Федерации, разработана для пресных вод, в то время как выбор биотестов для морской среды остается весьма ограниченным . Среди применяющихся тест-объектов можно указать водоросли Dunaliella salina [4] и Phaeodactylum МсогпиШт [3], гидроидных полипов Со^уЪрЪога Мегтатса и С. caspia [5], двухстворчатого моллюска МуЫ1ш galloprovincialis [10], эмбрионы и личинки морского ежа Scaphechinus miraЪilis [4], гипергалинного рачка Аrtemia salina [6], личинки японского анчоуса Engraulisjaponicus и длиннорылой камбалы Lmanda punctatissma punctatissma [11]. Еще меньшее число методов можно применить для исследования токсичности водных объектов, где имеется градиент солености — эстуариев и распресненных участков моря, так как их соленость является летальной для большинства пресных и морских видов, которые применяются в качестве тест-объектов . Для биотестирования вод в градиенте солености из имеющегося списка тест-объектов, применяющихся в Российской федерации, пригодны только тесты на водоросли Dunaliella salina, гидроидных полипах Cordylophora inkermanica и С. caspia и жаброногих рачках

© А. О . Смуров, О . С . Попова, 2008

Artemia salina, причем D. salina и A. salina не являются естественными обитателями эстуариев рек России.

Таким образом, набор тест-объектов, которые могут быть использованы для биотестирования солоноватых вод невелик. Учитывая то, что не существует организма одинаково чувствительного ко всем токсикантам, приходится сделать вывод, что возможности использования методов биотестирования качества воды солоноватых водных объектов существенно ограничены. Поэтому поиск новых тест-организмов, которые способны обитать в эстуариях и распресненных участках моря, является актуальным

Во многих странах мира принято использовать морских и пресноводных инфузорий для исследований качества морской и пресной среды [6] . Биотесты на инфузориях нередко оказываются более чувствительными, чем биотесты на клеточных линиях морских и пресноводных позвоночных [14].

Удобным тест-объектом для биотестирования как пресных, так и солоноватых и морских вод, по нашему мнению, могут быть виды эвригалинных парамеций: Paramecium calkinsi, P woodruffi, P duboscqui и P nephridianum . Эвригалинные парамеции как тест-объекты обладают рядом достоинств: высокой скоростью размножения, ярко выраженными таксисами, широкой толерантностью по отношению к температуре и солености и простотой содержания в лабораторных условиях [16, 19] . Кроме того, эвригалинные парамеции встречаются в большинстве морских и солоноватых морей Российской федерации [9, 16, 17, 18]. До настоящего времени нигде в мире не существует разработанных методик биотестирования пресных или морских вод с помощью эвригалинных инфузорий таким образом, представляет интерес изучение особенностей использования биотестирования воды различной солености на эвригалинных парамециях. Целью нашей работы было исследование возможности использования P nephridiatum в качестве тест-объекта для биотестирования пресной и соленой воды

Материалы и методы исследования. Экспериментальные исследования проводили на P. nephridiatum (клон SR98-2, выделен С . И . Фокиным в 1998 г. на Белом море) . Клетки культивировали на салатной среде инокулированной Klebsiella aerogenes [20]. Необходимая соленость создавалась добавлением в среду раствора искусственной морской соли, сделанной по рецепту [12] на дистиллированной воде . Парамеций, прежде чем использовать в опытах, содержали как в пресной, так и в соленой салатных средах, не менее двух недель при температуре 18-20 °С . В течение всего срока акклимации инфузорий кормили один раз в неделю . Пересадка инфузорий в чистые пробирки производилась раз в 3-4 недели .

Изучалась реакция клеток в процессе акклимации к пресной среде и среде соленостью 12 %о на различные концентрации Cu2+ . В данных опытах клетки первоначально были акклимированы к пресной среде и к среде соленостью 12 %о . Затем инфузории акклимировались к новой солености: акклимирован-ные к пресной среде — к 12 %о, акклимированные к 12 %о — к пресной среде в течение 3, 6, 12, 24, 48, 72, 96 и 120 ч . После соответствующего выдерживания в новой солености они были помещены в воду аналогичной солености с добавлением разных концентраций ионов меди (0-4,5 мг/л) . Спустя час после начала опыта подсчитывалась доля активных клеток . Опыты проводились при температуре 18-20 °С .

В качестве тест-реакции изучаемой тест-системы была выбрана активность инфузорий . Активность определялась по способности клеток передвигаться после переноса в новую соленость или в соленую воду с добавлением ионов меди . В опытах инфузории рассаживались в многолуночный микроаквариум с объемом лунки 0,25 мкл (по десять особей на лунку) . Активность клеток определяли через 24 ч после переноса в новую соленость . Для каждого значения солености и концентрации ионов меди тестировалось 100 клеток . Клетки, которые не двигались в течение 30 с во время просмотра, считались не активными . При этом экспериментатором не предпринимались специально усилия для того, чтобы вынудить движение клеток

Различия в доле активных клеток в зависимости от концентрации ионов меди в среде и времени акклимации были статистически оценены двухфакторным дисперсионным анализом (ANOVA) как для клеток акклимированных первоначально к пресной среде, так и для клеток акклимированных к соленой

среде (12 %о). Чтобы применить дисперсионный анализ, значения долей были преобразованы по следующей формуле: р = 2ш^т^р где р — преобразованная величина, р — доля активных клеток

Оценка достоверности влияния факторов проводилась с помощью критерия Фишера (Г) .

Связь между долей активных клеток и концентрацией ионов меди в среде была оценена при помощи линейного регрессионного анализа . Оценка достоверности коэффициентов проводилась с помощью критерия Стьюдента. Вычисления и оценки параметров были сделаны в программе STATISTICA 6 . 0 .

результаты исследования. В процессе акклимации инфузорий к пресной и соленой среде происходит снижение активности; полного ее восстановления не происходит даже спустя 120 ч после начала акклимации (рис . 1) . Активность клеток, акклимируемых к новой солености среды (контроль), достоверно отличается от активности клеток из первоначальной солености во всех случаях за исключением значения, соответствующего 48 ч после начала акклимации к пресной среде .

Активность клеток, подвергнутых действию ионов меди разной концентрации, в большинстве случаев меньше, чем активность контрольных клеток . Соответственно, в наших опытах, активность клеток зависит как от степени акклимированности инфузорий так и от влияния концентрации токсиканта

Анализ полученных данных показал достоверность влияния факторов концентрации Си2+ в среде и фактора времени при акклимации в обоих направлениях (табл . 1, 2) . Влияние концентрации ионов меди в среде объясняет 75,7 % общей вариации при акклимации к пресной среде и 76,5 % при акклимации к соленой среде . На долю

Время, ч

__ЕЗ-_12 % > пресн . —■— пресн . > 12 %

Рис. 1. Доля активных клеток при акклимации инфузорий к новой солености

Горизонтальная линия на графике (У = 100 %) соответствует контролю; вертикальные линии — 95%-ные доверительные интервалы (то же для рис . 2, 3, 4) .

Таблица 1

Акклимация инфузорий к пресной среде (перенос клеток из 12 %о в пресную среду)

Источник вариации Сумма квадратов Степени свободы Средняя сумма квадратов ^-отношение р-значение

Концентрация Си2+ 16,6 6 2,767 45,5 <0,000001

Время акклимации 2,79 7 0,399 6,56 <0,0001

Случайная 2,55 42 0,061

Общая 21,94 55

Таблица 2

Акклимация инфузорий к соленой среде (перенос клеток из пресной среды в 12 %о)

Источник вариации Сумма квадратов Степени свободы Средняя сумма квадратов ^-отношение р-значение

Концентрация Си2+ 11,22 6 1,87 40,66 <0,0001

Время акклимации 1,52 7 0,218 4,74 <0,001

Случайная 1,93 42 0,046

Общая 14,67 55

фактора времени акклимации приходится 10-12 % общей дисперсии . Проведенный дисперсионный анализ показал, что построенная модель объясняет 88,4 % общей изменчивости при акклимации клеток к пресной среде и 86,8 % при акллимации клеток к соленой среде

В целом активность клеток при акклимации к пресной среде оказалась достоверно более низкой (р < 0,05), чем при акклимации к соленой среде (рис . 2) . Зависимость между активностью инфузорий (Р) и концентрацией ионов меди в среде (С) имеет линейный характер (рис . 3) . Формула для инфузорий, акклимируемых к соленой среде: Р = (74,12±10,21) - (13,295±3,417) х С (п = 7) имеет достоверные коэффициенты при уровне значимости (р < 0,001) . Аналогичная зависимость для инфузорий, акклимируемых к пресной среде выражается формулой Р = (69,799±11,283) - (15,371±3,776) хС (п = 7) . Оба коэффициента значимы на уровне (р < 0,001) .

Направление процесса соленостной акклимации неодинаково влияет на тест-реакцию . С момента начала акклимации и до 24 ч изменения активности носят колебательный характер, амплитуда которого более выражена у инфузорий акклимируемых к пресной среде . В дальнейшем при увеличении срока акклимации активность клеток, акклимируемых к пресной среде постепенно уменьшается, в то время как активность клеток, акклимируемых к соленой среде, увеличивается (рис 4)

Обобщенная картина изменения активности инфузорий не отражает все особенности направлений этих изменений при различных концентрациях ионов меди в среде

В процессе акклимации инфузорий к пресной среде при концентрации Си2+ рав-

50

45

40

35

30

25

20

15

10

5

0

1

2

Рис. 2. Доля активных клеток при их акклимации к пресной (1) и соленой (2) среде

о

ь

<и

ч

и

ї

да

s

§

к

ч

о

Концентрация ионов меди, мг/л

1 □ 2

Рис. 3. Доля активных клеток при их акклимации к пресной (1) и соленой (2) среде в воде с различной концентрацией ионов меди

о

ь

<D

«

X

3 X да s

S

к

4 о

Время, ч

-^-1

-2

Рис. 4. Зависимость активности инфузорий от продолжительности акклимации

1 — инфузории, акклимирущиеся к пресной среде; 2 — к соленой среде .

Время, ч

----контроль —в—1 мг/мл —2 мг/мл--^-3 мг/мл -^-3,5 мг/мл д- 4 мг/мл * 4,5 мг/мл |

Рис. 5. Влияние различных концентраций ионов меди на активность инфузорий в процессе их аккли-

мации к пресной среде

ной 1 мг/л, наблюдалось полное восстановление активности на 4-е сутки опыта (рис . 5) . При более высоких значениях концентрации ионов меди (2 мг/л и больше) восстановления активности после 5 суток акклимации не происходило . В этих концентрациях Си2+ наибольшее уменьшение активности приходилось на 3 ч акклимации, затем активность достоверно (р < 0,05) повышалась при 6 ч акклимации . При сроках акклимации, более чем 6 ч в концентрациях ионов меди больших 3 мг/л происходило постепенное уменьшение активности инфузорий . При концентрации Си2+ 4,5 мг/л на 5-е сутки опыта некоторые инфузории погибали, а активность оставшихся была равна «0» . В концентрации ионов меди в среде равной 2 мг/л активность клеток становилась постоянной к 24-48 ч после начала акклимации достигая 50 % .

При акклимации инфузорий к соленой среде происходило восстановление активности клеток при концентрациях Си2+, равной 1 и 2 мг/л, на 5-е сутки опыта (рис . 6) . При более высоких значениях концентрации ионов меди (3 мг/мл и выше) восстановления активности после 5 суток акклимации не происходило . Так же как при акклимации инфузорий к пресной среде наибольшее уменьшение активности приходилось на 3 ч акклимации при концентрациях ионов меди в среде 3 мг/л и выше . Однако при концентрациях Си2+, равной 1 и 2 мг/л, достоверное изменение активности инфузорий по сравнению с контролем (р < 0,05) наблюдалось только на 6-часовой акклимации . Гибели клеток в тестируемых концентрациях не наблюдалось

Обсуждение результатов исследования. Важнейшими свойствами реакции тестового организма на действие токсиканта считаются ее чувствительность к изучаемому фактору, которая напрямую связана с высокой разрешающей способностью биотеста, простота для регистрации и хорошая воспроизводимость результатов [1, 11]. Последние

Время, ч

контроль —в— 1 мг/мл —■— 2 мг/мл —о— 3 мг/мл —♦— 3,5 мг/мл - - - д- - - 4 мг/мл - * ■ 4,5 мг/мл

Рис. 6. Влияние различных концентраций ионов меди на активность инфузорий в процессе их аккли-

мации к соленой среде

свойства тест-реакции важны в связи с предъявляемыми контролирующими организациями специальными требованиями: нетребовательностью к специальному оборудованию и нетребовательностью к квалификации персонала [1].

Такие показатели, как скорость роста особей, их продуктивность и выживаемость, удается успешно использовать для биологического тестирования состояния среды . До настоящего времени в качестве основной тест-функции используется выживаемость, которая является интегральной характеристикой резистентности организмов [11]. В ряде работ было показано, что активность клеток является более чувствительной, чем резистентность к влиянию токсикантов тест-реакцией [1]. Поэтому в настоящем исследовании была выбран в качестве тест-реакции активность клеток

проведенные нами опыты показали, что тест-система позволяет успешно выявлять концентрацию меди в среде от 2 мг/л и выше для культуры, акклимированной к пресной среде, и от 1 мг/л и выше для инфузорий, акклимированных к среде соленостью 12 %о . Согласно принятым нормам ПДК ионов меди в питьевой воде не должно превышать 1 мг/л [2]. В странах Евросоюза аналогичный ПДК равен 2 мг/л [15]. Считается, что эта концентрация не должна оказывать прямого или косвенного влияния на организм человека в течение всей его жизни, а также на здоровье последующих поколений и не должна ухудшать гигиенические условия водопользования [7]. Инфузории «ведут себя» согласно требованиям, предъявляемым к разработке ПДК для питьевой воды: при концентрациях ионов меди, в среде равных ПДК, клетки, спустя несколько дней после начала воздействия, адаптируются так же, как клетки, не подвергшиеся действию токсиканта

Под разрешающей способностью тест-реакции подразумевается наличие выраженной реакции на испытуемый образец (с токсикантом), которая должна

достоверно отличаться от реакции на контрольный образец . Наивысшая разрешающая способность тест-реакции, согласно нашим данным, достигается через 3-б ч носле начала акклимации

Зависимость полученных результатов от фактора концентрации токсиканта объясняет около 75 % общей вариации, а влияние фактора времени, взаимодействия факторов и случайной изменчивости невелико Поэтому можно предположить a priori хорошую воспроизводимость результатов

Предложенная нами методика проста для воспроизведения и не требует ни сне-циального дорогого оборудования, ни высокой квалификации персонала и может быть, согласно полученным нами результатам, применена как для биотестирования пресных, так и солоноватых вод

***

Авторы признательны С . И . Фокину за предоставление клона P nephridiatum и содействие в проведении экспериментальных работ

Summary

Smurov A. O., Popova O. S. Elaboration of test-system for bioassay of brackish water.

The definite proof of use of euryhaline species for bioassay of fresh and brackish water is the goal of our study. The present investigation examines the toxicity of copper for ciliate P. nephridiatum in the process of acclimation to fresh and brackish water (12 %o). It is shown that a test-system allows to distinctly educe if copper concentration in water is approximately 1 mg/l or more . The obtained results allow to recommend using P. nephridiatum for bioassay of fresh and brackish water.

Key words: test-system, bioassay, brackish water, ciliate .

литература

1. Виноходов Д. О. Научные основы биотестирования с использованием инфузорий: Автореф . канд . дис . СПб . , 2007. 40 с .

2 . ГОСТ 2874-82 . Вода питьевая . Гигиенические требования и контроль за качеством . М. , 1982 .

3 . Дятлов С. Е., Петросян А. Г. Норма реакции лабораторной культуры Phaeodactylum tricornutum Вohlin. на абиотические факторы . I . Чувствительность к стандартному токсиканту бихромату калия // Альгология . 2000 . Т. 10, № 1. С . 32-35 .

4 . Журавель Е. В., Маркина Ж. В., Христофорова Н. К., Айздайчер Н. А. Использование микроводоросли Dunaliella salina, эмбрионов и личинок плоского морского ежа Scaphechinus mirabilis как тест-организмов для оценки качества воды в заливе Петра Великого Японского моря // Биология моря 200б. Т 32 . Вып. 3 . С . 188-19б.

5 . Кошелев А. В . Гидроидные полипы рода Cordylophora в токсикологических исследованиях // Экология моря. 2003 . Т б4 . С . 105-108 .

6 . Петросян А. Г., Дятлов С. Є. Шкала токсичності для оцінки якості морського середовища з використанням наупліальних стадій Аrtemia salina L . // Вісник Одеського державного університету. 2000 . Т 5 . Вин . 1: Біологія . С . 222-227.

7 . СанПиН 2 .1. 5 . 980-00 . Гигиенические требования к охране поверхностных вод // Офиц. изд. Утв . 22 . 0б .2000. Ввод 01. 01.2001. М. , 2000 .

8. Филенко О. Ф. Биотестирование: возможности и перспективы использования в контроле поверхностных вод // Методы биоиндикации и биотестирования природных вод л , 1989 С . 185-193.

9 . Фокин С. И., Сабанеева Е. В. Эвригалинные парамеции (Ciliophora, Peniculina) побережий Баренцева и Белого морей и их эндобионты // Экология, воспроизводство и защита биоресурсов северных морей Европы . Мурманск, 1990 . С . 139-141.

10. Ходаков И. В., Дятлов С. Е., Петросян А. Г. Использование ранних стадий эмбрионального развития черноморской мидии Mytilus galloprovincialis Lam . для биотестирования природных и сточных вод // Гидробиол . журн. 1996 . Т 32, № 5 . С . 67-77.

11. Черкашин С. А., Никифоров М. В., Шелехов В. А. Использование показателей смертности предличинок морских рыб для оценки токсичности цинка и свинца // Биология моря . 2004. Т 30, № 3 . С.247-252.

12. Шубравый О. И. Аквариум с искусственной морской водой для содержания примитивного многоклеточного организма Trichoplax и других мелких беспозвоночных // Зоол . журн. 1983 . Т. 62 . Вып. 4 . С . 618-621.

13. Cairns J. Jr. The myth of the most sensitive species // BioScience . 1986 . Vol . 36, N 10 . P. 670-672.

14. Dayeh V. R., Lynn D. H., Bols N. C. Cytotoxicity of metals common in mining effluent to rainbow trout cell lines and to the ciliated protozoan, Tetrahymena thermophila // Toxicology in vitro . 2005 . Vol . 19, N 3 . P. 399-410 .

15. European Drinking Water Directive on Water Intended for Human Consumption 98/83/EC of

03 .11.1998. Publication date 05 .12 .1998 // Official Journal L . 330, 5 . 12 . P. 32-54 .

16. Fokin S. I., Chivilev S. M. Brackish water Paramecium species and Paramecium polycaryum. Mor-phometric analysis and some biological peculiarities // Acta Protozool . 1999 . Vol. 38 . P. 105-117.

17. Fokin S. I., Stoeck T., Schmidt H. J. Rediscovery of Paramecium nephridiatum Gelei, 1925 and its characteristics // J. Eukaryot. Microbiol . 1999а. Vol . 46 . P. 416-426.

18. Fokin S. I., Stoeck T., Schmidt H. J . Paramecium duboscqui 1933 . Distribution, ecology and taxonomy // Europ . J. Protistol. 1999б . Vol. 35 . P. 161-167 .

19. Smurov A. O., Fokin S. I. Use of salinity tolerance data for investigation of phylogeny of Paramecium (Ciliophora, Peniculina) // Protistology. 2001. Vol . 2, N 2 . P. 130-138 .

20. Sonneborn T. M. Methods in Paramecium research // Methods in cell Physiology / Ed . by D . M. Prescott. Vol. 4 . New York, 1970. P. 241-339 .