CC BY
32
DOI: 10.1425 8/jcpim.20200483 92
УДК 579.66
БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ УТИЛИЗАЦИИ ПОСЛЕЭКСТРАКЦИОННОЙ БИОМАССЫ И КЛЕТОЧНОЙ КУЛЬТУРЫ ORTHILIA SECUNDA (L.) HOUSE БАЗИДИАЛЬНЫМИ ГРИБАМИ
© Ж.А. Кох1'2', Ю.А. Литовка1'3, Р.Х. Эназаров1, П.В. Маколова1, Ю.С. Шимова3, И.С. Почекутов3,
И.Н. Павлов13
1 Институт леса им. В.Н. Сукачева СО РАН, ФИЦ КНЦ СО РАН,
Академгородок, 50/28, Красноярск, 660036 (Россия),
e-mail: jannetta-83@mail. ru
2 Красноярский государственный аграрный университет, пр. Мира, 90,
Красноярск, 660049 (Россия)
3 Сибирский государственный университет науки и технологий имени
академика М. Ф. Решетнёва, пр. Мира, 82, Красноярск, 660049 (Россия)
Исследована возможность биоконверсии после экстракционного остатка лекарственного растения Orthilia secunda (исходное сырье и каллусная ткань после извлечения биологически активных веществ) быстрорастущими штаммами базидиальных грибов Tv2-16K Trametes versicolor и Ре-17Т Pleurotus eryngii для получения мицелиально-расти-тельного продукта (со сниженным содержанием трудноперевариваемой фракции и обогащенного белком) и полноценных плодовых тел. Грибные культуры колонизируют растительные отходы с радиальной скоростью роста 2.0-2.3 мм/сут и ростовым коэффициентом 65-77 ед. Фенолоксидазная активность составляет 0.7-1.2 ед/г- с в зависимости от типа после экстракционного остатка. В субстратах после биодеструкции доля трудногидролизуемых полисахаридов, легкогидроли-зуемых полисахаридов и лигнина в среднем в 1.6 раз ниже по сравнению с исходными значениями. Содержание белка и экстрактивных веществ существенно выше, особенно на после экстракционном остатке каллусной ткани O. secunda под действием штамма Tv2-16K T. versicolor, соответственно 12.8 и 24.3% от массы а.с.с. Получены плодовые тела штамма Ре-17Т P.eryngii на различных композициях растительных субстратов. Максимальное плодообразование отмечено на четырехкомпонентных субстратах, содержащих два типа после экстракционных остатков O.secunda, пшеничные отруби, опилки березы или осины. Средняя масса плодовых тел с одного блока составила 230-236 г; биологическая эффективность процесса - 46-47.2%.
Ключевые слова: биодеструкция, базидиомицеты, твердофазное культивирование, после экстракционный остаток, каллусная ткань, Orthilia secunda, Pleurotus eryngii, Trametes versicolor.
Лекарственные растения имеют достаточно обширный ареал и синтезируют разнообразный спектр биологически активных веществ, что обусловливает их широкое применение в медицине, пищевых технологиях и парфюмерно-косметической промышленности. Растительное сырье подвергается технологической обработке на специализированных предприятиях, характерной особенностью которых является накопление значительного количества отходов лекарственных растений после извлечения биологически ценных суб-
Введение
Кох Жанна Александровна - кандидат технических наук, научный сотрудник, доцент кафедры технологии, оборудования бродильных и пищевых производств, тел. (391)247-26-66, e-mail: jannetta-83@mail.ru Литовка Юлия Александровна - доктор биологических наук, старший научный сотрудник, профессор кафедры химической технологии древесины и биотехнологии, тел. (391) 227-36-54, e-mail: litovkajul@rambler.ru
станций, поскольку производственный процесс не является замкнутым. В настоящее время проблема утилизации отходов растительного происхождения для предприятий, специализирующихся на производстве фармацевтического сырья, является весьма актуальной. Одним из наиболее распространенных подходов является заделывание растительных
Окончание на С. 360.
* Автор, с которым следует вести переписку.
остатков в почву. Помимо этого, отходы можно использовать в технологиях силосования, кормопроизводства и компостирования, а также при получении биогумуса и белково-углеводных продуктов на основе грибной биомассы [1, 2].
Вегетативная часть Orthilia secunda L. (Ericaceae) широко используется в качестве сырья для производства лечебных и профилактических препаратов, например, в качестве диуретиков и антисептиков при воспалении органов мочевыводящей системы. Растение имеет циркумбореальное распространение и встречается на большей части Северного полушария, преимущественно, в хвойных лесах и на скальных выступах с повышенным уровнем влажности. Вегетативная часть O. secunda богата дубильными веществами, флаво-ноидами, камедью, лимонной и винной кислотами, арбутином и сапонинами. После сбора и первичной переработки сырье (стебли, листья и цветы) подвергают экстрагированию для получения целевых продуктов. После экстракционный остаток растительного сырья целесообразно повторно вовлечь в производственный цикл, сделав его практически безотходным для производства белково-углеводных кормовых продуктов и/или плодовых тел базидиомицетов методами твердофазной ферментации [2].
Высшие базидиальные ксилотрофные грибы привлекают внимание исследователей не только как агенты процессов биодеструкции растительных отходов, но и как продуценты уникального комплекса биологически активных веществ. Мицелий и плодовые тела многих представителей базидиомицетов характеризуются высокой питательной ценностью, отличными вкусовыми и разнообразными лекарственными свойствами. В состав грибной биомассы входят витамины и гликозиды, используемые для производства противоопухолевых, гепатопротекторных, иммуномодулирующих и антиоксидантных препаратов. Способность ксилотрофных базидиомицетов эффективно разрушать лигноцеллюлозные субстраты (отходы агро- и лесопромышленного комплексов, пищевой и фармацевтической промышленности) открывает широкие возможности использования их биотехнологического потенциала для переработки и утилизация разнообразных рас-тигельных отходов с получением целевых продуктов в виде биомассы грибов или их метаболитов [3-7].
Дереворазрушающие грибы рода Pleurotus (Вешенка) - это одни из наиболее исследуемых и культивируемых на различных растительных субстратах базидиомицетов, в том числе виды Pleurotus ostreatus (Jacq.) P. Kumm, P. citrinopileatus Singer, P. cornucopiae (Paulet) Rolland, P. djamor (Rumph. ex Fr.) Boedijn, P. eryngii (DC.) Quél., P. pulmonarius (Fr.) Quél., P. sapidus Quél. и др. Лидирует по объемам мирового промышленного производства вид P. ostreatus (второе место после Agaricus bisporus (J.E. Lange) Imbach), тем не менее в странах Юго-Восточной Азии и Ближнего Востока предпочитают употреблять в пищу P. eryngii, что обусловливается его высокой питательной ценностью и продуктивностью, вкусовыми качествами и эстетичным видом плодовых тел [8-11]. В ряде работ представлены результаты твердофазного культивирования P. eryngii на различных комбинациях растительных субстратов с последующей оценкой биологической эффективности процесса. Показана возможность эффективного плодообразования P. eryngii на пяти вариантах растительных субстратов, основой которых является вегетативная часть Caragana korshinskii с добавлением опилок, жмыха сахарного тростника, хлопковой шелухи, кукурузы, пшеничных отрубей, маиса и соевой муки. Первая волна плодоношения наступала на 68-72 сутки; масса плодовых тел с одного субстратного Эназаров Рустам Хатиджанович - младший научный блока варьировала от 203 до 247 г; биологическая сотрудник лаб°рат°рии ген°мных исследований эффективность культивирования составила 59-
71%. Максимальная продуктивность зафиксиро-
и биотехнологии, e-mail: rusya955@mail.ru Маколова Полина Васильевна - младший научный сотрудник лаборатории лесных культур, микологии вана для комбинации субстратов с наибольшим со-
и фитопатологии, e-mail: polinochka-makolova@rambler.ru держанием порошка караганы [12]. В исследовании [13] отмечается возможность использования смеси тополевых опилок и семян хлопчатника в ка-
Шимова Юлия Сергеевна - кандидат химических наук, доцент кафедры химической технологии древесины и биотехнологии, тел. (391) 227-36-54,
e-mail: shimovays@sibsau.ru честве субстрата для получения плодовых тел P.
ПочекутовИван Сергеевич - кандидат технических наук eryngii. При использовании девяти растительных доцент кафедры химической технологии древесины
и биотехнологии, тел. (391) 227-36-54, комп°нент°в би°л°гическая эффективность мрьи-
e-mail: pochekutovic@sibsau.ru ровала от 67 до 236% в зависимости от их комбина-
Павлов Игорь Николаевич - доктор биологических наук, ции. Наибольшее количество биомассы P. eryngii
на килограмм субстрата отмечено при сочетании
профессор, заведующий лабораторией лесных культур, микологии и фитопатологии, заместитель директора по научной работе, заведующий кафедрой химической рисовых отрубей и мякоти сахарной свёклы технологии древесины и биотехнологии, (2363 г-кг-1) [14].
тел. (391) 227-36-54, e-mail: forester24@mail.ru
Оценка возможности применения малоценных агропромышленных отходов (хлопковая шелуха, кукурузные початки, пшеничная и рисовая солома, жмых сахарного тростника, опилки) в виде моносубстратов для твердофазного культивирования показала, что зарастание субстратных блоков с момента инокуляции составило 32-39 сут; масса плодовых тел P. eryngii с одного блока - 99-200 г; биологическая эффективность культивирования - 36-72%. Максимальные показатели продуктивности зафиксированы при ферментации хлопковой шелухи, наименьшие - для опилок [15]. Результаты еще одного исследования свидетельствуют о более высокой продуктивности P. eryngii на хлопковой шелухе: масса плодовых тел с субстратного блока составила 280-290 г, биологическая эффективность процесса - 72% [16]. При культивировании P. eryngii на таких моносубстратах, как дубовые опилки, бобовая солома и подсолнечная шелуха, время зарастания субстратных блоков варьировало от 20 до 24 сут; образование примордиев зафиксировано на 31-43 сут; первая волна плодоношения наступала спустя 38-50 сут с момента инокуляции. Биомасса плодовых тел с одного субстратного блока составила 140-234 г; биологическая эффективность процесса - 47-73% [17]. Отмечается возможность использования в качестве моносубстратов стеблей кенафа и рами, для которых были получены следующие показатели: биомасса на 300 г влажного субстрата - 157 и 153 г; биологическая эффективность процесса - 52 и 51% соответственно [18], а также оливы и виноградных выжимок [19, 20]. Таким образом, несмотря на то, что традиционным субстратом культивирования грибов рода Pleurotus являются пшеничная или рисовая солома, плодообразование с высокой биологической эффективностью возможно на разнообразных лигноцеллюлозных субстратах, включая после экстракционные остатки растительного сырья [21-24].
Еще одним перспективным базидиомицетом для биодеструкции растительных отходов является Trametes versicolor (L.) Lloyd (трутовик разноцветный), характеризующийся повсеместным распространением, высокими ростовыми показателями, синтезом комплекса высокоактивных внеклеточных лигнолитических и целлюлолитических ферментов (применяются в виноделии, пивоварении, целлюлозно-бумажной и текстильной промышленности, биоремедиации) и биологически активных веществ, в том числе с антиопухолевой активностью [25, 26]. Многочисленными исследованиями показана возможность глубинного и твердофазного культивирования T. versicolor на средах с растительными отходами для получения внеклеточных ферментов и биологически активных веществ. Выявлена максимальная активность лакказы (1587 едл-1) на среде, содержащей барду и воду в соотношении 1 : 7, а также 1% хлопковой шелухи [27]. Показана возможность культивирования T. versicolor на пшеничных отрубях с добавлением кукурузной / рисовой соломы, кукурузных кочерыжек, опилок и жома для высокой продуктивности лакказы. Максимальные показатели отмечены на субстратах с добавлением кукурузной соломы (32.1 едг-1) и жома (22.3 едг-1) [28]. При использовании отходов чайного производства для твердофазного культивирования T. versicolor выход фермента составил 25.7 ед г-1 [29]. Высокие показатели активности лакказы отмечены на таких субстратах как листья партениума позднеплодного и сахарного тростника, а также на соломе пшеницы и риса - 185, 165, 150 и 145 едг-1 соответственно [30]. Показана возможность использования кукурузного силоса в качестве сырья для получения лакказы и Mn-пероксидазы при жидкофазном культивировании T. versicolor, а также для производства кофейной, ванильной, гидроксибензойной и сиреневой кислоты при твердофазной ферментации [31]. Установлено, что тип растительного субстрата оказывает влияние на содержание эргостерола в плодовых телах T. versicolor: на зерновом субстрате выход эргостерола оказался в 6-12 раз выше по сравнению с пшеничной соломой, рисовой шелухой и жмыхом сахарного тростника [32].
Таким образом, базидиальные грибы P. eryngii и T. versicolor широко используются в процессах биоконверсии отработанных лигноцеллюлозных растительных субстратов с получением целевых продуктов в виде грибной биомассы и биологически активных продуктов метаболизма. Широкий спектр используемых растительных отходов и высокие экономические показатели твердофазной ферментации обусловлены неприхотливостью этих представителей базидиомицетов, высокими ростовыми параметрами и синтезом широкого спектра ферментов, осуществляющих эффективную деполимеризацию трудногидролизуемых полисахаридов и делигнификацию. Настоящее исследование было проведено с целью определения целесообразности использования после экстракционного остатка растительного сырья и каллусной ткани O.secunda в качестве субстрата для твердофазного культивирования, в том числе для получения плодовых тел съедобного гриба P. eryngii и растительно-мицелиальных продуктов на основе лекарственного гриба T.versicolor.
Экспериментальная часть
Объектом исследования служили штаммы макроскопических базидиальных грибов Tv2-16K Trametes versicolor (L.) Lloyd и Ре-17Т Pleurotus eryngii (DC.) Quél., изолированные в чистую культуру из соответствующих базидиом методом накопления во влажной камере с последующим пересевом на агаризованные среды [33]. В качестве ростовых субстратов для культивирования базидиомицетов использовали после экстракционные остатки исходного сырья и каллусной ткани Orthilia secunda (L.) House. после извлечения биологически активных веществ. Культуральные особенности штаммов исследовали на мальт-экстракт агаре (МЭА) (рис. 1А) и растительных субстратах (рис. 1В) при 24±1 °С; микроструктуры - методами светополь-ной микроскопии (Nikon Eclipse Ci, Япония) в микрокамерах [33]. Видовую идентификацию подтверждали секвенированием участков генетических маркеров ITS и TEF-1alpha с использованием оборудования ЦКП «Геномика» (ИХБФМ СО РАН, Новосибирск). Индексы общей ферментативной активности грибов определяли экспресс-методом на агаризованных питательных средах: среда Чапека-Докс c 1% Na-КМЦ с использованием красителя конго-красный (индекс целлюлазной активности) [34] и мальт-экстракт агар с 0.5% танина (индекс оксидазной активности) (рис. 1Б) [33].
Твердофазное культивирование осуществляли на двух типах растительных субстратов (рис. 1Г, Д), которые являются отходом после извлечения биологически активных веществ одноступенчатой экстракцией 40% раствором этилового спирта: 1. после экстракционный остаток исходного сырья O. secunda с размером частиц 2.5 мм; 2. после экстракционный остаток каллусной ткани O. secunda в виде шрота с размером частиц около 1 мм. Растительное сырье высушивали до воздушно-сухого состояния, увлажняли водопроводной водой и стерилизовали при 115 °С в течение 30 мин. Условия твердофазного культивирования: влажность субстратов 70%; температура 25±1 °С; длительность культивирования 20 сут. Определяли ростовые параметры грибов (радиальная скорость роста, СР; ростовой коэффициент, РК) [35], активность фенолоксидазы в системе пирокатехин-р-фенилендиамин [36], а также химический состав растительных субстратов до и после биодеструкции: содержание протеина - методом Бузуна [37]; экстрактивных веществ - гравиметрическим методом [38]; суммарного количества полисахаридов - методом Вознесенского [38]; лигниновых веществ -модифицированным методом Комарова [39]; зольных веществ - спектрофотометрическим методом [40].
Рис. 1. Морфология колоний базидиальных грибов Trametes versicolor (А, В), Pleurotus eryngii (Б) на ростовых субстратах; внешний вид Orthilia secunda in situ (Г); каллусная ткань Orthilia secunda in vitro (Д)
Для исследования возможности плодобразования in vitro штамма Ре-17Т P. eryngii провели его твердофазное культивирование на нескольких комбинациях растительных субстратов, включающих послеэкстракци-онные остатки O. secunda (исходное сырье и каллусная ткань), березовые и осиновые опилки, пихтовую щепу и пшеничные отруби (20% во всех вариантах). Влажность субстрата после стерилизации составила 68%; рН 5.9. Для поддержания буферности и во избежание слипания растительных компонентов в субстрат добавляли 1%-е растворы Ca(OH)2 и СаСОз. В качестве инокулюма использовали зерновой мицелий штамма Ре-17Т в количестве 5% от объема растительного субстрата. Культивирование осуществляли в стерильных пластиковых контейнерах объемом 1 л при 25±1 °С в течение 30-35 сут без освещения до максимального зарастания субстрата мицелием. Далее для стимулирования плодообразования температуру понижали до 16 °С; освещенность составила 300-400 люкс с 12-часовым фотопериодом; влажность воздуха 95%. Основные оцениваемые показатели - длительность зарастания субстрата (сут); начало массовой закладки зачатков плодовых тел (при-мордиев) (сут); сырая масса плодовых тел (г) и биологическая эффективность (%) - показатель, характеризующий отношение сырой биомассы плодовых тел грибов к сухой массе субстрата [33].
Обсуждение результатов
одним из ограничений широкого использования базидиальных грибов в биотехнологических производствах являются их невысокие скорости роста и необходимость строгого соблюдения правил асептики вследствие стремительной контаминации культуры-продуцента быстрорастущей конкурентной микрофлорой. Используемые в данном исследовании штаммы характеризуются относительно высокими для базидио-мицетов ростовыми параметрами in vitro на агаризованных средах (табл. 1), используемых для получения инокулята и последующего твердофазного культивирования.
Максимальные ростовые показатели отмечены у штамма Tv2-16K T. versicolor на мальт-экстракт агаре - радиальная скорость 6.1 мм / сут, ростовой коэффициент 83. Индекс оксидазной активности составил 6.1; целлюлазной активности - 3.3. Оба исследуемых штаммах на МЭА с добавлением танина и без него характеризуются как растущие со средней скоростью, синтезируют комплекс целлюлолитических и лигно-литических ферментов, при этом индекс оксидазной активности существенно выше.
В ходе твердофазного культивирования грибов на после экстракционных остатках исходного сырья и каллусной ткани O. secunda отмечена активная колонизация обоих субстратов. Радиальная скорость роста была ниже, чем на МЭА (2.0-2.3 мм/сут), однако ростовые коэффициенты, характеризующие степень адаптации культуры к субстрату, были сопоставима (65-77) - штаммы на растительных субстратах проявили себя, как растущие со средней скоростью, что является хорошим показателем для базидиомицетов. На рисунке 2 представлена динамика прироста колонии T. versicolor и P. eryngii на двух типах растительных субстратов; длительность колонизации составила 16-18 сут; период наиболее активного роста отмечен с 11 -е по 18-е сут. Ростовые показатели и активность фенолоксидазы каждого штамма на двух субстратах отличались не существенно (табл. 2). Максимальные ростовые показатели и ферментативная активность отмечены для штамма Tv2-16K T. versicolor, радиальная скорость роста составила 2.3 и 2.2 мм/сут, ростовой коэффициент - 77 и 75, активность фенолоксидазы - 1.2 и 1.0 ед/гс соответственно при культивировании на после экстракционном остатке исходного сырья и каллусной ткани.
Таблица 1. Ростовые параметры и индексы ферментативной активности штаммов Tv2-16K Trametes versicolor и Ре-17Т Pleurotus eryngii на агаризованных питательных средах
Вид Мальт-экстракт агар Мальт-экстракт агар с 0.5% танина Среда Чапека-Докс c 1% Na-КМЦ
Ростовые параметры Индекс оксидазной активности Ростовые параметры Индекс целлюлазной активности
Trametes 6.1±0.31 5.7±0.22 6.1±0.12 2.9±0.13 3.3±0.08
versicolor 83 67 46
Pleurotus eryngii 4.0±0.17 3.5±0.31 5.5±0.19 2. 1 ±0. 11 2.9±0.01
71 57 41
*скорость роста (мм/сут); **ростовой коэффициент.
Рис. 2. Динамика радиального роста колоний Trametes versicolor и Pleurotus eryngii на после экстракционных остатках исходного сырья (ИС) и каллусной ткани (КТ) Orthilia secunda
Таблица 2. Ростовые параметры и активность фенолоксидазы штаммов Tv2-16K Trametes versicolor и Ре-17Т Pleurotus eryngii на послеэкстракционных отходах Orthilia secunda
Ростовые показатели Активность фенолоксидазы, ед/гс
Вид послеэкстракцион- послеэкстракцион- послеэкстракцион- послеэкстракцион-
ныи остаток исход- ный остаток каллу- ный остаток исход- ный остаток каллу-
ного сырья сной ткани ного сырья сной ткани
Trametes versicolor 2.3±0.08 2.2±0.12 1.2±0.12 1.0±0.09
77 75
Pleurotus eryngii 2.0±0.18 2. 1 ±0. 12 0.9±0.07 0.7±0.08
65 67
*скорость роста (мм / сут); **ростовой коэффициент.
Таким образом, с точки зрения ростовых характеристик грибов и активности фермента, участвующего в процессе делигнификации, исследуемые отходы лекарственного сырья после извлечения биологически активных веществ являются пригодными для твердофазного культивирования T. versicolor (рис. 3А, Б) и P. eryngii. Для оценки трофических предпочтений и степени биодеструкции субстратов базидиальными грибами дополнительно исследовали биохимический состав после экстракционных остатков до и после культивирования. Данные представлены в таблице 3.
Установлено, что послеэкстракционный остаток исходного сырья и каллусной ткани O. secunda имеет близкий химический состав, за исключением экстрактивных веществ, содержание которых в 1.8 раза выше в исходном сырье по сравнению с каллусной тканью. В значительном количестве присутствуют полисахариды (61.3 и 61.8% соответственно) и лигниновые вещества (27.3 и 30.7%), которые являются благоприятным ростовым субстратом для исследуемых дереворазрушающих грибов.
При культивировании базидиомицетов на после экстракционном остатке исходного сырья O. secunda общая направленность биохимических изменений субстрата была схожей, однако более глубокие превращения отмечены под действием штамма Tv2-16K T. versicolor. Содержание ТГП, ЛГП и лигниновых веществ в среднем уменьшилось в 1.3; 1.4 и 1.7 раз соответственно. В субстрате, биодеструктированном разноцветным трутовиком, отмечено существенное увеличение белка и экстрактивных веществ - в 9.6 и 3.3 раза соответственно. Аналогичные изменения химического состава происходили на после экстракционном остатке каллусной ткани O. secunda; максимальной активностью также характеризуется штамм Tv2-16K T. versicolor. Содержание ТГП, ЛГП и лигнина уменьшилось по сравнению с исходным субстратом в 1.5; 1.8 и 1.4 раза соответственно; содержание белка и экстрактивных веществ увеличилось еще более значительно - в 14.2 и 5.2 раза по сравнению с субстратом до биодеструкции.
Для исследования возможности получения полноценных базидиом королевской вешенки (эринги) осуществили твердофазное культивирование штамма Ре-17Т (рис. 3Г-Е) на нескольких комбинациях растительных субстратов с обязательным добавлением двух типов после экстракционных отходов O. secunda и пшеничных отрубей, а также более крупных и твердых растительных компонентов (опилки березы и осины, щепа пихты). Установлено, что средняя длительность зарастания субстрата мицелием варьировала от 29 до 35 сут; массовая закладка примордиев происходила на 35-42 сут инкубации в зависимости от субстратной формулы (табл. 4). Максимальная продуктивность плодообразования отмечена на четырехкомпонентных субстратах с добавлением опилок березы или осины в количестве 20%, что по-видимому, обеспечило большую пористость субстрата и оптимальный газообмен. Средняя масса плодовых тел с одного блока составила соответственно 230 и 236 г; биологическая эффективность - 46 и 47.2%.
Рис. 3. Колонизация после экстракционных остатков Orthilia secunda базидиальными грибами А, Б - твердофазное культивирование штамма Tv2-16K Trametes versicolor; В - высушенный мицелиально-растительный продукт; Г, Д - формирование примордиев и Е - базидиом штаммом Ре-17Т Pleurotus eryngii
Таблица 3. Химический состав после экстракционных остатков Orthilia secunda до и после твердофазного культивирования базидиальных грибов
Остаток исходного сырья Остаток каллусной ткани
Показатель, % от а.с.с. до ферментации после ферментации до ферментации после ферментации
Pleurotus eryngii Trametes versicolor Pleurotus eryngii Trametes versicolor
Трудногидролизуемые полисахариды, ТГП 39.7±0.06 34.5±0.08 30.5±0.21 42.4±0.08 31.8±0.07 28.3±0.04
Легкогидролизуемые полисахариды, ЛГП 21.6±0.35 17.2±0.05 15.2±0.08 19.4±0.24 13.8±0.08 10.8±0.32
Лигниновые вещества 27.3±0.21 18.6±0.21 16.6±0.05 30.7±0.20 25.1±0.34 21.4±0.25
Экстрактивные вещества 8.3±0.04 21.1 ±0. 10 27.2±0.15 4.7±0.09 18.2±0.02 24.3±0.06
Зольные вещества 2.3±0.12 2.9±0.09 2.8±0.15 1.9±0.15 2.3±0.10 2.4±0.12
Белок 0.8±0.10 3.7±0.02 7.7±0.09 0.9±0.08 8.8±0.05 12.8±0.25
Таблица 4. Показатели плодообразования штамма Ре-17Т Pleurotus eryngii на композициях растительных субстратов с использованием после экстракционных остатков Orthilia secunda
Субстратная формула Длительность зарастания, сут Массовая закладка при-мордиев, сут. Масса плодовых тел с одного субстратного блока, г Биологическая эффективность, %
ИС : КТ : ПО = 50 : 30 : 20 32 39 215 43.0
ИС : КТ : БО : ПО = 30 : 20 : 30 : 20 29 35 230 46.0
ИС : КТ : ОО : ПО = 30 : 20 : 30 : 20 30 35 236 47.2
ИС : КТ : БО : ПЩ : ПО = 35 42 194 38.8
30 : 10 : 20 : 20 : 20
Примечание: ИС - после экстракционный остаток исходного сырья O. secunda, КТ - после экстракционный остаток каллусной ткани O. secunda; БО - березовые опилки; ОО - осиновые опилки; ПЩ - пихтовая щепа.
Таким образом, показана возможность использования быстрорастущих штаммов базидиальных грибов и после экстракционных остатков лекарственного растения O. secunda по двум направлениям: 1. для получения мицелиально-растительного продукта (рис. 3В) со сниженным содержанием труднопереваривае-мой фракции (полисахариды и лигнин) и обогащенного белковыми соединениями на основе штамма Tv2-16К T.versicolor; 2. получение плодовых тел вешенки эринги (рис. 3 Г-Д) на многокомпонентных субстратах с биологической эффективностью процесса от 39 до 47 % на основе штамма Ре-17Т P. eryngii.
Заключение
На примере быстрорастущих штаммов базидиальных грибов Tv2-16K Trametes versicolor и Ре-17Т Pleurotus eryngii показана возможность утилизации после экстракционного остатка лекарственного растения Orthilia secunda (исходное сырье и каллусная ткань) с получением мицелиально-растительного продукта (со сниженным содержанием трудноперевариваемой фракции и обогащенного белком) и полноценных плодовых тел. Ростовые коэффициенты штаммов на растительных субстратах составили 65-77 ед. при радиальной скорости роста 2.0-2.3 мм/сут, что характеризует их, как растущие со средней скоростью; активность фермента фенолоксидаза варьировала в пределах от 0.7 до 1.2 ед/гс.
Показана общая направленность биохимических изменений после экстракционного остатка исходного сырья и каллусной ткани O. secunda под действием ферментов базидиальных грибов (снижение доли полисахаридов и лигнина; увеличение содержания белка и экстрактивных веществ). Более глубокие превращения отмечены под действием штамма Tv2-16K T. versicolor: в биодеструктированных субстратах содержание ТГП, ЛГП и лигниновых веществ уменьшилось в 1.3-1.5; 1.4-1.8 и 1.4-1.7 раз соответственно; содержание белка и экстрактивных веществ увеличилось в 9.6-14.2 и 3.3-5.2 раза в зависимости от типа растительного субстрата.
Получены плодовые тела съедобного гриба P.eryngii на композициях растительных субстратов с обязательным использованием двух типов после экстракционных остатков O. secunda и пшеничных отрубей. Максимальное плодообразование отмечено на четырехкомпонентных субстратах с добавлением опилок березы или осины в количестве 20%: средняя масса плодовых тел с одного блока составила соответственно 230 и 236 г; биологическая эффективность - 46 и 47.2%.
Список литературы
1. Барштейн В.Ю., Круподерова Т.А., Гармаш С.Н., Поспелов С.В., Поспелова А. Д., Нагорная С.В. Биоконверсия отходов агропромышленного комплекса. Новосибирск, 2016. 86 с.
2. Ботоева Е.А., Ломбоева С.С., Бураева Л.Б., Чукаев С.А. Химическое и фармакологическое исследование орти-лии однобокой Orthilia secunda (L.) House // Сибирский медицинский журнал. 2003. №1. С. 69-71.
3. Aguito-Aguayo I., Walton J., Viñas I., Tiwari B.K. Ultrasound assisted extraction of polysaccharides from mushroom by-products // LWT-Food Science and Technology. 2017. Vol. 77. Pp. 92-99. DOI: 10.1016/j.lwt.2016.11.043.
4. Atila F., Owaid M.N., Shariati M.A. The nutritional and medical benefits of Agaricus bisporus: A review // Journal of Microbiology, Biotechnology and Food Sciences. 2017. Vol. 7. N3. Pp. 281-286. DOI: 10.15414/jmbfs.2017/18.7.3.281-286.
5. Ghahremani-Majd H., Dashti F. Chemical composition and antioxidant properties of cultivated button mushrooms (Agaricus bisporus) // Horticulture Environment and Biotechnology. 2015. Vol. 56. N3. Pp. 376-382. DOI: 10.1007/s13580-015-0124-z.
6. Береговая Т.В., Билай В.Т., Вассер С.П. и др. Макромицеты: лекарственные свойства и биологические особенности. Киев, 2012. 285 с.
7. Вассер С.П., Бойко С.М., Вонг К.Х. и др. Макромицеты: лекарственные свойства и биологические особенности. Киев, 2016. Т. 2. 261 с.
8. Mandeel Q.A., Al-Laith A.A., Mohamed S.A. Cultivation of oyster mushrooms (Pleurotus spp.) on various lignocellu-losic wastes // World Journal of Microbiology and Biotechnology. 2005. Vol. 21. N4. Pp. 601-607. DOI: 10.1007/s11274-004-3494-4.
9. Garcha H.S, Khanna P.K, Soni G.L. Nutritional importance of mushrooms // Mushroom biology and mushroom products. Hong Kong, 1993.
10. Pedra M., Carnelossi G., Silva P., Yaguiu M.L., Lira G., Gonjalves B., Marino R. Chemical and sensorial analysis of Pleurotus ostreatus cultivated on coconut (Cocos nucífera Linn.) husk supplemented with wheat and/or rice bran // Archives of the Biological Institute. 2009. Vol. 76. Pp. 91-98.
11. Silva S., Martins S., Karmali A., Rosa E. Production, purification and characterization of polysaccharides from Pleurotus ostreatus with antitumour activity // Journal of the Science of Food and Agriculture. 2012. Vol. 92. N9. Pp. 18261832. DOI 10.1002/jsfa.5560.
12. Zou Y., Du F., Zhang H., Hu Q. Evaluation of Korshinsk Peashrub (Caragana korshinskii Kom.) as a Substrate for the Cultivation of Pleurotus eryngii // Waste and Biomass Valorization. 2019. Vol. 10. Pp. 2879-2875. DOI: 10.1007/s12649-018-0301-2.
13. Funda A. Determining the Effects of Container Types on Yield and Fruitbody Features of Pleurotus eryngii Strains // International Journal of Crop Science and Technology. 2017. Vol. 3. N1. Pp. 7-14.
14. Jeznabadi E.K., Jafarpour M., Eghbalsaied S., Pessarakli M. Effects of Various Substrates and Supplements on King Oyster (Pleurotus eryngii) // Compost Science & Utilization. 2016. Vol. 25. N1. Pp. 1-10. DOI: 10.1080/1065657X.2016.1238787.
15. Sardar H., Ali M.A., Anjum M.A., Nawaz F., Hussain S., Naz S., Karimi S.M. Agro-industrial residues influence mineral elements accumulation and nutritional composition of king oyster mushroom (Pleurotus eryngii) // Scientia Horticulture. 2017. Vol. 225. Pp. 327-334. DOI: 10.1016/j.scienta.2017.07.010.
16. Waseem I., Jahangir M.M., Ayyub C.M., Khan N.A., Ghufrana S., Khatana M.A. Optimization of king oyster mushroom (Pleurotus eryngii) production against cotton waste and fenugreek straw // Pakistan Journal of Phytopathology. 2018. Vol. 30. N2. Pp. 149-154. DOI: 10.33866/phytopathol.030.02.0435.
17. Funda A. Evaluation of Suitability of Various Agro-Wastes for Productivity of Pleurotus djamor, Pleurotus citrino-pileatus and Pleurotus eryngii Mushrooms // Journal of Experimental Agriculture International. 2017. Vol. 17. N5. Pp. 1-11. DOI: 10.9734/JEAI/2017/36346.
18. Xie C., Yan L., Gong W., Zhu Z., Tan S., Chen D., Hu Z., Peng, Y. Effects of Different Substrates on Lignocellulosic Enzyme Expression, Enzyme Activity, Substrate Utilization and Biological Efficiency of Pleurotus Eryngii // Cellular Physiology and Biochemistry. 2016. Vol. 34. N9. Pp. 1479-1494. DOI: 10.1159/000447851.
19. Sakellari A., Karavoltsos S., Tagkouli D., Rizou C., Sinanoglou V.J., Zoumpoulakis P., Koutrotsios G., Zervakis I.G., Kalogeropoulos N. Trace Elements in Pleurotus Ostreatus, P. Eryngii, and P. Nebrodensis Mushrooms Cultivated on Various Agricultural By-Products // Analytical Letters. 2019. Pp. 1-18. DOI: 10.1080/00032719.2019.1594865.
20. Avni S., Ezove N., Hanani H., Yadid I., Karpovsky M., Hayby H., Gover O., Hadar Y., Schwartz B., Danay O. Olive Mill Waste Enhances -Glucan Content in the Edible Mushroom Pleurotus eryngii // International Journal of Molecular Sciences. 2017. Vol. 18. N7. Pp. 1-11.
21. Maity K.K., Patra S., Dey B., Bhunia S.K., Mandal S., Das D., Majumdar D.K., Maiti S., Maiti T.K., Islam S.S. A heteropolysaccharide from aqueous extract of an edible mushroom, Pleurotus ostreatus cultivar: structural and biological studies // Carbohydrate Research. 2011. Pp. 366-372.
22. Рязанова Т.В., Чупрова Н.А., Литовка Ю.А. Биоконверсия вегетативной части топинамбура микро- и макроскопическими грибами // Системы. Методы. Технологии. Братск, 2016. С. 147-151.
23. Павлов И.Н., Литовка Ю.А., Мулява В.В., Сафронова И.Е., Кулаков С.С., Пашенова Н.В., Мулява В.Е. Биоконверсия отходов лесопереработки ксилотрофным базидиомицетом Pleurotus eryngii (DC.) QUéL // АгроЭко-Инфо. Красноярск, 2017. С. 26.
24. Bonatti M., Karnopp P., Soares H.M., Furlan S.A. Studies of Pleurotus ostreatus and Pleurotus sajor-caju mushrooms composition cultivated in banana straw // Health and Environment Journal. 2003. Pp. 31-35.
25. Бабицкая В.Г. Ферментативная деградация лигнина, содержащегося в растительных субстратах, мицелиаль-ными грибами // Прикладная биохимия и микробиология. 1994. С. 827-835.
26. Planinic M., Zelic B., Cubel I., Bucic-Kojic A., Tisma M. Corn forage biological pretreatment by Trametes versicolor in a tray bioreactor // Waste Management & Research. Kuala Lumpur, 2016. Pp. 802-809.
27. Pinheiro V.E., Michelin M., Vici A.C., de Almeida P.Z., Teixeira de Moraes Polizeli M.L. Trametes versicolor laccase production using agricultural wastes: a comparative study in Erlenmeyer fasks, bioreactor and tray // Bioprocess and Biosystems Engineering. 2019. Pp. 1-8. DOI: 10.1007/S00449-019-02245-Z.
28. Zeng S., Zhao J., Xia L. Simultaneous production of laccase and degradation of bisphenol A with Trametes versicolor cultivated on agricultural wastes // Bioprocess and Biosystems Engineering. 2017. Vol. 40. N8. Pp. 1237-1245. DOI: 10.1007/S00449-017-1783-1.
29. Xu L., Sun K., Wang F., Zhao L., Hu J., Ma H., Ding Z. Laccase production by Trametes versicolor in solid-state fermentation using tea residues as substrate and its application in dye decolorization // Journal of Environmental Management. 2020. Vol. 270. Pp. 1-8. DOI: 10.1016/j.jenvman.2020.110904.
30. Singh J., Kumar P., Saharan V., Kapoor R.K. Simultaneous laccase production and transformation of bisphenol-A and triclosan using Trametes versicolor // 3 Biotech. 2019. Vol. 9(4). 129. DOI: 10.1007/s13205-019-1648-1.
31. Bucic-Kojic A., Selo G., Zelic B., Planinic M., Tisma M. Recovery of Phenolic Acid and Enzyme Production from Corn Silage Biologically Treated by Trametes versicolor // Applied Biochemistry and Biotechnology. 2016. Vol. 181. N3. Pp. 1-13. DOI 10.1007/s12010-016-2261-y.
32. Jones M.P., Lawrie A.C., Huynh T.T., Morrison P.D., Mautner A., Bismarck A., Sabu J. Agricultural by-product suitability for the production of chitinous composites and nanofibers utilizing Trametes versicolor and Polyporus brumalis mycelial growth // Process Biochemistry. 2019. Vol. 80. N1. Pp. 95-102. DOI: 10.1016/j.procbio.2019.01.018.
33. Методы экспериментальной микологии / под ред. В.И. Билай. Киев, 1982. 550 с.
34. Bradner J.R., Gillings M., Nevalainen K.M.H. Qualitative assessment of hydrolytic activities in antarctic microfungi grown at different temperatures on solid media // World Journal of Microbiology & Biotechnology. 1999. Vol. 15. Pp. 131-132.
35. Бухало А.С. Высшие съедобные базидиомицеты в чистой культуре. Киев, 1988. 144 с.
36. Физиология растений / под ред. И.П. Ермакова. М.: Академия, 2005. 640 с.
37. Бузун Г.А., Джемухадзе К.М., Милешко Л.Ф. Определение белка в растениях с помощью амидо-черного // Физиология растений. 1982. Т. 29. №1. С. 198-203.
38. Ермаков А.Е., Арасимович В.В., Ярош Н.П. Методы биохимического исследования растений. Л., 1988. 430 c.
39. Ушанова В.М., Лебедева О.И., Девятловская А.Н. Основы научных исследований. Красноярск, 2004. 359 с.
40. Оболенская А.В., Ельницкая З.П., Леонович А.А. Лабораторные работы по химии древесины и целлюлозы. М., 1991. 320 с.
Поступила в редакцию 8 сентября 2020 г.
Принята к публикации 13 ноября 2020 г.
Для цитирования: Кох Ж.А., Литовка Ю.А., Эназаров Р.Х., Маколова П.В., Шимова Ю.С., Почекутов И.С., Павлов И.Н. Биотехнологические аспекты утилизации послеэкстракционной биомассы и клеточной культуры Orthilia secunda (L.) House базидиальными грибами // Химия растительного сырья. 2020. №4. С. 359-369. DOI: 10.14258/jcprm.2020048392.
368
®.A. Kox, ro.A. .HHTOBKA, P.X. ЭНАЗАРОВ H flP.
Koh Zh.A.12*, Litovka Yu.A.1,3, Enazarov R.Kh.1, Makolova P.V.1, Shimova Yu.S.3, Pochekutov I.S.3, Pavlov I.N.1-3 BIO-TECHNOLOGICAL ASPECTS OF BIOCONVERSION OF POST-EXTRACTION BIOMASS AND CELL CULTURE ORTHILIA SECUNDA (L.) HOUSE WITH BASIDIOMYCETES
1 Institute of Forest named after V.N. Sukachev SB RAS, FRC KSC SB RAS, Akademgorodok, 50/28, Krasnoyarsk,
660036 (Russia), e-mail: jannetta-83@mail. ru
2 Krasnoyarsk State Agrarian University, pr. Mira, 90, Krasnoyarsk, 660049 (Russia)
3 Siberian State University of Science and Technology named after academician M.F. Reshetneva, pr. Mira, 82,
Krasnoyarsk, 660049 (Russia)
The possibility of bioconversion after the extraction residue of the medicinal plant Orthilia secunda (initial plant biomass and callus after extraction of biologically active substances) by fast growing strains of basidiomycetes Tv2-16K Trametes versicolor and Pe-17T Pleurotus eryngii was studied. The main target products are: a mycelial-plant product with a reduced content of the indigestible fraction and enriched in protein and full-fledged fruit bodies. Fungi colonize plant waste with a radial growth rate of 2.0-2.3 mm / day and a growth rate of 65-77 units. Phenol oxidase activity is 0.7-1.2 units/gs, depending on the type after the extraction residue. In substrates after biodegradation, the proportion of difficult hydrolysable polysaccharides, easily hydrolysable polysaccharides, and lignin is on average 1.6 times lower than in the original substrate. The content of protein and extractive substances is significantly higher, especially after the extraction residue of O. secunda callus under the influence of the T. versicolor strain Tv2-16K: 12.8 and 24.3%, respectively, of the mass of dry substrate. Fruit bodies ofP. eryngii strain Pe-17T were obtained on various compositions of plant substrates. The maximum fruit formation was noted on four-component substrates containing two types after extraction residues of O. secunda, wheat bran, birch or aspen sawdust: the average weight of fruit bodies from one block was 230-236 g; biological efficiency - 46-47.2%.
Keywords: biodegradation, basidiomycetes, post-extraction residue, callus tissue, solid-phase cultivation, Orthilia secunda, Pleurotus eryngii, Trametes versicolor.
References
1. Barshteyn V.Yu., Krupoderova T.A., Garmash S.N., Pospelov S.V., Pospelova A.D., Nagornaya S.V. Biokonversiya otkhodovagropromyshlennogokompleksa. [Bioconversion of agro-industrial waste]. Novosibirsk, 2016, 86 p. (in Russ.).
2. Botoyeva Ye.A., Lomboyeva S.S., Burayeva L.B., Chukayev S.A. Sibirskiy meditsinskiy zhurnal, 2003, no. 1, pp. 69-71. (in Russ.).
3. Aguilo-Aguayo I., Walton J., Viñas I., Tiwari B.K. LWT-FoodScience and Technology, 2017, vol. 77, pp. 92-99. DOI: 10.1016/j.lwt.2016.11.043.
4. Atila F., Owaid M.N., Shariati M.A. Journal of Microbiology, Biotechnology and Food Sciences, 2017, vol. 7, no. 3, pp. 281-286. DOI: 10.15414/jmbfs.2017/18.7.3.281-286.
5. Ghahremani-Majd H., Dashti F. Horticulture Environment and Biotechnology, 2015, vol. 56, no. 3, pp. 376-382. DOI: 10.1007/s13580-015-0124-z.
6. Beregovaya T.V., Bilay V.T., Vasser S.P. i dr. Makromitsety: lekarstvennyye svoystva i biologicheskiye osobennosti. [Macromycetes: medicinal properties and biological characteristics]. Kiev, 2012, 285 p. (in Russ.).
7. Vasser S.P., Boyko S.M., Vong K.Kh. i dr. Makromitsety: lekarstvennyye svoystva i biologicheskiye osobennosti. [Macromycetes: medicinal properties and biological characteristics]. Kiev, 2016, vol. 2, 261 p. (in Russ.).
8. Mandeel Q.A., Al-Laith A.A., Mohamed S.A. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2005, vol. 21, no. 4, pp. 601-607. DOI: 10.1007/s11274-004-3494-4.
9. Garcha H.S, Khanna P.K, Soni G.L. Mushroom biology and mushroom products, Hong Kong, 1993.
10. Pedra M., Carnelossi G., Silva P., Yaguiu M.L., Lira G., Gonçalves B., Marino R. Archives of the Biological Institute, 2009, vol. 76, pp. 91-98.
11. Silva S., Martins S., Karmali A., Rosa E. Journal ofthe Science ofFood and Agriculture, 2012, vol. 92, no. 9, pp. 18261832. DOI 10.1002/jsfa.5560.
12. Zou Y., Du F., Zhang H., Hu Q. Waste and Biomass Valorization, 2019, vol. 10, pp. 2879-2875. DOI: 10.1007/s12649-018-0301-2.
13. Funda A. International Journal of Crop Science and Technology, 2017, vol. 3, no. 1, pp. 7-14.
14. Jeznabadi E.K., Jafarpour M., Eghbalsaied S., Pessarakli M. Compost Science & Utilization, 2016, vol. 25, no. 1, pp. 110. DOI: 10.1080/1065657X.2016.1238787.
15. Sardar H., Ali M.A., Anjum M.A., Nawaz F., Hussain S., Naz S., Karimi S.M. ScientiaHorticulturae, 2017, vol. 225, pp. 327-334. DOI: 10.1016/j.scienta.2017.07.010.
16. Waseem I., Jahangir M.M., Ayyub C.M., Khan N.A., Ghufrana S., Khatana M.A. Pakistan Journal of Phytopathology, 2018, vol. 30, no. 2, pp. 149-154. DOI: 10.33866/phytopathol.030.02.0435.
17. Funda A. Journal of Experimental Agriculture International, 2017, vol. 17, no. 5, pp. 1-11. DOI: 10. 9734/JEAI/2017/36346.
18. Xie C., Yan L., Gong W., Zhu Z., Tan S., Chen D., Hu Z., Peng, Y. Cellular Physiology and Biochemistry, 2016, vol. 34, no. 9, pp. 1479-1494. DOI: 10.1159/000447851.
19. Sakellari A., Karavoltsos S., Tagkouli D., Rizou C., Sinanoglou V.J., Zoumpoulakis P., Koutrotsios G., Zervakis I.G., Kalogeropoulos N. Analytical Letters, 2019, pp. 1-18. DOI: 10.1080/00032719.2019.1594865.
* Corresponding author.
BHOTEXHOnoraHECKHE AŒEKTbl yTHnH3AqHH nQCnE3KCTPAKqHOHHOH EHOMACCbl.
369
20. Avni S., Ezove N., Hanani H., Yadid I., Karpovsky M., Hayby H., Gover O., Hadar Y., Schwartz B., Danay O. International Journal of Molecular Sciences, 2017, vol. 18, no. 7, pp. 1-11.
21. Maity K.K., Patra S., Dey B., Bhunia S.K., Mandai S., Das D., Majumdar D.K., Maiti S., Maiti T.K., Islam S.S. Carbohydrate Research, 2011, pp. 366-372.
22. Ryazanova T.V., Chuprova N.A., Litovka Yu.A. Sistemy. Metody. Tekhnologii. [Systems. Methods. Technology]. Bratsk, 2016, pp. 147-151. (in Russ.).
23. Pavlov I.N., Litovka Yu.A., Mulyava V.V., Safronova I.Ye., Kulakov S.S., Pashenova N.V., Mulyava V.Ye. Agro-EkoInfo. [Agro-EcoInfo]. Krasnoyarsk, 2017, p. 26. (in Russ.).
24. Bonatti M., Karnopp P., Soares H.M., Furlan S.A. Health and Environment Journal, 2003, pp. 31-35.
25. Babitskaya V.G. Prikladnaya biokhimiya i mikrobiologiya, 1994, pp. 827-835. (in Russ.).
26. Planinic M., Zelic B., Cubel I., Bucic-Kojic A., Tisma M. Waste Management & Research, Kuala Lumpur, 2016, pp. 802-809.
27. Pinheiro V.E., Michelin M., Vici A.C., de Almeida P.Z., Teixeira de Moraes Polizeli M.L. Bioprocess and Biosystems Engineering, 2019, pp. 1-8. DOI: 10.1007/S00449-019-02245-Z.
28. Zeng S., Zhao J., Xia L. Bioprocess and Biosystems Engineering, 2017, vol. 40, no. 8, pp. 1237-1245. DOI: 10.1007/S00449-017-1783-1.
29. Xu L., Sun K., Wang F., Zhao L., Hu J., Ma H., Ding Z. Journal of Environmental Management, 2020, vol. 270, pp. 1-8. DOI: 10.1016/j.jenvman.2020.110904.
30. Singh J., Kumar P., Saharan V., Kapoor R.K. 3 Biotech., 2019, vol. 9(4), 129. DOI: 10.1007/s13205-019-1648-1.
31. Bucic-Kojic A., Selo G., Zelic B., Planinic M., Tisma M. Applied Biochemistry and Biotechnology, 2016, vol. 181, no. 3, pp. 1-13. DOI 10.1007/s12010-016-2261-y.
32. Jones M.P., Lawrie A.C., Huynh T.T., Morrison P.D., Mautner A., Bismarck A., Sabu J. Process Biochemistry, 2019, vol. 80, no. 1, pp. 95-102. DOI: 10.1016/j.procbio.2019.01.018.
33. Metody eksperimental'noy mikologii [Methods of experimental mycology], ed. V.I. Bilay. Kiev, 1982, 550 p. (in Russ.).
34. Bradner J.R., Gillings M., Nevalainen K.M.H. World Journal ofMicrobiology & Biotechnology, 1999, vol. 15, pp. 131132.
35. Bukhalo A.S. Vysshiye s"yedobnyye bazidiomitsety v chistoy kul'ture. [Higher edible Basidiomycetes in pure culture]. Kiev, 1988, 144 p. (in Russ.).
36. Fiziologiya rasteniy [Plant Physiology], ed. I.P. Yermakov. Moscow, 2005, 640 p. (in Russ.).
37. Buzun G.A., Dzhemukhadze K.M., Mileshko L.F. Fiziologiya rasteniy, 1982, vol. 29, no. 1, pp. 198-203. (in Russ.).
38. Yermakov A.Ye., Arasimovich V.V., Yarosh N.P. Metody biokhimicheskogo issledovaniya rasteniy. [Biochemical research methods of plants]. Leningrad, 1988, 430 p. (in Russ.).
39. Ushanova V.M., Lebedeva O.I., Devyatlovskaya A.N. Osnovy nauchnykh issledovaniy. [Fundamentals of Scientific Research]. Krasnoyarsk, 2004, 359 p. (in Russ.).
40. Obolenskaya A.V., Yel'nitskaya Z.P., Leonovich A.A. Laboratornyye rabotypo khimii drevesiny i tsellyulozy. [Laboratory work on the chemistry of wood and cellulose]. Moscow, 1991, 320 p. (in Russ.).
Received September 8, 2020 Accepted November 13, 2020
For citing: Koh Zh.A., Litovka Yu.A., Enazarov R.Kh., Makolova P.V., Shimova Yu.S., Pochekutov I.S., Pavlov I.N.
Khimiya Rastitel'nogo Syr'ya, 2020, no. 4, pp. 359-369. (in Russ.). DOI: 10.14258/jcprm.2020048392.
