CC BY
141
УНИКАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ XXI ВЕКА
БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ УТИЛИЗАЦИИ ОТХОДОВ ПТИЦЕПЕРЕРАБАТЫВАЮЩИХ ПРЕДПРИЯТИЙ
Пискаева Анастасия Игоревна Кемеровский технологический институт пищевой промышленности (университет), г. Кемерово
E-mail: a_piskaeva@mail.ru
Аннотация. Куриные перья, образующиеся в больших количествах при выращивании и убое птицы, представляют опасность для окружающей среды из-за наличия в их составе сложнодеградируемого структурного белка кератина и наличия большого количества микробиологических патогенов. В настоящее время основным методом утилизации перьевых отходов является производство перьевой муки с острого пара под давлением. Подобные технологии требуютвысоких затрат энергии. Значительные издержки, возникающие при таком способе гидротермальной деградации отходов, способствуют поиску альтернативных возможностей утилизации отходов птицеводства. В данной работе описываются биотехнологические аспекты утилизации пухо-перьерых отходов с применением консорциума микроорганизмов и получением конечного продукта - органоминеральных удобрений. Эффективность данного метода протестирована агрохимическими и микробиологическими анализами. Результаты исследования подтверждают возможность экологического использования продуктов утилизации.
Ключевые слова: пухо-перьевые отходы, биодеградация пера, куриное перо, кератин, кертинсодержащие отходы, кератинолитические бактерии, микроорганизмы, утилизация пера, органоминеральные удобрения, микробные кератиназы, консорциум микроорганизмов.
Птицеводство как источник пухо-перьевых отходов
Птицеводство является одной из крупнейших и наиболее динамично развивающихся агропромышленных отраслей в мире [1-5]. Мировое производство мяса птицы в 2012 году составило более 100 миллионов тонн. В
УНИКАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ XXI ВЕКА
результате коммерческой переработки мяса птицы вырабатывается большое количество органических побочных продуктов. По оценкам, несъедобные отходы, образующиеся в птицебойнях, составляют около 89% всех побочных продуктов переработки птицы.
Годовой объем производства мяса птицы в Европейском союзепревысил 13 миллионов тонн за предыдущий год, а средний показательсоставил около 23 кг на душу населения в год [6]. В течение последних 20 лет, птицеводство заняло более 10% объема мясного рынка. Это связано с увеличением спроса на мясо птицы и яйца [1, 4-6]. Глобальный обзор сектора птицеводства показано в таблице 1.
Таблица 1
Глобальный обзор сектора птицеводства [6]
Страна Производство (тыс. тонн) Потребление (кг на душу населения)
2002 2006 2010 2014 2002 2006 2010 2014
Россия 1.99 2.55 2.90 3.08 19.8* 20.7* 21.3* 22.5*
Франция 1.76 1.75 1.86 1.85 24.5 24.7 25.2 25.5
Германия 1.40 1.62 1.68 1.68 18.3 18.7 19.1 18.5
Польша 1.17 1.31 1.34 1.58 24.6 26.3 27.4 27.6
Испания 1.17 1.28 1.28 1.25 30.5 30.2 30.5 30.0
ОК 1.46 1.57 1.56 1.61 26.0 28.6 28.5 28.7
Бразилия 1.5* 12.8 * 13.4 * 13.3* 42.1* 48.1* 49.7* 48.5*
Китай 16.0 17.5 17.7 18.0 8.80** 9.10** 9.40** 9.80**
Япония 1.37 1.42 1.38 - 15.2** 16.4** 16.6** 16.9**
США 19.9* 19.5* 19.7* 19.7* 52.0* 50.8* 50.9* 49.6*
Мировое производство 92.5 99.2 102 104 - - - -
*Только курица и мясо индейки, ** Только куриное мясо
УНИКАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ XXI ВЕКА
Однако одной из основных проблем, с которыми сталкивается птицеводческая промышленность, является крупномасштабное накопление отходов [1, 4, 7, 8]. Основным видом отходов, образующихся в птицеводстве, является кератинсодержащее сырье - перья [9, 10]. Кератин является основным компонентом перьев и представляет собой фибриллярный высокоустойчивый к механической и химической обработке из-за большого количества дисульфидных связей белок [11].
Нативный кератин устойчив к действию протеолитических ферментов, таких как, например, пепсин, трипсин и папаин.
Продолжительность процесса биодеградации перьев в окружающей среде составляет от двух до трех лет, что является серьезной экологической проблемой [9, 10, 12]. Кроме того, ограниченное число утилизирующих компаний, приводит к низкой конкурентоспособности на рынке и отсутствии альтернативных решений для снижения количества побочных продуктов животного происхождения для производителей мяса птицы, а, следовательно, способствует постоянству ценна услуги утилизации (в среднем 50000 руб. за тонну) [13].
Таким образом, высокая устойчивость к деградации и разнообразие патогенной микрофлоры еще более усложняет проблему утилизации перьевых отходов. В связи с перечисленными выше факторами и возможностью микробиологической угрозы, перьевые отходы должны утилизироваться очень быстро.
В настоящее время основным методом утилизации перьевых отходов является производство перьевой муки, которая в дальнейшем используется в качестве добавки для кормов животных. Перья обрабатываются в утилизационных установках с использованием острого пара под давлением. Данный метод требует значительных финансовых затрат в связи с высоким потреблением энергии, необходимой для полной деградации кератина.
Еще один метод обработки пухо-перьевых отходов - химический-щелочной гидролиз. Это традиционно применяемая на многих азиатских птицефабриках технология утилизации приводит к разрушению аминокислот, белка, изменение качества конечных продуктов, а также требует сравнительно больших энергетических и материальных затрат [14, 15], а производство сопровождается выбросами огромных количеств углекислого газа.
Отсутствие простых и экономически привлекательных методов утилизации отходов перьевых отходов приводит к поиску новых высокоэффективных технологий, которые способны обеспечить полезное использование конечных продуктов утилизации.
Еженедельно в мире обрабатывается более 400 миллионов кур, что приводит к накоплению 50 тыс. тонн перьевых отходов в день. По данным 2014 года штрафы за складирование перьевых отходов птицефабриками только в
УНИКАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ XXI ВЕКА
России составили 5,6 млн $.
Современным и перспективным в практическом отношении является биотехнологический способ переработки таких отходов, а именно использование культур микроорганизмов, способных перерабатывать кератинсодержащие отходы за счет продуцируемых кератиназ.
Данная работа представляет идею утилизации пухо-перьерых отходов с применением консорциума микроорганизмов и получением конечного продукта-органоминеральных удобрений.
Основу технологии утилизации кератина составляет штамм бактерий рода Bacillu SAFR-032, ранее выделенный и проанализированный по морфологическим, биохимическим и культуральным характеристикам.
Филогенетический и 16S РНК анализы были проведены для идентификации штамма на уровне вида. В 2013 году штамм депонирован в ГосНИИГенетика.
Применение бактериальных изолятов для биодеградации пухо-перьевых отходов
Перо - богатый источник ß-кератина, составляющего 91% белка пера. Наличие кератина делает перо недоступным для большинства ферментов таких как трипсин, пепсин, папаин и т.д., таким образом замедляя процесс его утилизации в природе.
Кератиназы являются единственной группой ферментов, обладающих способностью атаковать и полностью разлагать эти сложные белки. Биотехнологические способы, заключающиеся в использовании микроорганизмов и, продуцируемых ими, ферментов могут быть применены для деградации структурных белков пера в качестве альтернативы способам, применяемым в настоящее время.
Исследования в этой области ведутся большим количеством научно-исследовательских центров на региональных и мировых уровнях по всему миру, однако результаты исследований до сих пор не масштабированы до стадии промышленного производства.
На сегодняшний день известно и зарегистрировано несколько родов бактериальных штаммов, способных разлагать кератин. Бактерии растут быстрее, чем многие виды кератинолитических грибов и, следовательно, имеют преимущество в промышленном применении. Бактериальные изоляты уступают грибным лишь в легкости колонизации гифами.
Бактериальные штаммы, как известно, способствуют деградации кератина путем продуцирования в неклеточных кератиназ. К активным продуцентам относятся штаммы родов Bacillus: включают в себя B. subtilis и B. licheniformis
8
УНИКАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ XXI ВЕКА
[16],а также B. pumillus хотя и другие бактерии, в том числе грамположительны tLysobacter, Nesterenkonia, Kocuria и Microbacterium и грамотрицательные Vibrio, Xanthomonas, Stenotrophomonas, Chryseobacterium, Fervidobacterium, Thermoanaerobacter также обладают способностью к деградации кератина [17].
Ряд других исследований по изучению продуцирования кератинабактериальными штаммами представлен авторами в [18-22]. Исследователи из индийского университета Mata Gujri Mahila Mahavidyalaya Sapna и Yamini [23] исследовали потенциальную деградацию кератина бактериальными штаммами, выделенными из почвенных образцов. Четыре изолята, полученные из перьевых отходов, были восстановлены на чашках Петри с молочным агаром. Три были идентифицированы как грамотрицательные бактерии (Burkholderia, Chryseobacterium, Pseudomonas) и один идентифицирован как грамположительный штамм (Microbacterium) [24].
Кератинолитические ферменты относятся к протеазам, известным как кератиназы (EC 3.4.21 / 24 / 99.11). Они могут быть получены из грибов, актиномицетов и бактерий [25]. Грибковые кератиназы получают путем секреции, а низкая стоимость в некоторых случаях делает их наиболее предпочтительными, чем бактериальные ферменты, даже при том, что грибы растут медленнее.
Микробные кератиназы относятся к внеклеточным ферментам. Авторами [26, 27, 28] сообщается о наличии внутриклеточных кератиназ.
Согласно результатам исследований, проводимых последние 15 лет, учеными из разных установлено, что в деградации кератина потенциально могут принимать участие несколько групп ферментов (таблица 2).
Таблица 2
Ферменты, участвующие в деградации кератина
Фермент Количество Деградируемыесвязи Ссылка
Кератиназы 11 m-NH Ramnani et al., 2005
Дисульфидныередуктазы 13694 S-S Bockle et al., 1995
Сериновыепротеазы 10239 m-NH Hedstrom, 2002
Щелочныепротеазы 125 m-NH Godfrey et al., 1996
Металлопротеазы 158 m-NH Hooper, 1994
Субтилизин 220 m-NH Ottesen, 1970
Треодоксин 553 S-S Mustacich, 2000
УНИКАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ XXI ВЕКА
Сравнительно недавно была установлена единая гипотеза деградации кератина под действием микробных кератиназ - это двухстадийный процесс именуемый кератин олизисом.
Первым этапом является сульфолизис, то есть разрушение дисульфидных связей, второй этап - протеолиз.
Первый этап связан с действием дисульфидных редуктаз. Ферменты этой группы способны уменьшать количество дисульфидных связей в молекуле кератина, что делает его доступным для действия ферментов второй группы -сериновых протеаз, а именно кератиназ (рисунок 1).
Обе группы продуцируются бактериями только в присутствии субстрата -кератина.
Дисульфидныередуктазы Кератиназы
К-8-8-К * К-8И * Пептиды/Аминокислоты
Природный кератин Уменьшение связей 8-8 Продукты реакции
Рис. 1 Механизм деградации кератина
Стадии биодеградации куриного пера под действием бактериальных кератиназ, полученных с помощью штамма B. PumШus, показаны на рисунке 2.
Большинство микроорганизмов, могут использовать кератин в качестве единственного источника углерода и азота. Среди протеаз, кератиназы и другие протеолитические ферменты способны разрушать жёсткие структурные белки находят применение в разработке экономически эффективных конечных продуктов утилизации в виде кормов (кормовых добавок) и удобрений. Диапазон их применения также может быть расширен до моющих средств, утилизации прионных белков, использования в кожевенной промышленности, в добычи природного газа, а также для изменения качества волокон шелка и шерсти [16].
УНИКАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ XXI ВЕКА
Г ^'
'-¿'Л
¿г&ь*;-; № * Я
Кг г
а)
б)
в)
Рис. 2 Биодеградация кератина пера под действием внеклеточных кератиназ, продуцируемых штаммом B. PumШus: а) через 12 ч; б) через 24 ч; в) через 48 ч после начала инкубирования при 37°С
Продуцирование кератиназы микроорганизмами зависит от ряда факторов, таких как температура, рН, природа источников углерода и азота, аэрация, а также различные методы, в том числе направленные на оптимизацию условий культивирования и состава среды для повышения выхода фермента.
Поскольку продуцирование кератинолитических ферментов от микроорганизма к микроорганизму непостоянно, идентификация и исследования вопроса о питательных и экологических факторах, контролирующих выпуск кератиназиз микробных изолятов осуществить достаточно сложно и представляется возможным лишь в рамках исследуемого штамма.
Наличие нескольких штаммов, способных продуцировать кератиназы усложняет ситуацию выбора эффективных продуцентов.
Скрининг микробных ферментов имеет важное значение в процессе отбора. Выбранные ферменты должны быть недорогостоящими, экологически чистыми и эффективными.
Анализ состава пухо-перьерых отходов
Пухо-перьевые отходы представляют собой тонкодисперсную крошку серого цвета с размером частиц от нескольких микрометров до нескольких миллиметров [33].
Традиционный способ удаления таких отходов - сжигание. Однако, это нецелесообразно ни в экологическом, ни в экономическом смыслах.
УНИКАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ XXI ВЕКА
Поиски альтернативных технологий полезно утилизации отходов птицеводческого комплекса привели к развитию биотехнологий, т.е. использованию систем (консорциумов) эффективных микроорганизмов (ЭМ), способных в процессе своей жизнедеятельности перерабатывать органические и неорганические вещества, входящие в состав отходов в полезные конечные продукты - удобрения. Другими словами ЭМ обеспечивают быстрый процесс компостирования - биологического окисления органических субстратов, в результате которого происходит ферментативный гидролиз кератина -структурного белка пера [34].
В качественных органических удобрениях один из компонентов выступает в роли поглотителя влаги, аммиака, диоксида углерода и без компостирования слабо разлагается (пухо-перьевое сырье), а другой - содержит микрофлору и легкоразлагающиеся азотистые и безазотистые, органические соединения (помет или субстраты его трансформации) [33].
Получение биоудобрений на основе куриного пера давно привлекает внимание ученых-исследователей [34, 35]. Перьевая мука является дешевым и легко доступным источником азота (15% К) и может использоваться в качестве эффективного биоудобрения с высокими биогенными свойствами.
Использование биотехнологий в сельском хозяйстве, например, применение ростостимулирующих гидролизатов белков является перспективным направлением развития отрасли и может эффективно применяться производстве удобрений [36].
Микробная деградация пухо-перьевых отходов представляет собой альтернативу существующим технологиям производства азотных удобрений. Индолил-3-уксусная кислота (ИУК) является основным регулятором роста, который повышает доступность питательных веществ для растений, а также способствует росту корней [37].
Деградированный продукт, полученный на основе перьевых отходов, может стать богатым источником соответствующего количества триптофана, который является основой синтеза ИУК [36].
Объекты и методы исследования
Теоретические и экспериментальные исследования выполнены в соответствии с поставленными задачами на кафедре «Бионанотехнология» Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования «Кемеровский технологический институт пищевой промышленности (университет)».
Утилизация органических субстратов — это многоступенчатый процесс, в котором одна реакция последовательно идет за другой. Определение
УНИКАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ XXI ВЕКА
метаболических механизмов и активности микроорганизмов в субстратах крайне затруднено, так как продукты реакции одной стадии процесса биоконверсии представляют собой субстрат для последующей.
Строгая преемственность действия ферментов на субстрат обеспечивается благодаря высокой специфичности микробных ферментов.
Правильно подобранные штаммы и стандартизированные условия выращивания позволяют получать качественный конечный продукт биоконверсии - гумусоподобные органические удобрения.
В соответствии с составом органического вещества отходов проводился поиск ферментов, способных к их деградации.
Способ производства орано-минерального удобрения основан на применении разработанного в ходе предыдущих исследований биопрепарата [49].В состав биопрепарата входят штаммы непатогенных грамположительных бактерий, продуцирующие в процессе жизнедеятельности комплекс протелитических, липолитичсеких и целлюлолитических ферментов: Bacillus pumilus SAFR-032, Microbacterium terregensAC1180, Aeromonas sp. B5376, Arthrobacter globiformis AC1529, Streptomyces olivocinereus AC1169, Acinetobacter sp. B3905.
Культуры выращивали в колбах объемом 250 см с жидкой питательной средой МПБ (мясопептонный бульон) при температуре 37°Св течение 8-12 часов. После получения ночных культур, проверяли оптическую плотность при 280 нм с использованием спектрофотометрии.
Перед составлением консорциума и определением оптимального соотношения штаммов в биопрепарате определяли биохимические свойства каждого штамма.
При изучении биохимических свойств штаммов использовали:
Для выявления сахаролитических свойств (способность расщеплять углеводы и высокоатомные спирты) исследуемую культуру засеивали в среды Гисса, содержащие глюкозу, сахарозу, манит, дульцит, лактозу, мальтозу, глицерин. После инкубирования посевов в термостате в течение 24ч при температуре 37°С учитывали результат ферментации углеводов по изменению цвета индикатора бромтимолсинего и соответственно питательной среды. Расщепление тех или иных углеводов учитывали по кислотообразованию и обнаружению конечных газообразных продуктов расщепления. Газообразование в средах Гисса определяли по наличию пузырьков воздуха различной величины.
Протеолитическую активность культур определяли путем посева уколом в столбик застывшего желатина. Засеянные пробирки, а также пробирки с незасеянной желатиной инкубировали при температуре 37°С. После охлаждения опытных и контрольных пробирок в холодной воде учитывали результат по «текучести» столбика желатина.
УНИКАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ XXI ВЕКА
Наличие протеолитической активности исследуемого штамма свидетельствовало о выработке фермента желатиназы, под влиянием которого происходит разжижение желатина.
Степень протеолиза и глубину расщепления белка определяли по образованию конечных продуктов распада (индол, сероводород).
Каталазную активность исследуемых культур изучали путем суспендирования культуральной массы в 3%-ной перекиси водорода на предметном стекле. Кроме этого, каталазную активность тестировали непосредственно у выросших культур на МПА. Для этого на поверхность культуры на скошенном агаре наносили несколько капель 3%- ной перекиси водорода. Наличие каталазы оценивали по появлению пузырьков газа (атомарный кислород, отщепленный каталазой от перекиси водорода).
Определение выделения сероводорода проводили с использованием индикаторной бумаги, пропитанной уксуснокислым свинцом. Если бумага окрашивалась в характерный черно-бурым, делали вывод о том, что данный штамм не образует сероводород.
Определение реакции на индол: вносили 2 мл эфира в пробирки с трехсуточными культурами исследуемого штамма и наслаивание нескольких капель реактива Эрлиха (пара-диметилами нобензоальдегид 1 г; этанол 96%-ный 95 см3, хлористо-водородная концентрированная кислота 20 см). При условии отсутствия на границе МПБ и эфирного слоя ярко-красного цвета кольца, делали вывод об отрицательной реакции на индол.
Уреазную активность штаммов определяли на агаре Кристенсена с мочевиной. Критерием оценки активности уреазы служила степень окрашивания среды в малиновый цвет после 1-4 суток выращивания при температуре 37°С.
Для подтверждения наличия кератинолитической активности штаммов после лиофилизации и использовали метод с применением порошка кератина. Четыре миллиграмма порошка кератина (ШМе&а), растворенного в 1 мл 50 мМ Трис-НС1 (рН 8,0) использовали в качестве субстрата. К 250 микролитрам субстрата добавляли 500 мкл раствора фермента с 250 мкл 50 мМ буфера Трис-НС1 и инкубировали в течение 30 мин при температуре 40 °Си постоянном перемешивании со скоростью 100 оборотов в минуту на водяной бане. Реакцию останавливали с применением 1 мл 10%-ной трихлоруксусной кислоты и инкубировании при 4 °С в течение 10 мин.
Затем реакционную смесь центрифугировали при 10000^ в течение 10 мин, отбирали супернатант для измерения оптической плотности при 280 нм с использованием спектрофотометра.
Раствор тирозина (50-500 мкг мл-1) использовали в качестве стандарта. За единицу активности фермента (кератиназы) принимали количество фермента, необходимое для освобождения 1 мкг тирозина в единицу времени (минуту) в
14
УНИКАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ XXI ВЕКА
условиях эксперимента.
Раствор биопрепарата подвергали очистке и концентрированию без введения дополнительных стабилизирующих компонентов, замораживали и обезвоживали под вакуумом, после чего лиофилизировали.
В качестве основы для производства органо-минеральных удобрений использовано куриное перо. Перед процессом биодеградации под действием бактериальных ферментов исследуемый материал промывали в деионизованной воде, сушили и измельчали.
Питательную среду для активирования штаммов биопрепарата готовили составом (г/л): NaCl - 5,0; MgSO4 - 1,0; К2НРО4 - 0,5; куриное перо 10,0; рН 7,0.
Ферментацию проводили колбе Эрленмейера на 250-мл с добавлением 2% посевного материала (109 клеток / мл) при 37 °С и 120 оборотах в минуту в течение 10 дней. После ферментации ферментированный бульон центрифугировали при 10000 оборотах в минуту в течение 15 мин, и надосадочную жидкость анализировали на содержание кератинолитической активности.
После активирования штаммов повторно проверяли наличие кератиназной активности с использованием вышеописанного метода.
В результате гидролизапухо-перевых отходов получают смесь коротких пептидов и аминокислот. Следующим шагом процесса является регулирование рН до 6 с помощью оксида магния, а затем добавление мочевины и сульфата калия. Этот способ делает возможным получение жидких удобрений, которые могут быть использованы непосредственно для внесения в почву или в качестве подкормки.
При проведении микробиологических исследований приготовление питательных сред вели по ГОСТ ISO/TS 11133-1-2014 «Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных». Отбор, хранение и транспортировку проб исследуемых материалов осуществляли в соответствии с ГОСТ 26712-85 «Удобрения органические. Общие требования к методам анализа», требованиями «Инструкции по лабораторному контролю очистных сооружений на животноводческих комплексах» и «Методами анализов органических удобрений».
Эксперименты проведены в трех повторно стях, представленные значения являются результатом среднего отклонения ± стандартное.
Результаты исследования и обсуждение
Биохимические свойства штаммов, входящих в состав консорциум для разработки биопрепарата приведены в таблицах 3 и 4.
УНИКАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ XXI ВЕКА
Таблица 3
Биохимические свойства штаммов Bacilluspumilus SAFR-032, Acinetobacter sp. B3905, Aeromonas sp. B5376
Штамм Bacillus pumilus SAFR-032 Acinetobacter sp. B3905 Aeromonas sp. B5376
Ферментация углеводов:
Глюкоза + + +
Сахароза + + +
Глицерин + - +
Маннит - + +
Дульцит - - +
Лактоза + + +
Мальтоза + + +
Образование:
Каталаза - + +
Сероводород - - -
Индол - - -
Уреазная активность - - +
Гидролиз желатина + + +
Амилолитическая активность - + +
Кератиназная активность + - -
Окраска по Граму + + +
Примечание: «-» - отсутствие признака; «+» - присутствие признака; «±» -сомнительный признак.
УНИКАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ XXI ВЕКА
Таблица 4
Биохимические свойства штаммов М1сгоЬа&вгшт terregens АС1180, АнИгоЬа^ег gloЬiformis АС1529, Streptomyces оШоствгвт АС1169
Штамм Streptomyces olivocinereus АС1169 ArthroЬacter gloЬiformis АС1529 MicroЬacterium terregens АС1180
Ферментация углеводов:
Глюкоза + + +
Сахароза + - -
Глицерин - - +
Маннит + + +
Дульцит + - +
Лактоза + + +
Мальтоза + + +
Образование:
Каталаза - + +
Сероводород - - -
Индол - - -
Уреазная активность - + +
Гидролиз желатина + + +
Амилолитическая активность + - +
Кератиназная активность - - -
Окраска по Граму + + +
Примечание: «-» - отсутствие признака; «+» - присутствие признака; «±» -сомнительный признак.
УНИКАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ XXI ВЕКА
Оптимальный состав питательной среды и условия культивирования консорциума определены в ходе предыдущих исследований [50]. Максимальный прирост биомассы наблюдается при использовании мальтозы и триптона в качестве источников углерода и азота.
Оптимальная среда имеет состав, г/дм : мальтоза - 8; триптон - 8; хлорид натрия -6. В ходе исследований установлены оптимальные параметры культивирования микробного консорциума для утилизации пухо-перьевого сырья в сельскохозяйственное удобрение.
Оптимальные параметры: температурный оптимум - 38±2 °С, продолжительность культивирования - 22±1 ч, число оборотов мешалки - 90±2 об/мин, показатель pH - 7, объем кислорода - 1,132 дм /мин.
Максимальную кератинолитическую активность показал штамм Bacillus pumilus SAFR-032. Повторный анализ на кератинолитическую способность показал что выработка кератиназ зависит от периода инкубации. В эксперименте использовали различные периоды инкубации штамма Bacillus pumilus SAFR-032 (1-10 дней) при температуре 37 °С и рН 8,0. Установлено, что продуцирование кератиназ незначительно в течение первых 24 часов ферментации. После этого, кератинолитическая активность и содержание фермента возрастали (таблица 5)и достигает максимальной активности 6,95 ед/мл через 7 дней (рисунок 3), она постепенно уменьшается с увеличением продолжительности инкубации.
Максимальные значения наблюдались в экспоненциальной фазе ростаBacШus pumilus SAFR-032, что указывает на продуцирование кератиназ в качестве первичного метаболита. Концентрация биомассы также возрастала (от 11,9 log10 КОЕ/мл) через 7 дней ферментации.
Схожие результаты получены учеными Бранделли и Риффелом, которые исследовали кератинолитический штамм Chryseobacterium sp. KR6, характеризующийся максимальными значениями выработки фермента во время экспоненциальной фазы [38].
18
УНИКАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ XXI ВЕКА
Таблица 5
Кератинолитический профиль фермента, полученного с помощью Bacilluspumilus SAFR-032 при глубинной ферментации с использованием куриного пера в качестве субстрата
Продолжительность инкубации, сут 2 4 6 8
Количество фермента, ед/мл 1,71 4,09 6,52 6,02
Гидролиз кератина, % 12 40 86 93
Рис. 3 Влияние времени ферментации на выработку кератиназы и накопление биомассы Bacillus pumilus SAFR-032 при глубинной ферментации
Корреляция между выработкой фермента и температурой инкубации показана на рисунке 4. Температура инкубации 40 °С приводит к максимальной выработке фермента кератиназы (10,93 ед/ мл). Температура инкубации является важной характеристикой микроорганизма и значительно влияет на выход фермента и продолжительность ферментативной фазы синтеза [39]. Хотя
УНИКАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ XXI ВЕКА
кератинолитические бактерии зачастую демонстрируют оптимальный рост и активность при более высоких температурах, показанная температура согласуется с оптимальными значениями, описанными для кератинолитических штамма Bacillus sp. FK46 [40], Lysobacter sp. [41], и Stenotrophomonas sp. D-1 [42], которые также показали оптимальную температуру роста и производства кератиназ в диапазоне от 20 °C до 40 °C.
Во время ферментации наблюдался высокий выход кератиназы (12,09 ед/ мл) в щелочном диапазоне рН с оптимумом 8.0 (рисунок 4).
Как правило, кератиназы большинства бактерий, актиномицетов и грибов имеют оптимум рН от нейтрального до щелочного диапазона [43-45]. Тем не менее, было зарегистрировано несколько кератинолитических ферментов имеющих высокоалкалофильный оптимум рН> 12 [46, 47].
Температура ферментации, °С
pH ферментации
б)
Рис. 4 Влияние параметров: а) температураферментации; б) рН ферментации на выход кератиназы из штамма Bacilluspumilus SAFR-032 в условиях глубинной ферментации
УНИКАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ XXI ВЕКА
Влияние различных концентраций пера и хлорида натрия на продуцирование кератиназы показано на рисунках 5 и 6.
0.1 0.25 0.5 1 1.5
Концентрация пера.0 о
Рис. 5 Влияние различных концентраций пера (%) на выход кератиназы из Bacilluspumilus SAFR-0325 при глубинной ферментации
0.25 0.5 1 1.5 45
Концентрация NaCL 0 »
Рис. 6 Влияние различных концентраций NaCl (%) на выход кератиназы из Bacillus pumilus SAFR-032 при глубинной ферментации
Оптимальная концентрация перасоставляла 1%. При данной концентрации активность фермента достигает 13,81 Ед/мл через 7 дней ферментации. С увеличением концентрации пера (до 1,5-2%), выработка кератиназы снижается.
УНИКАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ XXI ВЕКА
Высокие концентрации пера могут вызвать ингибирование субстрата или подавление продуцирования [48].
Штамм Bacillus pumilus SAFR-032 способен расти в присутствии хлорида натрия (концентрация 0-2%) и вырабатывать максимальное количество кератиназы (14,10 ед/мл) в присутствии 0,5%-ной концентрации NaCl (рисунок 5). Этот результат указывает на то, что NaCl, также является важным компонентом питательной среды для продуцирования кератиназы этим при глубинной ферментации.
Заключение
Штамм Bacillus pumilus SAFR-032 производит значительное количество кератиназы в условиях глубинной ферментации. Производство является простым и легким для масштабирования; микроорганизм растет на простых питательных средах, содержащих перо в качестве источника углерода, азота. Следовательно, штамм обладает большим коммерческим потенциалом, а производство отличается не высокой стоимостью - технология позволяет утилизировать промышленные отходы (куриное перо) в полезные удобрения и защищать окружающую среду.
Таким образом, использование перьев домашней птицы в качестве субстрата для ферментации в сочетании с кератинолитическими штаммами является лучшей альтернативой для повышения качества и агрохимической ценности птицы удобрений и уменьшения загрязнения окружающей среды.
Литература:
1. Bolan, N.S. Uses and management of poultry litter / N.S. Bolan, A.A. Szogi, T. Chuasavathi, B. Seshadri, M.J. Rothrock, P. Panneerselvam // World. Poultry Sci. J. -2010. - Vol. 66. - P. 673-680.
2. Jangwattana, R. Using Azollapinnata for wastewater treatment from poultry farm / R. Jangwattana, C.B. Iwai // IJER. - 2010. - Vol. 23. - P. 1-2.
3. Bolu, S.A. Effects of treated poultry litter on potential greenhouse gas emission and field agronomic performance / S.A.Bolu, S.A. Aderibigbe, L.A. Oyelayo // Ethiop. J. Environ. Stud. Manag. - 2014. - Vol. 7. - P. 677-684.
4. FAO. Poultry meat and eggs. Agribusiness Handbook. Rome. -2010.
5. ACMF. Submission to the agricultural competitiveness taskforce. North Sydney. -2014.
6. A.V.E.C. Annual Report. Belgium. - 2004, 2008, 2012, 2013.
7. Staron, P. Utilization of waste feathers by thermal treatment / P. Staron, M. Banach,
22
УНИКАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ XXI ВЕКА
Z. Kowalski // Przem. Chem.-2012. - Vol. 91. - P. 1010- 1015.
8. Internal Data AMI Company (Poland). Mikstat. - 2013.
9. Laba, W. Biodegradation of keratinous wastes from poultry industry involving bacteria of genera Bacillus and Sarcina / W. Laba, A. Rodziewicz // Acta Sci. Pol. Biotechnol. - 2004. - Vol. 3. - P. 109-111.
10. Rodziewicz, A. Keratin waste composting with the participation of bacterial vaccine in rotating bioreactor / Rodziewicz A., Laba W., Sobolczyk J., Grzelak A., Drozd J // Inz. Ap. Chem. - 2009. - Vol. 48. - P. 95-98.
11. Marcinkowska, M. Paper with the participation of poultry feathers. Przegl / M. Marcinkowska, K. Wrzesniewska-Tosik, M. Szadkowski // Papiern. - 2009. - Vol. -65. - P. 79
12. Sobolczyk J. Ecotoxicology in environmental protection / J. Sobolczyk, A. Rodziewicz, W. Laba, K. Baranowska // PZITS: Wroclaw. - 2008. - P. 397-402.
13. Gorecki H. Utilization of poultry wastes to multicomponent fertilizers / Gorecki H., Gorecka H., Chojnacka K., Dobrzanski Z., Artmanska M., Baranska M., Bieganska S. // Przem. Chem. - 2010. - Vol. 89. - P. 360-364.
14. Riffel, A., & Brandelli, A. (2006). Brazilian Journal of Microbiology, 37, 395399.
15. Cai, C.G., Chen, J.S., Qi, J.J., Yin, Y., Zheng, X.D., et al. (2008). Journal of Zhejiang University SCIENCE B, 9(9), 713-720.
16.Matikeviciene, V. Degradation of keratin containing wastes by bacteria with keratinolytic activity/ V. Matikeviciene, D. Masiliuniene, and S. Grigiskis// Proceedings of the 7th International Scientific and Practical Conference, vol. 1, pp. 284-289, 2009.
17. Gupta, R. Microbial keratinases and their prospective applications: an overview / R. Gupta, P. Ramnani // Applied Microbiology and Biotechnology, vol. 70, no. 1, pp. 21-33, 2006.
18. Korkmaz, H. Characterization of alkaline keratinase of Bacillus licheniformisstrain HK-1 from poultry waste / H. Korkmaz, H. Hur, and S. Dincer // Annals of Microbiology, vol. 54, no. 2, pp. 201-211, 2004.
19. Hoq, M. M. Keratinolytic activity of some newly isolated Bacillus species / M. M. Hoq, K. A. Z. Siddiquee, H. Kawasaki, and T. Seki // Journal of Biological Sciences, vol. 5, no. 2, pp. 193-200, 2005.
20. Joshi, S.G. Isolation, identification and characterization of a feather degrading bacterium / S.G. Joshi, M.M. Tejashwini, N. Revati, R. Sridevi and D. Roma // International Journal of Poultry Science. - 2007. - Vol. 6. - P. 689-693.
21. Cai, C. G. Keratinase production and keratin degradation by a mutant strain of Bacillus subtilis / C.G. Cai, B.-G. Lou, and X.-D. Zheng // Journal of Zhejiang University Science B, vol. 9, no. 1, pp. 60-67, 2008.
22. Cortezi, M. Characterization of a feather degrading by Bacillus amyloliquefaciens
23
УНИКАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ XXI ВЕКА
protease: a new strain / M. Cortezi, J. Contiero, C. J. B. de Lima, R. B. Lovaglio, and R. Monti // World Journal of Agricultural Sciences, vol. 4, no. 5, pp. 648-656, 2008.
23. Sapna, R. Study of keratin degradation by some potential bacterial isolates from soil / R. Sapna and V. Yamini // Journal of Soil Science, vol. 1, no. 1, pp. 1-3, 2011.
24. Riffel, A. Keratinolytic bacteria isolated from feather waste / A. Riffel, A. Brandelli // Brazilian Journal of Microbiology, vol. 37, no. 3, pp. 395-399, 2006.
25. Korniüowicz-Kowalska, T. Biodegradation of keratin waste: theory and practical aspects / T. Kornittowicz-Kowalska and J. Bohacz // Waste Management, vol. 31, no. 8, pp. 1689-1701, 2011.
26. Ganaie, M.A. Isolation and identification of keratinophilic fungi from different soil samples in Jhansi City (India) / M.A. Ganaie, S. Sood, G. Rizvi and T.A. Khan // Plant Pathology Journal, vol. 9, no. 4, pp. 194-197, 2010.
27. Yu, R.J. Isolation and purification of an extracellular keratinase of Trichophyton mentagrophytes / R.J. Yu, S.R. Harmon and F. Blank // Journal of Bacteriology, vol. 96, no. 4, pp. 1435-1436, 1968
28. Asahi, M. Purification and characterization of major extracellular proteinases from Trichophyton rubrum / M. Asahi, R. Lindquist, K. Fukuyama, G. Apodaca, W.L. Epstein and J.H. McKerrow // Biochemical Journal, vol. 232, no. 1, pp. 139-144, 1985.
29. Проценко, Е.П. Микробиологическая характеристика компостов, полученных на основе серой лесной почвы с добавлением пухо-перьевой крошки / Е.П. Проценко, Н.А. Клеева, Н.В. Верховцева, Г. А. Осипов // Проблемы агрохимии и экологии. - 2009. - № 3. - С. 11-15.
30. Сидоренко, О.Д. Биологические технологии утилизации отходов животноводства / О. Д. Сидоренко, Е.В. Черданцев // М.: Изд-во МСХА, 2001 -74 с.
31. Третьяков, Н.П. Технология переработки продуктов птицеводства // М.: Колос, 1974. - 240 с.
32. Третьяков, Н.П. Переработкапродуктов птицеводства / Н.П. Третьяков, Б.Ф. Бессарабов // М.: Агропроиздат, 1985. - 287 с.
33. Jeong, J. H. Keratinolytic enzyme-mediated biodegradation of recalcitrant feather by a newly isolated Xanthomonas sp. P5 / J.H. Jeong, K.H. Park, D.J. Oh, D.Y. Hwang, H.S. Kim, C.Y. Lee, H.J. Son // Polym Degrad Stab. - 2010. - № 95. - P. 1969-1977.
34. Kim, J.M. Feather degrading Bacillus species from poultry waste / J.M. Kim, W.J. Lim, H.J. Suh // Process Biochem. - 2010. - № 37. - P 287-291.
35. Tiwary, E. Medium optimization for a novel 58 kDa dimeric keratinase from Bacillus licheniformis ER-15; biochemical characterization and application in feather degradation and dehairing of hides / E. Tiwary, R. Gupta // Bioresour Technol. - 2010. - № 1. - P. 6103-6110.
УНИКАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ XXI ВЕКА
36. Tsavkelova, E. Identification and functional characterization of indole-3-acetamide mediated IAA biosynthesis in plant associated Fusarium species / E. Tsavkelova, B. Oeser, L. Oren-Young, M. Israeli, Y. Sasson, B. Tudzynski, A. Sharon // Fungal Genet Biolol. - 2012. - № 49. - P. 48-57.
37. Vessey, J.K. Plant growth promoting rhizobacteria as biofertilizers // Plant Soil. -2012. - № 255. - P. 571-586.
38. Riffel, A., Lucas, F.S., Heeb, P., & Brandelli, A. (2003). Archives of Microbiology, 179, 258-265.
39. Yamamura, S., Morita, Y., Hasan, Q., Rao, S. R., Marakami, Y., Yokoyama, K., et al. (2002). Journal of Bioscience and Bioengineering, 93, 595-600.
40. Suntornsuk, W., & Suntornsuk, L. (2003). Bioresource Technology, 86, 239-243.
41. Allpress, J.D., Mountain, G., & Gowland, P.C. (2002). Letters in Applied Microbiology, 34, 337-342.
42. Williams, C.M., Richter, C.S., Mackenzier, J.M., & Shih, J.C.H. (1990). Applied and Environmental Microbiology, 56, 1509-1515.
43. Farag, A.M., & Hassan, M.A. (2004). Enzyme Microbial Technology, 34, 85-93.
44. Thys, R.C.S., Lucas, F.S., Riffel, A., Heeb, P., & Brandelli, A. (2004). Letters in Applied Microbiology, 39, 181-186.
45. Anbu, P., Gopinath, S.C.B., Hilda, A., Lakshmipriya, T., & Annadurai, G. (2005). Enzyme Microbial Technology, 36, 639-647.
46. Takami, H., Nogi, Y., & Horikoshi, K. (1999). Extremophiles, 3, 293-296.
47. Mitsuiki, S., Ichikawa, M., Oka, T., Sakai, M., Moriyama, Y., Sameshima, Y., et al. (2004). Enzyme Microbial Technology, 34, 482-489.
48. Cortezi, M., Cilli, E.M., & Contiero, J. (2008). Current trends in Biotechnology and Pharmacy, 2, 170- 177.
49. Piskaeva, A.I. Microbial poultry waste conversion into organic fertilizer A.I. Piskaeva, V.F Dolganyuk // 8th International scientific conference «European Conference on Innovations in Technical and Natural Sciences». Vienna, Austria, -2015. - P. 70-72.
50. Линник, А.И. Влияние технологических параметров культивирования на активность фермента кератиназы полученной на основе штамма / А.И. Линник, Д.В. Балыков, А.И. Пискаева, А.Ю. Просеков // Международный вестник ветеринарии. - Санкт-Петербург, 2015. - С. 3-4.
