CC BY
0Ветеринарный врач. 2024. № 3. С. 74 - 79 The Veterinarian. 2024; (3): 74 - 79
Научная статья
УДК 619.615.2/661.155.3
DOI: 10.33632/1998-698Х_2024_3_74
БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ РАЗРАБОТКИ ПРОТОТИПА АНТИБАКТЕРИАЛЬНОГО БИОПРЕПАРАТА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ НАРУЖНЫХ ОТИТОВ СОБАК И КОШЕК: УСТОЙЧИВОСТЬ БАКТЕРИОФАГОВ К ФИЗИЧЕСКИМ И ХИМИЧЕСКИМ ФАКТОРАМ СРЕДЫ
Егор Анатольевич Пустовит, egor_pustovit@mail.ru
Николай Васильевич Пименов, доктор биологических наук, pimenov-nikolai@yandex.ru Сергей Владимирович Позябин, доктор ветеринарных наук, rector@mgavm.ru
Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии - МВА имени К.И. Скрябина, Москва, Российская Федерация
Автор, ответственный за переписку: Пустовит Егор Анатольевич.
Аннотация. Наружный отит является распространенным патопроцессом у мелких домашних животных, при котором лечение может оказаться несостоятельным без применения антибактериальных средств. С целью биотехнологической разработки прототипа антибактериального средства для лечения собак и кошек с наружным отитом, обладающего высокой эффективностью, специфичностью и экологичностью по сравнению с химиотерапевтическими антибактериальными препаратами, данные исследования посвящены изучению температурной устойчивости фагов-кандидатов к актуальным зоодерматотропным видам бактерий, и возможности сохранять интактность фаговых частиц в средах с различным значением рН. Результаты исследований демонстрируют, что вирулентные бактериофаги, гомологичные наиболее часто встречаемым видам бактерий при наружных отитах мелких домашних животных - Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus schleiferi subsp. Coagulans, Escherichia coli, Streptococcus pyogenes, Streptococcus canis, Staphylococcus hyicus, Enterococcus faecalis, обладают термостабильностью, позволяющей в течение 60 минут не терять вирулентные свойства и титр в температурном диапазоне от -20 до 50°С. Концентрация всех исследованных бактериофагов сохранялась, но снижалась при хранении в течение 24 часов в кислой среде (рН = 3,6), в то время как при нейтральных и щелочных значениях (рН = 8,0) уровня кислотности титры бактериофагов сохраняются в рамках погрешности метода титрования по Грациа. Данные результаты обосновывают и подчеркивают потенциал использования биопрепаратов на основе бактериофагов в качестве антибактериального компонента в комплексной терапии животных с болезнями кожи и ее производных, в том числе при наружных отитах у собак и кошек.
Ключевые слова: Бактериофаги, альтернатива антибиотикотерапии, наружный отит, собаки, кошки, ветеринарная биотехнология
Для цитирования: Пустовит Е. А., Пименов Н. В. Позябин С. В. Биотехнологические аспекты разработки прототипа антибактериального биопрепарата для лечения наружных отитов собак и кошек: устойчивость бактериофагов к физическим и химическим факторам среды // Ветеринарный врач. 2024. № 3. С. 74 - 79. DOI: 10.33632/1998-698Х_2024_3_74
BIOTECHNOLOGICAL ASPECTS OF THE DEVELOPMENT OF A PROTOTYPE OF AN ANTIBACTERIAL BIOLOGICAL PREPARATION FOR THE TREATMENT OF EXTERNAL OTITIS OF DOGS AND CATS: RESISTANCE OF BACTERIOPHAGES TO PHYSICAL AND
CHEMICAL ENVIRONMENTAL FACTORS
Egor Anatolyevich Pustovit, egor_pustovit@mail.ru
Nikolay Vasilyevich Pimenov, doctor of biological sciences, pimenov-nikolai@yandex.ru Sergey Vladimirovich Pozyabin, doctor of veterinary sciences, rector@mgavm.ru
'Moscow state Academy of veterinary medicine and biotechnology named K. I. Skryabin, Moscow, Russian Federation
Corresponding author: Pustovit Egor Anatolyevich.
Abstract. Otitis externa is a common pathoprocess in small domestic animals, in which treatment may be untenable without the use of antibacterial drugs. In order to develop a prototype of an antibacterial agent for the treatment of dogs and cats with otitis externa, which has high efficiency, specificity and environmental advantage compared with chemotherapeutic antibacterial drugs, these studies are devoted to studying the temperature resistance of candidate phages to topical zoodermatotropic bacterial species, and the ability to maintain the integrity of phage particles in environments with different pH values. The research results demonstrate that virulent bacteriophages homologous to the most common bacterial species in the external otitis media of small domestic animals - Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus schleiferi subsp. Coagulans, Escherichia coli, Streptococcus pyogenes, Streptococcus canis, Staphylococcus hyicus, Enterococcus faecalis, have thermal stability, allowing for 60 minutes not to lose virulent properties and titer in the temperature range from -20 to 50 ° C. The concentration of all studied bacteriophages remained, but decreased when stored for 24 hours in an acidic environment (pH = 3.6), while at neutral and alkaline values (pH = 8.0) of the acidity level, the titers of bacteriophages remain within the error of the Grazia titration method. These results substantiate and emphasize the potential of using biological preparations based on bacteriophages as an antibacterial component in the complex therapy of animals with diseases of skin and its derivatives, including otitis externa in dogs and cats.
Keywords: Bacteriophages, an alternative to antibiotic therapy, otitis externa, dogs, cats, veterinary biotechnology.
Введение. Наружный отит является распространенным патопроцессом у мелких домашних животных, при котором лечение может оказаться несостоятельным без применения антибактериальных средств [5]. Ввиду повсеместного распространения антибиотикорезистентных штаммов бактерий ведется активный поиск антимикробных фармако- и биопрепаратов, альтернативных химиотерапевтическим [4]. Результатом появления более проработанных методик стандартизации и контроля биопрепаратов на основе бактериофагов, частота и область их применения значительно расширилась: помимо применения в сельском хозяйстве и промышленности, вирулентные бактериофаги используется в различных разделах гуманной и ветеринарной медицины [1, 2, 6].
С целью биотехнологической разработки прототипа антибактериального средства для лечения наружных отитов у собак и кошек, обладающего высокой эффективностью, специфичностью и экологичностью по сравнению с химиотерапевтическими антибактериальными препаратами, данные исследования посвящены изучению температурной устойчивости фагов-кандидатов к актуальным зоодерматотропным видам бактерий, и возможности сохранять интактность фаговых частиц в средах с различным значением рН.
Материалы и методы. Работа выполнена в условиях МГАВМиБ им. К. И. Скрябина.
В наших исследованиях мы сконцентрировались на наиболее часто встречаемых видах бактерий с доказанной патогенностью и этиопатогенетической значимостью при наружных отитах мелких домашних животных отмеченной множественными исследователями - Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus schleiferi subsp. Coagulans, Escherichia coli, Streptococcus pyogenes, Streptococcus canis, Staphylococcus hyicus, Enterococcus faecalis [7, 8].
Подбор бактериофагов к актуальным бактериальным участникам этиопатогенеза наружных отитов у собак и кошек, перспективных для формуляции экспериментального средства, осуществляли на основании исследования чувствительности чистых линий бактериофагов к клиническим изолятам, а также изолятам с установленной патогенностью. Проверку чувствительности фагов к целевым видам бактерий осуществляли по методу Аппельмана.
Устойчивость к воздействию высоких и низких температур подобранных бактериофагов осуществляли по экспериментальной методике. Подготовленные разведения чистых линий бактериофагов с титрами 108 БОЕ/мл в забуференном физиологическом растворе с уровнем кислотности 7,1-7,4 испытывали в диапазоне температур от -20 до +80 °С с интервалом 10 °С. Устойчивость в температурном диапазоне от 0 до +30 °С не исследовали. Образцы выдерживали в течение 60 мин. Устойчивость бактериофагов к воздействию температур устанавливали по концентрации, полученной по методу Грациа.
Устойчивость подобранных и выделенного бактериофагов в средах с различным водородным показателем (рН) проводили по методике, описанной в работе Гольдфарба и Адамса [1]. Контроль концентрации водородных ионов осуществляли потенциометрическим методом. Устойчивость устанавливали в диапазонах рН 3,6-8,0; для создания кислой среды использовали цитратный буфер, для создания щелочной среды использовали SM буфер, для создания нейтральной среды использовали фосфатный солевой буфер (для подкисления среды до показателя 7,0 использовали HCl). В подготовленные растворы вносили 0,1 мл исследуемого бактериофага и инкубировали в термостате при 37 °С в течение 24 часов. Результаты оценивали через 24 после инкубации, определяя концентрацию по методу Грациа.
Наработку фаголизатов осуществляли в жидкой питательной среде лабораторно-промышленным способом. Для это в конические колбы Эрленмейера объемом 650 мл вносили 50 мл ГРМ-бульона с рН средой 7,0-7,4. В колбы вносили подобранные бактериальные культуры с оптимальными для определенного вида бактерий условиями культивирования, инкубацию проводили в течение 3 часов в шейкере-инкубаторе ES-20/60 смеси при 37 °С при 100 об/мин., размещенном в ламинарном шкафу П-"Ламинар-С"-1,2 NEOTERIC B2 Lamsystems. После подращивания бактериальных культур, вносили специфичные бактериофаги при множественности заражения 1:20, далее инкубировали при аналогичных условиях в течение 24 часов. Полученный первичный фаголизат очищали, используя фильтры PTFE с диаметром пор 0,45 мкм производства Micropore. Стерилизующую фильтрацию осуществляли в ламинарном шкафу с использованием фильтров PTFE с диаметром пор 0,22 мкм указанного производителя.
Очистку фаголизатов осуществляли в два этапа: препаративным центрифугированием на аппарате Centrifuge 5424 (Eppendorf) в режиме 10 тыс. об/мин. в течение 30 минут; вторым этапом проводили ультрафентрифугирование на аппарате Sorvall WX Ultra в режиме 20 тыс. об/мин. на протяжении 10 минут.
Замену буферной системы экспериментального средства, а также концентрирования бактериофагов в единице объема осуществляли при помощи методов ультрафильтрации. С этой целью использовали ультрафильтрационные ячейки Amicon® Stirred cells (Merck Millipore) с фильтрами различного диаметра пор 100 кДа по собственной разработанной методике [3].
Результаты исследований и их обсуждение.
1.1. Подбор бактериофагов
В результате отбора бактериофагов к актуальным бактериальным участникам этиопатогенеза наружных отитов у собак и кошек, удалось подобрать вирулентные бактериофаги, комбинация которых обладала широтой литического спектра 80-100 % клинических целевых изолятов (представлены в Таблице 1).
Таблица 1 - Широта литического спектра подобранных бактериофагов
Бактериофаг Клетка-хозяин Кол-во изолятов Широта литического спектра, %
Pseudomonas aeruginosa PA-A1-8 Pseudomonas aeruginosa 36 50
Pseudomonas aeruginosa Б5-0-1 78
Staphylococcus aureus Д.41.3.1 №201 Staphylococcus aureus 39 54
Staphylococcus aureus St №193 67
S. schleiferi coagulans RS-1 S. schleiferi subsp. Coagulans 26 73
S. schleiferi coagulans 55-2 42
Escherichia coli №21/эко-30с-14 Escherichia coli 23 65
Escherichia coli A2 (T4-like) 52
Streptococcus pyogenes vet^-n/B-4806 Streptococcus pyogenes 21 77
Streptococcus pyogenes Лан-Паи 46
StcM Streptococcus canis №201 Streptococcus canis 16 63
StcP Streptococcus canis №204 56
Staphylococcus hyicus №195# Staphylococcus hyicus 13 62
Staphylococcus hyicus St 196# 69
Enterococcus faecalis 060 №58 Enterococcus faecalis 12 67
Enterococcus faecalis vet-0663M6-5-20 №293 58
В результате лабораторных исследований активности фагов были подобраны по два бактериофага (разных морфологических групп) к каждому виду бактерий. Таким образом, были подобраны чистые линии фагов-кандидатов для включения в состав экспериментального средства. 1.2. Исследования устойчивости бактериофагов к различным температурам Важным биологическим свойством бактериофагов является устойчивость к температурным воздействиям. Это свойство определяет тактику применения и лекарственную стабильность. Каждую чистую линию бактериофагов исследовали отдельно (не в смеси). Результаты исследований устойчивости бактериофагов представлены в Таблице 2.
Таблица 2 - Устойчивость подобранных бактериофагов к различным температурам
Бактериофаг Титр в контрольны х образцах, БОЕ/мл Температура, °С
-20 -10 0 30 40 50 60 70 80
Pseudomonas aeruginosa PA-A1-8 5,2х108 6,2х 108 5,1х 108 3,2х 108 2,1 х 108 8,6х 107 1,5х 106 3,2х 105 4,3 х 103 0
Pseudomonas aeruginosa Б5^1-1 1,2х109 9,7х 108 8,5х 108 7,6х 108 1,2х 108 8,5х 107 1,9х 106 5,3х 105 430 0
S.schleiferi coagulans RS-1 5,3х108 5,3х 108 5,3х 108 5,3х 108 5,3х 107 5,3х 107 5,3х 106 5,3х 104 5,3х 102 0
S.schleiferi coagulans 55-2 4,4х107 3,8х 107 1,1х 107 1,5х 107 2,2х 107 5,4х 106 3,2х 105 4,2х 103 250 0
Escherichia coli №21/эко-30с-14 2,9х109 3,2х 109 1,4х 109 1,2х 109 2,1 х 109 1,8х 109 3,7х 107 4,3 х 104 2,2х 103 0
Escherichia coli A2 (T4-like) 4,3х108 5,5х 108 5,0х 108 3,6х 108 3,2х 108 2,2х 108 4,4х 107 3,2х 104 1,9х 102 0
Streptococcus pyogenes vet^-n/B-4806 6,9х107 6,2х 107 4,6х 107 5,2х 107 4,2х 107 3,2х 107 1,0х 106 5,1х 104 4,5 х 102 0
Streptococcus pyogenes Лан-Паи 5,5х107 7,3х 107 1,1х 107 4,3 х 107 2,5 х 107 2,8х 107 6,5х 106 5,5х 105 4,3 х 103 0
Staphylococcus aureus Д.41.3.1_№201 8,2х109 1,6х 109 1,3х 109 1,6х 109 1,5х 109 1,9х 109 3,5х 108 2,8х 107 1,4х 103 0
Staphylococcus aureus St_№193 9,2х109 8,5х 109 6,4х 109 3,2х 109 1,7х 109 4,2х 108 4,6х 106 1,8х 103 0 0
StcM Streptococcus canis №201 8,1 х 107 2,8х 107 3,4х 107 3,9х 107 0,5 х 107 1,1х 107 8,2х 105 3,3х 104 7,5 х 102 0
StcP Streptococcus canis №204 9,7х107 6,8х 107 7,3 х 107 7,1 х 107 1,5х 107 1,3х 107 3,7х 107 2,5 х 104 1,9х 103 0
Staphylococcus hyicus_№195# 4,2х108 2,1 х 108 4,7х 108 4,6х 108 1,3х 108 4,8х 108 4,1 х 106 7,4х 105 2,5 х 103 0
Staphylococcus hyicus St_196# 4,9х108 4,9х 108 4,1 х 108 4,0х 108 2,7х 108 1,4х 108 4,4х 107 2,2х 105 9,1 х 102 0
Enterococcus faecalis 060_№58 2,4х109 5,0х 109 3,4х 108 3,2х 108 4,8х 108 2,4х 108 6,7х 107 8,5х 106 9,2х 103 0
Enterococcus faecalis vet-066.Эмб-5-20 №293 6,8х108 6,7х 108 4,9х 108 5,1х 108 2,0х 108 1,5х 108 5,3х 107 2,5 х 105 3,7х 102 0
Результаты, представленные в Таблице 2, показывают, что при температурном воздействии в течение 60 минут все подобранные бактериофаги выдерживают и сохраняются при отрицательных температурах, все бактериофаги полностью инактивируются при воздействии 80 °С. Снижение концентрации большинства штаммов бактериофагов отмечалось при воздействии 50-60 °С в течение 60 минут. Полученные результаты позволяют сделать вывод о термостабильности подобранных коллекционных и выделенного бактериофагов.
1.3. Устойчивость бактериофагов к различным уровням кислотности среды Все подобранные бактериофаги исследованы на возможность сохранять интактность фаговых частиц в средах с различным значением рН. Результаты исследований представлены в Таблице 3.
Таблица 3 - Устойчивость бактериофагов в средах с различным значением рН
Бактериофаг Титр в контрольных образцах (рН 7,0-7,4), БОЕ/мл Титр фагов, БОЕ/мл, в опытных образцах с рН:
3,6 7,0 8,0
Pseudomonas aeruginosa PA-A1-8 5,2х108 1,5х104 3,2х108 2,0х108
Pseudomonas aeruginosa Б5^1-1 1,2х109 5,4х103 3,2х109 6,5х108
S. schleiferi coagulans RS-1 5,3х108 3,9х103 6,1 х 108 3,2х108
S. schleiferi coagulans 55-2 4,4х107 1,6х105 4,4х107 5,9х107
Escherichia coli №21/эко-30с-14 2,9х109 6,1 х104 1,2х109 1,0х109
Escherichia coli A2 (T4-like) 4,3х108 7,1 х 103 5,0х108 3,3х108
Streptococcus pyogenes vet^-WB-4806 6,9х107 3,3х102 4,9х107 2,1 х 107
Streptococcus pyogenes Лан-Паи 5,5х107 7,9х102 1,5х107 1,8х106
Staphylococcus aureus Д. 41.3.1 №201 8,2х109 5,5х104 2,2х109 6,5х109
Staphylococcus aureus St №193 9,2х109 8,8х103 4,2х109 4,4х109
StcM Streptococcus canis №201 8,1 х 107 2,9х102 3,9х107 5,3х107
StcP Streptococcus canis №204 9,7х107 6,8х102 9,1 х 107 4,1 х 107
Staphylococcus hyicus №195# 4,2х108 2,1 х 103 4,3х108 3,8х108
Staphylococcus hyicus St 196# 4,9х108 4,3х103 4,1 х 108 4,8х108
Enterococcus faecalis 060 №58 2,4х109 2,8х104 2,3х108 1,8х 108
Enterococcus faecalis vet-066.Эмб-5-20 №293 6,8х108 6,2х105 5,0х108 3,3х108
Из данных Таблицы 3 можно сделать вывод, что титр всех бактериофагов снижался при хранении в течение 24 часов в кислой среде (рН = 3,6), в то время как при нейтральных и щелочных значениях (рН = 8,0) уровня кислотности титры бактериофагов сохранились в рамках погрешности метода титрования по Грациа.
Заключение. Результаты исследований демонстрируют, что вирулентные бактериофаги, гомологичные наиболее часто встречаемым видам бактерий при наружных отитах мелких домашних животных - Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus schleiferi subsp. Coagulans, Escherichia coli, Streptococcus pyogenes, Streptococcus canis, Staphylococcus hyicus, Enterococcus faecalis обладают термостабильностью, позволяющей в течение 60 минут не терять вирулентные свойства и титр в температурном диапазоне от -20 до 50°С. Концентрация всех исследованных бактериофагов сохранялась, но снижалась при хранении в течение 24 часов в кислой среде (рН = 3,6), в то время как при нейтральных и щелочных значениях (рН = 8,0) уровня кислотности титры бактериофагов сохраняются в рамках погрешности метода титрования по Грациа. Данные результаты обосновывают и подчеркивают потенциал использования биопрепаратов на основе бактериофагов в качестве антибактериального компонента в комплексной терапии животных с болезнями кожи и ее производных, в том числе при наружных отитах у собак и кошек.
Список источников
1. Адамс М. Бактериофаги. - М.: Издательство иностранной литературы, 1961. - 587 с.
2. Гилетина, Е. А., Соколов Н. А., Гаврилова К. А. Перспективы фаготерапии в медицине // Фундаментальные и прикладные аспекты микробиологии в науке и образовании: Материалы II международной научно-практической конференции, Рязань, 30 мая 2023 года. - Рязань: Рязанский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова, 2023. - С. 7-9.
3. Глазунов Е. А,, Пустовит Е.А., Пименов Н.В., Юскевич Я.А. Биотехнологические параметры концентрирования фаголизатов при конструировании прототипа антибактериального биопрепарата для лечения отитов у собак и кошек // Ветеринарный врач. - 2023. - №6. - С. 73-79.
4. Abouelkhair M. A. Staphylococcus pseudintermedius 5'-nucleotidase suppresses canine phagocytic activity // Vet Microbiology. - 2020. - №246. - P. 1087.
5. August J. R. Otitis externa. A disease of multifactorial etiology / August J. R. // Vet Clin North Am Small Anim Pract.. — 1988. — № 4. — P. 731-742.
6. Liu R., Han G., Li Z., Cun S., Hao B., Zhang J., Liu X. Bacteriophage therapy in aquaculture: current status and future challenges // Folia Microbiol. - 2022. - №4. - P. 573-590.
7. Li, Y., Fernández R., Durán I. Antimicrobial Resistance in Bacteria Isolated From Cats and Dogs From the Iberian Peninsula // Front Microbiology. - 2021. - №11. - P. 12.
8. Nakamura T., Kitana J., Fujiki, J Activity of Polyvalent Staphylococcal Bacteriophage PhiSA012 and Its Endolysin Lys-PhiSA012 Against Antibiotic-Resistant Staphylococcal Clinical Isolates From Canine Skin Infection Sites // Front Med (Lausanne). - 2020. - №7. - P. 234.
9. Santos A. J. Prevalence of microorganisms and mites in dermatological and otologic samples from dogs and cats // Brazilian journal of hygiene and animal sanity. - 2020. - №14. - P. 118-130.
References
1. Adams M. Bacteriophages. - M.: Publishing House of Foreign Literature, 1961. - 587 p.
2. Giletina, E. A., Sokolov N. A., Gavrilova K. A. Prospects of phage therapy in medicine // Fundamental and applied aspects of microbiology in science and education : Proceedings of the II International Scientific and Practical conference, Ryazan, May 30, 2023. - Ryazan: Ryazan State Medical University named after Academician I.P. Pavlov, 2023. - pp. 7-9.
3. Glazunov E. A., Pustovit E.A., Pimenov N.V., Yuskevich Ya.A. Biotechnological parameters of phagolysate concentration in the design of a prototype of an antibacterial biological product for the treatment of otitis media in dogs and cats // Veterinarian. - 2023. - No.6. - P. 73-79.
4. Abouelkhair M. A. Staphylococcus pseudintermedius 5'-nucleotidase suppresses canine phagocytic activity // Vet Microbiology. - 2020. - №246. - P. 1087.
5. August J. R. Otitis externa. A disease of multifactorial etiology / August J. R. // Vet Clin North Am Small Anim Pract. — 1988. — № 4. — P. 731-742.
6. Liu R., Han G., Li Z., Cun S., Hao B., Zhang J., Liu X. Bacteriophage therapy in aquaculture: current status and future challenges // Folia Microbiol. - 2022. - №4. - P. 573-590.
7. Li, Y., Fernández R., Durán I. Antimicrobial Resistance in Bacteria Isolated From Cats and Dogs From the Iberian Peninsula // Front Microbiology. - 2021. - №11. - P. 12.
8. Nakamura T., Kitana J., Fujiki, J Activity of Polyvalent Staphylococcal Bacteriophage PhiSA012 and Its Endolysin Lys-PhiSA012 Against Antibiotic-Resistant Staphylococcal Clinical Isolates From Canine Skin Infection Sites // Front Med (Lausanne). - 2020. - №7. - P. 234.
9. Santos A. J. Prevalence of microorganisms and mites in dermatological and otologic samples from dogs and cats // Brazilian journal of hygiene and animal sanity. - 2020. - №14. - P. 118-130.
Все авторы сделали эквивалентный вклад в подготовку публикации.
Авторы подтверждают отсутствие конфликта финансовых/нефинансовых интересов, связанных с написанием статьи.
All authors have made an equivalent contribution to the preparation of the publication. The authors declare that there is no conflict of interest.
Принята к публикации / accepted for publication 26. 02. 2024;
© Пустовит Е.А., Пименов Н.В., Позябин С.В. 2024
