CC BY
2Ветеринарный врач. 2023. № 6. С. 73 - 79 The Veterinarian. 2023; (6): 73 - 79
Научная статья
УДК 619.615.2/661.155.3
DOI: 10.33632/1998-698Х_2023_6_73
БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ КОНЦЕНТРИРОВАНИЯ ФАГОЛИЗАТОВ ПРИ КОНСТРУИРОВАНИИ ПРОТОТИПА АНТИБАКТЕРИАЛЬНОГО БИОПРЕПАРАТА ДЛЯ
ЛЕЧЕНИЯ ОТИТОВ СОБАК И КОШЕК
Егор Андреевич Глазунов1, кандидат биологических наук [email protected]
Егор Анатольевич Пустовит 2, аспирант кафедры иммунологии и биотехнологии,
Николай Васильевич Пименов2, доктор биологических наук, [email protected] Яна Андреевна Юскевич, научный сотрудник1
1 Научно-производственный центр «Микромир»,
2 Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина, Москва, Россия
Автор, ответственный за переписку: Пустовит Егор Анатольевич.
Аннотация. Наружный отит является часто встречающимся патологическим состоянием у собак и кошек, требующим антимикробной терапии. Повсеместное увеличивающееся количество бактерий, устойчивых к антибиотикам, подтверждает необходимость использования альтернативных антибактериальных средств. Изыскание и совершенствование технологичных методов выделения бактериофагов позволит повысить эффективность уже имеющихся средств, расширить возможности создания новых косметических и лекарственных препаратов, создаст плацдарм для индивидуальной терапии. Данные исследования посвящены изучению возможности применения методов ультрафильтрации для поиска и концентрирования вирусов с целью совершенствования процесса фармацевтической разработки лекарственных средств на основе бактериофагов для лечения наружных отитов у собак и кошек. В работе определяли эффективность ультрафильтации суспензий бактериофагов к Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus agalactiae, Staphylococcus aureus с целью их концентрирования с использованием ультрафильтрационных ячеек объемом 400 мл и ультрафильтрационных дисков с диаметром пор 500, 300 и 100 кДа. При рабочем давлении от 3 до 4 бар вирусы проходят через фильтрационные мембраны с диаметром пор 500 и 300 кДа, но задерживаются при 100 кДа. Результаты исследований демонстрируют возможность использования методов ультрафильтрации для повышения шанса детекции искомых бактериофагов в первичном материале. По результатам исследований установлено, что методика ультрафильтрации подходит для поиска и концентрирования бактериофагов к патогенной и условно патогенным видам бактерий собак и кошек, при этом потеря бактериофагов с использованием дисков из полисуфона с диаметром пор 100 кДа - минимальна.
Ключевые слова: Бактериофаги, ультрафильтрация, концентрирование вирусов, наружный отит, собаки, кошки, ветеринарная биотехнология.
Для цитирования: Глазунов Е. А, Пустовит Е. А., Пименов Н. В. Юскевич Я. А. Биотехнологические параметры концентрирования фаголизатов при конструировании прототипа антибактериального биопрепарата для лечения отитов собак и кошек. // Ветеринарный врач. 2023. № 6. С. 73-79 DOI: 10.33632/1998-698Х_2023_6_73
BIOTECHNOLOGICAL PARAMETERS OF PHAGOLYSATE CONCENTRATION IN THE CONSTRUCTION OF A PROTOTYPE OF AN ANTIBACTERIAL BIOLOGICAL PRODUCT FOR THE TREATMENT OF OTITIS MEDIA OF DOGS AND CATS
Egor Andreevich Glazunov1, candidate of biological sciences, [email protected]
Egor Anatolyevich Pustovit2, postgraduate student of the Department of Immunology and Biotechnology,
Nikolay Vasilyevich Pimenov2, doctor of biological sciences, [email protected] Yana Andreevna Yuskevich1, researcher
1Limited liability company Research and production center "Micromir", Moscow, Russia
2Moscow state Academy of veterinary medicine and biotechnology named K. I. Skryabin, Moscow, Russia
Corresponding author: Pustovit Egor Anatolyevich
Abstract. Otitis externa is a common pathological condition in dogs and cats that requires antimicrobial therapy. The ubiquitous increasing number of bacteria resistant to antibiotics confirms the need to use alternative antibacterial agents. The search and improvement of technological methods for the isolation of bacteriophages will increase the effectiveness of existing products, expand the possibilities of creating new cosmetic and medicinal products, create a springboard for individual therapy. These studies are devoted to the study of the possibility of using ultrafiltration methods for the search and concentration of viruses in order to improve the process of pharmaceutical development of drugs based on bacteriophages for the treatment of external otitis in dogs and cats. The effectiveness of ultrafiltration of bacteriophage suspensions to Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus agalactiae, Staphylococcus aureus was determined in order to concentrate them using ultrafiltration cells with a volume of 400 ml and ultrafiltration discs with a pore diameter of 500, 300 and 100 kDa. At an operating pressure of 3 to 4 bar, viruses pass through filtration membranes with a pore diameter of 500 and 300 kDa, but are delayed at 100 kDa. The research results demonstrate the possibility of using ultrafiltration methods to increase the chance of detecting the bacteriophages in the primary material. According to the results of the research, it was found that the ultrafiltration technique is suitable for searching and concentrating bacteriophages to pathogenic and facultative pathogenic bacterial species of dogs and cats, while the loss of bacteriophages using polysuphone discs with a pore diameter of 100 kDa is minimal.
Keywords: Bacteriophages, ultrafiltration, virus concentration, otitis externa, dogs, cats, veterinary biotechnology.
Введение. Наружный отит встречается у 5-20 % собак и 2 % кошек. [4]. Антибактериальная терапия является важной составляющей лечения животных с воспалением наружного слухового прохода. Повсеместное увеличивающееся количество бактерий, устойчивых к лекарственным средствам, подтверждает необходимость использования бактериофагов в качестве терапевтических средств в различных областях человеческой деятельности уже сейчас, а не в отдаленном будущем [1,5,7].
В последнее время фаготерапия постепенно применяется в медицине, сельском хозяйстве, пищевой промышленности и охране окружающей среды благодаря своим отличительным особенностям: высокой эффективности, специфичности и экологичности по сравнению с антибиотиками [1,6].
Изыскание и совершенствование методов эффективного выделения бактериофагов позволит повысить эффективность уже имеющихся средств, позволит расширить возможности создания новых косметических и лекарственных препаратов, создаст плацдарм для индивидуальной терапии.
Данные исследования посвящены изучению возможности применения методов ультрафильтрации для поиска и концентрирования вирусов с целью совершенствования процесса фармацевтической разработки лекарственных средств на основе бактериофагов для лечения наружных отитов у собак и кошек.
В литературных источниках существуют упоминания по использованию ультрафильтров для концентрирования фаголизатов [2].
Материалы и методы. Работа выполнена в условиях МГАВМиБ им. К. И. Скрябина и научно-производственном центре «МикроМир».
В работе использовали фаголизаты Escherichia coli 42-A1-1, Klebsiella pneumoniae К3-В1_№169, P. aeruginosa 9KZ, Streptococcus agalactiae 5/301, Staphylococcus aureus (sm) и и их клетки хозяева: Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus agalactiae, Staphylococcus aureus соответственно.
Титрование проводили по методу агаровых слоев, предложенным Грациа в 1936 г.
В исследовании использовались ультрафильтрационные ячейки модели 8400, объемом макс/мин 400 мл/10 мл, d мембраны 76 мм, «Millipore» и ультрафильтрационные диски - 500, 300, 100 кДа. предлагаемого метода выделения бактериофагов заключается в повышении вероятности индикации бактериофагов за счет их концентрирования. Концентрирование обеспечат ультрафильтрационные ячейки «Amicon® Stirred cells (Merck Millipore») с фильтрами различного диаметра пор (от 1 кДа до 500 кДа). Концентрирование искомых бактериофагов осуществляется за счет их удержания ультрафильтрационной мембранной.
Размеры фаговых частиц варьируются в широком диапазоне, что обусловлено их гетерологичностью. Чаще всего при описании бактериофагов их размеры указывают в нанометрах. Диаметры пор ультрафильтрационных дисков производства «Merck Millipore», предлагаемые для использования, указаны в килодальтонах (кДа). В этой связи предварительно проведен пересчет массы бактериофагов из молекулярной массы в кДа. Согласно исследованиям ряда авторов, посвященных изучению молекулярной массы бактериофагов, для пересчета молекулярной массы в кДа был выбран один из самых маленьких бактериофагов - фХ174 [3]. Бактериофаг фХ174 специфичен к E. coli, принадлежит к семейству Microviridae, не имеет хвостового отростка, диаметр головки 25 нм.
Зная молекулярную массу бактериофагов, переводим ее в килодальтоны.
Атомная единица массы (а.е.м.) по числовому значению приравнивается к дальтону. Исходя из этих данных переводим молярную массу фага фХ174 в килодальтоны:
молекулярная масса = сумма а.е.м. атомов молекулы;
молекулярная масса бактериофага фХ174 равна 1,6х106 [3];
молекулярная масса складывается из а.е.м., таким образом 1,6х106 = 1600000 а.е.м;
1 а.е.м. = 1 Да (дальтон);
1600000 а.е.м. = 1600000 Да;
1600000 Da = 1600 кДа.
Таким образом масса бактериофага фХ174 равна 1600 кДа.
В руководстве по использованию ультрафильтрационных ячеек «Merck Millipore» указано, что при рабочем давлении через ультрафильтры могут проходить вещества, которые в 2-3 раза больше диаметра пор. Следовательно, через фильтры с диаметром пор 500 кДа могут проникать вещества с массой 1500 кДа, через фильтры с диаметром пор 300 кДа могут проникать вещества с массой 900 кДа и т.д.,
Стоит отметить, что в случае использования дисков «Biomax polyethersulfone» при рабочем давлении, через ультрафильтры могут проходит вещества, которые в 4-5 раз больше диаметра пор.
Исходя из представленных данных для концентрирования бактериофагов при помощи «Stirred cells Millipore» целесообразно использовать фильтры с диаметром пор 500 кДа и менее.
Результаты исследований и их обсуждение.
1.1. Исследования с использованием фильтров 500 кДа
Проведена фильтрация 400 мл фаголизатов Escherichia coli 42-A1-1 и Klebsiella pneumoniae К3-В1_№»169 через мембрану 500 кДа.
После фильтрации образцы аликвот переданы для проведения титрования по методу Грациа. Передано три образца:
1. смешанные четыре флакона до фильтрации;
2. остаток внутри ячейки (искомый концентрат);
3. фильтрат
Результаты эксперимента отображены в таблице 1.
Таблица 1 - Антимикотическая активность веществ к тест-культурам
Исследуемый бактериофаг Исследуемый образец Объем, мл Титр по Грациа, БОЕ/см3
Escherichia coli 42-A1-1 исходный 400 1,2х106
концентрат 20 8х106
фильтрат 380 5,2х103
Klebsiella pneumoniae К3-В1 №169 исходный 400 2х106
концентрат 20 6х106
фильтрат 380 1х105
Анализ данных таблицы 1 показывает, что бактериофаги, специфичные к Escherichia coli и Klebsiella pneumoniae проходят через фильтрационные мембраны с диаметром пор 500 кДа при рабочем давлении в 3-4 бар.
Исходя из полученных результатов делаем вывод, что для концентрирования бактериофагов невозможно использовать фильтры с диаметром пор 500 кДа.
1.2. Исследования с использованием фильтров 300 кДа
Проведена фильтрация фаголизатов Klebsiella pneumoniae К3-В1_!№169 и Pseudomonas aeruginosa pKZ. Перед фильтрованием фаголизаты разведены в физрастворе в соотношении 1:399. Фильтрация растворов проведена через фильтры с диаметром пор 300 кДа. После фильтрации аликвоты переданы для проведения титрования по методу Грациа, образцы переданы. Передано 3 образца каждого фаголизата:
1. разведенные фаголизаты (1:399);
2. остаток внутри ячейки (искомый концентрат);
3. фильтрат
Таблица 2 - Концентрирование фаголизатов при помощи ультрафильтров 300 кДа
Исследуемый бактериофаг Исследуемый Объем, мл Титр по Грациа,
раствор БОЕ/см3
Pseudomonas aeruginosa qKZ исходный 400 1,4х106
концентрат 10 2х106
фильтрат 390 2,0х104
Klebsiella pneumoniae К3-В1 №169 исходный 400 4х107
концентрат 10 4х107
фильтрат 390 2х106
Анализ данных таблицы 2 показывает, что бактериофаги специфичные к Pseudomonas aeruginosa yKZ и Klebsiella pneumoniae К3-В1_№»169. проходят через фильтрационные мембраны с диаметром пор 300 кДа, при рабочем давлении в 3-4 бар.
1.3. Исследования с использованием фильтров 100 кДа (Pseudomonas aeruginosa
9KZ)
Проведена фильтрация фаголизата Pseudomonas aeruginosa yKZ. Перед фильтрованием фаголизат разведен в физрастворе в соотношении 5:395. Фильтрация растворов проведена через фильтры с диаметром пор 100 кДа. После фильтрации аликвоты переданы для проведения титрования по методу Грациа. Передано 4 образца фаголизата:
1. исходный (контроль, до разведения);
2. разведенные фаголизаты (5:395);
3. концентрат;
4. фильтрат
Результаты титрования представлены в таблице 3.
Таблица 3 - Концентрирование фаголизата Pseudomonas aeruginosa yKZ при помощи ультрафильтров 100 кДа
Бактериофаг Исследуемый раствор Объем, мл Титр по Грациа, БОЕ/см3
Pseudomonas aeruginosa yKZ исходный 5 2,6х108
разведенный 400 1,4х105
концентрат 15 1,1х107
фильтрат 385 0
Анализ данных таблицы 3 показывает, что частицы бактериофага Pseudomonas aeruginosa yKZ не проходят через фильтры с диаметром пор 100 кДа, т.к. в фильтрате бактериофагов при помощи метода титрования по Грациа и спот-теста, не обнаружено.
Опираясь на данные, полученные при титровании, сравниваем количество фаговых частиц до разведения и после концентрирования:
Исходный - 2,6х108 х 5 = 1,3х109 БОЕ/см3;
Концентрат - 1,1х107 х 15 = 1,65х108 БОЕ/см3;
Разница 1,3х109 - 1,65х108=1,14х109БОЕ/см3.
Разница между исходным титром и титром в концентрате составила 1,14х109, при этом в фильтрате, бактериофагов при помощи титрования и спот-теста бактериофагов, не обнаружено. Стоит отметить, что титр в исходном растворе и титр после разведения также не сопоставимы:
Исходный - 2,6х108 х 5 = 1,3х109;
Разведенный - 1,4х105 х 400 = 5,6х107;
Разница 1,3х109 - 5,6х107= 1,24х109.
Скорее всего, расхождения в титрах связаны с неточностью и субъективностью оценки титра по методу Грациа.
Несмотря на то, что исходный титр не сопоставим с первоначальным значением, необходимо отметить динамику концентрирования (см. рисунок 1).
1,00E+09
2,60E+08
600
1,00E+06
О w о
w
1,00E+03
1,00E+00
1,10E+07
400
200
5
НАЗВАНИЕ ОСИ
15
БОЕ/см3
объем
0
Рисунок 1 - Динамика концентрирования бактериофагов Pseudomonas aeruginosa yKZ при помощи ультрафильтров 100 кДа
Анализ графиков рисунка 1 показывает, что после одного цикла концентрирования удалось поднять титр на два порядка, в единице объема (с 1,4х105 до 1,1х107 БОЕ/см3) и на один порядок, учитывая степень разведения (с 5,6х107 до 1,65х108 БОЕ/на весь объем).
Данные исследования демонстрируют возможность концентрирования бактериофагов при помощи ультрафильтров с диаметром пор 100 кДа.
1.4. Исследования с использованием фильтров 100 кДа (Streptococcus agalactiae 5/301 и Staphylococcus aureus (sm))
Проведена фильтрация фаголизатов Streptococcus agalactiae 5/301 и Staphylococcus aureus (sm). Перед фильтрованием фаголизат разведен в физрастворе в соотношении 5:395. Фильтрация растворов проведена через фильтры с диаметром пор 100 кДа. После фильтрации аликвоты переданы для проведения титрования по методу Грациа. Передано 4 образца каждого фаголизата:
1. исходный (контроль, до разведения);
2. разведенные фаголизаты (5:395);
3. концентрат;
4. фильтрат
Результаты титрования представлены в таблице 4.
Анализ данных таблицы 4 показывает, что бактериофаги Streptococcus agalactiae 5/301 и Staphylococcus aureus (sm) проходят через ультрафильтры с диаметром пор 100 кДа. После полученных результатов, в этом цикле эксперимента, было проведено сравнение размеров бактериофагов Streptococcus agalactiae 5/301, Staphylococcus aureus (sm) и Pseudomonas aeruginosa (pKZ.
Сопоставительный анализ размеров выявил достоверные различия в размерах используемых бактериофагов.
Так, фаг Pseudomonas aeruginosa yKZ, который успешно удалось концентрировать при помощи фильтров с диаметром пор 100 кДа, по размерам головки и хвостового отростка является меньшим, чем Streptococcus agalactiae 5/301 и Staphylococcus aureus (sm).
Было установлено, что данный эксперимент был неудачен в связи с технической ошибкой при проведении фильтрации. В связи с этим необходимо было провести дополнительные эксперименты с концентрированием бактериофагов при помощи ультрафильтров 100 кДа.
Таблица 4 - Концентрирование фаголизатов Streptococcus agalactiae 5/301 и Staphylococcus aureus (sm) при помощи ультрафильтров 100 кДа
Бактериофаг Исследуемый Объем, мл Титр по Грациа,
раствор БОЕ/см3
Streptococcus agalactiae 5/301 исходный 5 1,55х1010
разведенный 400 8,6х106
концентрат 20 5,6х108
фильтрат 380 8х105
Staphylococcus aureus (sm) исходный 5 6,4х1010
разведенный 400 1,0х108
концентрат 20 8х108
фильтрат 380 3,0х103
Таблица 5 - Размеры фагов в цикле исследований на ультрафильтрах 100 кДа
Фаг Хвостовой отросток, нм Головка, нм
Pseudomonas aeruginosa yKZ 8-10 55-57
Streptococcus agalactiae 5/301 203-205 91-92
Staphylococcus aureus (sm) 200-202 87-89
1.5. Повторные исследования с использованием ультрафильтров 100 кДа на S. aureus (sm) и P. aeruginosa 9KZ
Проведена фильтрация фаголизатов S. aureus (sm) и P. aeruginosa yKZ. Перед фильтрованием фаголизаты разведены в физрастворе в соотношении 1:399. Фильтрация растворов проведена через фильтры с диаметром пор 100 кДа. После фильтрации аликвоты переданы для проведения титрования по методу Грациа. Передано 4 образца каждого фаголизата:
1. исходный (контроль, до разведения);
2. разведенные фаголизаты (1:399);
3. концентрат;
4. фильтрат
В данных экспериментах использовали магнитную мешалку.
Таблица 6 - Концентрирование фаголизатов P. aeruginosa yKZ и Staphylococcus aureus (sm) при помощи ультрафильтров 100 кДа
Бактериофаг Исследуемый раствор Объем, мл Титр по Грациа, БОЕ/см3 Титр по Грациа, БОЕ / весь объем
P. aeruginosa фК-Z исходный 1 3,0х1010 3,0х1010
разведенный 400 7х107 2,8х1010
концентрат 10 3х109 3,0х1010
фильтрат 390 0 0
Staphylococcus aureus (sm) исходный 1 8,2х106 8,2х106
разведенный 400 2,2х104 8,8х106
концентрат 5 7,9х106 4,0х107
фильтрат 395 0 0
Анализ данных таблицы 6 показывает, что частицы бактериофага P. aeruginosa yKZ и Staphylococcus aureus (sm) не проходят через фильтры с диаметром пор 100 кДа, т.к. в фильтрате бактериофагов, при помощи метода титрования по Грациа и спот-теста, не обнаружено.
Титры бактериофагов P. aeruginosa yKZ и Staphylococcus aureus (sm) в исходных растворах сопоставимы с титрами в концентратах.
Данные эксперименты показали, что концентрирование с рабочим давлением 3-4 бар, с использованием магнитной мешалки (70-100 об/мин), позволяет концентрировать бактериофаги P. aeruginosa yKZ и Staphylococcus aureus (sm) практически без потери титра фагов в исходных образцах.
На рисунках 2, 3 отображены динамики концентрирования бактериофагов P. aeruginosa yKZ и Staphylococcus aureus (sm).
Стоит отметить, что в представленных данных титров бактериофага Staphylococcus aureus (sm) исходный титр равен - 8,2х106 БОЕ, при этой фильтрации в концентрате, титр бактериофагов был на уровне - 4,0х107 БОЕ, т.е. общее количество фаговых частиц увеличилось, в сравнении с первоначальными значениями, что невозможно. Считаем, что также, как и в экспериментах п. 2.3., различия в титрах могут быть связаны с ошибкой, заложенной в самом методе титрования.
3,0E+G1'0E+1° 1,0E+08
m
--5
1,0E+06 □
w
1,0E+04 § - 1,0E+02
0--1 1° 1,0E+00
-объем -БОЕ/см3
400 300 200 100
3,0E+10
Рисунок 2 - Динамика концентрирования бактериофагов P. aeruginosa yKZ при помощи
ультрафильтров 100 кДа
7,90E+06
- 1,0E+06
m
- 1,0E+04 §
о
- 1,0E+02 W
5 1,0E+00 -БОЕ/см3 -объем
Рисунок 3 - Динамика концентрирования бактериофагов P. aeruginosa фК-Z при помощи
ультрафильтров 100 кДа
Заключение. Результаты исследований демонстрируют возможность использования методов ультрафильтрации для повышения шанса детекции искомых бактериофагов в материале. Установлено, что для поиска бактериофагов, а также для концентрирования фаголизатов, возможно использовать ультрафильтрационные диски с диаметром пор не более 100 кДа. В инструкции производителя «Amicon® Stirred Cells» указано, что для успешного удержания вещества в префильтрационном растворе необходимо использовать фильтры с диаметром пор, в случае использования дисков «Ultracel» меньшими в 2-3 раза, в случае использования дисков «Biomax» меньшими 4-5 раз, чем размеры удерживаемого вещества. Данные характеристики дисков необходимо учитывать при разработке метода и его применения в практической работе.
По результатам исследований можно предположить, что методика ультрафильтрации подходит для поиска и концентрирования бактериофагов к патогенным и условно-патогенным видам бактерий собак и кошек. Использование указанного метода минимизирует потери бактериофагов при их концентрировании, что также положительного сказывается при поиске бактериофагов из клинического, патологического материала, образцов почв, воды и других видов образцов.
Список источников
1. Адамс М. Бактериофаги. - М.: Издательство иностранной литературы, 1961. - 587 с.
2. Насибулин, И.Х. Разработка технологии производства лечебно-профилактических препаратов очищенного концентрированного стафилококкового бактериофага: дис. канд. биол. наук: 03.00.07. -М., 1993. - 25 с.
3. Сингер М., Берг П. Гены и Геномы. - М.: Мир, 1998. - 391 с.
4. August J. R. Otitis externa. A disease of multifactorial etiology / August J. R. // Vet Clin North Am Small Anim Pract. — 1988. — № 4. — С. 731-742.
5. Gordillo Altamirano F.L., Barr J.J. Phage Therapy in the Postantibiotic Era // Clin Microbiol Rev. - 2019. -№2. - С. 1 -25.
6. Liu R., Han G., Li Z., Cun S., Hao B., Zhang J., Liu X. Bacteriophage therapy in aquaculture: current status and future challenges // Folia Microbiol. - 2022. - №4. - С. 573-590.
7. Zagaliotis P., Michalik-Provasek J., Gill J.J., Walsh T.J. Therapeutic Bacteriophages for Gram-Negative Bacterial Infections in Animals and Humans // Pathog Immun. - 2022. - №2. - С. 1-45.
References
1. Adams M. Bacteriophages. - M.: Publishing House of Foreign Literature, 1961. - 587 p.
2. Nasibulin, I.H. Development of technology for the production of therapeutic and prophylactic preparations of purified concentrated staphylococcal bacteriophage: author. dis. cand. biol. sciences: 03.00.07 / Nasibulin Ildar Khalitovich. - M., 1993. - 25 p.
3. Singer M., Berg P. Genes and Genomes. - М.: Mir, 1998. - 391 с.
4. August J. R. Otitis externa. A disease of multifactorial etiology / August J. R. // Vet Clin North Am Small Anim Pract. — 1988. — № 4. — С. 731-742.
5. Gordillo Altamirano F.L., Barr J.J. Phage Therapy in the Postantibiotic Era // Clin Microbiol Rev. - 2019. -№2. - P. 1-25.
6. Liu R., Han G., Li Z., Cun S., Hao B., Zhang J., Liu X. Bacteriophage therapy in aquaculture: current status and future challenges // Folia Microbiol. - 2022. - №4. - P. 573-590.
7. Zagaliotis P., Michalik-Provasek J., Gill J.J., Walsh T.J. Therapeutic Bacteriophages for Gram-Negative Bacterial Infections in Animals and Humans // Pathog Immun. - 2022. - №2. - P. 1-45.
Все авторы сделали эквивалентный вклад в подготовку публикации.
Авторы подтверждают отсутствие конфликта финансовых/нефинансовых интересов, связанных с написанием статьи.
All authors have made an equivalent contribution to the preparation of the publication. The authors declare that there is no conflict of interest.
Принята к публикации / accepted for publication 16.10.2023; © Глазунов Е.А., Пустовит Е.А., Пименов Н.В., Юскевич Я.А. 2023
