CC BY
81
УДК 543.544:543.80
БИОСОВМЕСТИМОСТЬ ДИГИДРОКВЕРЦЕТИНА С ЛИПОФИЛЬНЫМ И ГИДРОФИЛЬНЫМ ФРАГМЕНТАМИ БИОМЕМБРАНЫ. ВЛИЯНИЕ ИОНОВ МЕТАЛЛОВ И АСКОРБИНОВОЙ КИСЛОТЫ
© Н.Б. Мельникова', И.Д. Иоффе
Нижегородский государственный технический университет, ул. Минина, 24, г. Нижний Новгород, 603600 (Россия) e-mail: melnikov@nntu.sci-nnov.ru
Эффективная проницаемость растворов дигидрокверцетина в липидные слои = 30 нм-с-1, установленная по скорости впитывания и растекания капли раствора, уменьшается в присутствии двухвалентных ионов в ряду: Са2+> Cu2+ = Mg2+.
Взаимодействие дигидрокверцетина с поверхностью полиамидокислоты или ее солевой формы (модель гидрофильного фрагмента биомембраны) происходит по типу адсорбции.
Особенностью адсорбции дигидрокверцетина на Си2+-содержащей поверхности полиамидокислоты является протекание окислительной реакции в растворе. Процесс окислительной деструкции дигидрокверцетина, вероятно, катализируется поверхностными флавонолятными комплексами меди. Установлено, что введение в раствор более мощного антиоксиданта - аскорбиновой кислоты, позволяет уменьшать степень протекания процесса окисления с 40±5 до 8±5%.
Введение
В последние годы значительно возрос интерес к дигидрокверцетину как уникальному антиоксиданту растительного происхождения. Использование этого соединения в пищевой, косметической и фармацевтической промышленности обусловлено способностью дигидрокверцетина защищать компоненты клетки от окислительного повреждения и токсичности свободных радикалов [1-3].
Негативным процессом воздействия биофлавоноидов в большой концентрации на биосистему является прооксидантная активность биофлавоноидов с ортофенольной группировкой, наиболее подробно изученная на примере кверцетина [4-6].
Авторами работ [4] показано, что прооксидантная активность, приводящая к цитотоксичности, определяется не только большой концентрацией окисленных хиноидных форм, но главным образом способностью флавоноидов воздействовать на биомембрану клетки: проницаемостью биологически активного вещества и его окисленной хиноидной формы в липидные слои, биосовместимостью флавоноидов как с липофильными, так и гидрофильными фрагментами плазматической мембраны. Существенным моментом является проявление прооксидантной активности только в присутствии ионов переходных металлов.
В связи с вышеизложенным, представляет интерес установление роли иона металла и выявление физико-химических закономерностей взаимодействия дигидрокверцетина (ДКВ) с биомембраной на моделях биосистем, содержащих липофильные и гидрофильные фрагменты.
Автор, с которым следует вести переписку.
Информация такого рода может быть полезной для современных исследований по сохранению антиоксидантной активности компонентов биологически активных добавок. Знание воздействия ДКВ на поверхность мембраны позволит прогнозировать и фармакологические свойства препаратов на основе дигидрокверцетина.
Проблема прогнозирования взаимодействия лекарственных веществ с биологическим субстратом в реальных и модельных условиях является одной из важнейших в фармакологии, биологии, медицине. Центральным вопросом при разработке различных моделей биосистем являются принципы и закономерности имитации функционирования как биологического объекта, так и реагента, воздействующего на него. Единой теории строения и функционирования биологических мембран нет, что объясняется сложностью и разнообразием структур и функций мембран. Общепринято моделировать такие сложные системы комбинациями простых структурных единиц - «элементарных» мембран: липофильной частью, гидрофильными ионселективными каналами, трансмембранными белковыми соединениями, содержащими ионы металла. Химические реакции на поверхности мембран и их фрагментов осуществляются по механизмам, отличающимся от обычных реакций в трехмерной фазе. Ведущая роль в этих процессах принадлежит поверхностным явлениям: смачиванию, снижению поверхностного и межфазного натяжения, приводящему к впитыванию, растеканию и проницаемости, адсорбции, образованию поверхностных и межфазных пленок и соединений.
Экспериментальная часть
Дигидрокверцетин 98% чистоты, полученный из измельченной древесины лиственницы (торговая марка «Биоскан С») был предоставлен ООО «Росбиопром» (г. Саров Нижегородской области). Реагент был дважды перекристаллизован из смеси этилового спирта и воды, высушен до постоянной массы. Соли металлов (хлориды натрия и кальция, сульфат магния и ацетат меди (II)) соответствовали марке ч.д.а.
Концентрацию дигидрокверцетина определяли спектрофотоколориметрическим методом цианидинхлоридной пробы [7] и анализом УФ-спектров в области Xmax = 290 нм в соответствии с калибровочным графиком. Цианидинхлорид был получен обработкой аликвоты раствора дигидрокверцетина объемом 5 мл смесью, состоящей из концентрированной соляной кислоты, квалификации о.с.ч., ледяной уксусной кислоты (о.с.ч.) и воды в соотношении 3 : 3 : 1 (об.%), 0,2 г цинковой пыли (ч.д.а.), при температуре 50°С в течение 1 мин. Калибровочный график и текущие анализы дигидрокверцетина были выполнены при 550 нм на спектрофотометре СФ-46.
Определение одно- и двухвалентной меди проводили спектрофотоколориметрически на основании реакции одновалентной меди с бицинхониновой кислотой с образованием окрашенного комплексного соединения [8]. При исследовании водных растворов на содержание одновалентной меди пробу объемом 5 мл вносили в колбу на 50 см3, содержащую универсальный буферный раствор (ацетатно-фосфатно-боратная смесь) рН 6 [9], добавляли 2 мл раствора бицинхониновой кислоты (0,1% раствор в 2%-ном КОН), буферным раствором доводили до метки. При анализе осадков 0,015 г вещества растворяли в 2 мл раствора бицинхониновой кислоты и вносили в колбу на 50 см3, универсальной буферной смесью рН 6 доводили до метки. Через 20 мин после перемешивания раствор фотометрируют при Xmax = 560 нм. Общее содержание меди определяли по калибровочному графику, для построения которого отбирали порции стандартного раствора соли меди. Аналогично определяют содержание двухвалентной меди, добавляя в колбу 5 мл гидроксиламина солянокислого для восстановления двухвалентной меди до одновалентной.
Электронные спектры были записаны в области 200-500 нм в кварцевых кюветах на UV-Vis спектрофотометре «Specord M-40» фирмы Карл Цейс Йена (DDR). Спектры записывались в сравнении с бидистиллированной водой.
Измерение краевых углов смачивания в условиях натекания проводили при помощи горизонтального отсчетного микроскопа марки МПБ-2 в герметичной кювете, которая позволяет рассматривать анализируемый объект в условиях равновесия. Краевые углы смачивания рассчитывали исходя из 20 опытов, по 3 капли в каждом.
Во всех случаях предварительно изучалась кинетика растекания капли жидкости 0 = _Дт) на изучаемой поверхности. Измерения 0 проводили через определенное время, соответствующее области первого «плато» на кинетической кривой растекания при 293 К.
Краевой угол смачивания в зависимости от формы капли рассчитывали по формулам
в = 2 • аг^ (2 • к /1);
(I /2)2 - к
со8в = ■
(I /2)2 + И
V
248Іп3в
П- (2 - 3с08в + 008 в)
где I, к, й, V- длина, высота, диаметр, объем капли соответственно.
В качестве модели липидного слоя плазматической мембраны использовали липидной слой на основе лецитина (1-стеарил-2-олеил^п-глицеро-3-фосфатидилхолина, М.м. = 766), имеющего следующее
строение:
СН2—ООСС17Н35 СН—ООССі7Н33 Н
С
А - неполярная часть
О— Р—О-
ОоСН2СН2М+(СН3)3С1‘
В - полярная фосфохолиновая часть
Предварительную подготовку подложек для формирования тонкой пленки лецитиновых мембраноподобных структур проводили по следующей методике. Стеклянные подложки отмывали в хлороформе, затем выдерживали в горячем растворе хромовой смеси при 100°С в течение 20 мин, промывали 10 мин в горячей воде при 90°С, в холодной проточной воде и дважды в бидистиллированной воде комнатной температуры. Подложки подвергали термостабилизации при 160°С в течение трех часов. Поверхность стандартизировали по измерениям краевых углов смачивания 0нат. капли воды.
Для формирования тонкой пленки лецитина очищенные подложки погружали в раствор лецитина в хлороформе определенной концентрации (0,0001-0,8 г/л) на 1 мин при комнатной температуре и затем высушивали в эксикаторе над свежепрокаленным СаС12 (ч.) в течение суток. Контроль поверхности осуществляли измерением краевых углов смачивания.
В качестве модели гидрофильного фрагмента биосистемы использовали полипиромеллитимид (ППИ) марки ПМ-1А толщиной 40±5 мкм. Модификацию осуществляли щелочным гидролизом в 3М водном растворе гидроксида натрия (х.ч.), при 313 К в течение 30 мин, после чего образцы дважды, по 10 мин, промывали в бидистиллированной воде при комнатной температуре (при использовании горячей промывки происходит смывание поверхностного слоя):
100 + 5 нм
40 + 5 і мкм
Ш+-ПАК
полипиромел-
литимид
Полипиромеллитимид
Гидролитический поверхностный слой, условно названный №+-ПАК, легко модифицируется в
различные формы (схема 1). Образцы №-ПАК погружали в водный раствор 0,1М соляной кислоты (Н-ПАК), либо в растворы солей металлов (MgSO4, Си(СН3СОО)2, СаС12 -Ме-ПАК) при комнатной температуре на 10 мин, затем дважды промывали холодной водой и высушивали при комнатной температуре в течение трех часов.
+Ыа -ООС -НЫ-ОС
СОО- Ыа+
СО—ЫН-Я
НС1
Ыа+-ПАК
МЕХ2
1 с + с 1 +
НООС К \ /СООН МеХ...ООС. и \ ^СОО...МеХ лГ
_-НЫ- осх^ -^У\ ' 'СО-ЫН-Я п А -НЫ- ОСх ^ ' \О-ЫН-Я
Н-ПАК
солевая структура Ме-ПАК (Са-ПАК, Си-ПАК, М§-ПАК)
Схема 1. Модели биосистем на основе модифицированной поверхности полипиромеллитимида
Исходная поверхность всех моделей биосистем была стандартизована по измерениям краевого угла смачивания 0нат капли бидистиллированной воды.
Химическую природу модифицированного слоя ППИ и его толщину контролировали по ИК-спектрам отражения. Концентрацию карбоксилатных групп контролировали по полосам поглощения 1620, 1420 см1, концентрацию карбоксильных групп -по полосе поглощения 1500 см-1. Толщина модифицированного слоя не превышала 100 ± 5 нм.
п
п
Обсуждение результатов
Взаимодействие ДКВ с моделью липофильного фрагмента биомембраны
Самоорганизующиеся структуры лецитина были получены на твердой подложке [10]. На первом этапе получения липидного слоя осуществляют осаждение тонкой пленки лецитина из хлороформно-метанольного раствора с последующим удалением растворителя. На втором этапе формирование мембранных ассоциатов лецитиновых структур происходит в условиях набухания тонкой пленки лецитина под каплей смачивающей жидкости.
Структура ассоциатов лецитиновых мембран была изучена по изотермам смачивания. Термодинамически-стабильные самопроизвольно образующиеся структуры выбирались по области плато на изотермах смачивания 0 = _/(Слец) (рис. 1). Самоорганизующаяся перестройка поверхностного слоя лецитиновых структур, вероятно, может продолжаться и при дальнейшем растекании капли.
Анализ кинетических кривых на поверхностях лецитина в интервале концентраций ДКВ 0,25-1 г/л в течение 30 мин свидетельствует об эффективной проницаемости ДКВ через липофильную часть мембраны.
При впитывании высота капли смачивающей жидкости И должна изменяться значительно быстрее, чем длина хорды капли I. Скорость изменения ёИ/ёт характеризует проницаемость водного раствора в модель биосистемы и, соответственно, массоперенос ДКВ через мембрану (рис. 2а, б). Поскольку впитывание капли происходит не только по высоте И, но и по всей площади капли, то величина ёИ/ёт может характеризовать только условную впитываемость или проницаемость растворов в липидный слой. Из данных рисунка 2а, б рассчитана условная скорость впитывания 3,28-10-3М раствора дигидрокверцетина. Эта величина, равная 1,8 мкм/мин (30 нм/с), в дальнейшем принята нами за стандарт.
Рис. 1. Изотерма смачивания лецитина каплей воды в координатах соєб = /(С^ц)
Рис. 2а. Кинетические кривые впитывания в поверхностный слой лецитина И = /(т) капли жидкости: 1 - 3,28-10-3 М раствора ДКВ; 2 -бидистиллированная вода; 3 - 4,34-10-2 М раствора Мя8О4; 4 - 7,4-10-2 М раствора СаСЬ; 5 - 3,28-10-5 М раствора Си(СН3СОО)2
Рис. 2б. Кинетические кривые впитывания в поверхностный слой лецитина И = /(т) капли жидкости: 1 - 3,28-10-3 М раствора ДКВ; 3' -раствора состава: 3,28-10-3 М ДКВ, 4,34-10-2 М раствора MgSO4; 4' - раствора состава: 3,28-10-3 М ДКВ, 7,4-10-2 М раствора СаС12; 5' - раствора состава: 3,28-10-3 М ДКВ, 3,28-10-5 М раствора Си(СН3СОО)2.
Нами предложено проводить сравнительную оценку проницаемости изучаемых растворов через липидные слои как отношение скорости впитывания изучаемых растворов к скорости впитывания стандартного раствора ДКВ, выраженное в процентах (а,%) (табл. 1).
Из данных рисунка 2а следует, что ионы двухвалентных металлов (Mg2+, Са2+, Си2+) тормозят процесс впитывания растворов. Эффект уменьшения впитывания капли жидкости значительно усиливается при совместном присутствии солей металлов и ДКВ (рис. 2б, табл. 1). Наиболее сильное воздействие на проницаемость растворов оказывают ионы кальция Са2+. Ионы кальция играют важную роль в биомембранных системах, обеспечивая активный транспорт и передачу сигналов. Значительное уменьшение проницаемости растворов ДКВ в присутствии Са2+ косвенно свидетельствует о сложных межмолекулярных взаимодействиях лецитина, Са2+ и ДКВ на поверхности мембраны, способных выполнять блокирующую роль. Взаимодействие ионов двухвалентной меди имеет более сложный характер; предполагается образование сложных хелатов меди с лецитиновой мембраной [11]. Полученные нами результаты хорошо согласуются с работами авторов [11, 12], установивших изменение
проницаемости растворов, содержащих ионы Са2+, Си2+ через липидные мембраны методами измерения изотерм поверхностного давления п = /(А), где А - площадь, занимаемая молекулой липида, а также методом кристалло-кварцевого микробаланса.
Таблица 1. Характеристика воздействия капли жидкости на поверхность лецитина
№ кривой Смачивающая жидкость, состав, М Условная скорость впитывания, и, мкм/мин (±0,1) Bпитывaниe, а, % (±2%) а °впит. раств. 100% ивпит.ДКВ Oтноcитeльноe растекание, в, % (±2%) в = 1ШВ^аа 100% ДКВ
1 3,28-10"3М ДКВ в воде 1,8 100 0
2 Н2О, бидистилл. 1,2 67 0
3 4,34-10"2М MgSO4 1,7 94 2,З
4 7,4-10"2М CaCl2 1,7 94 2,З
З 3,28-10"5М Cu(CH3COO)2 1,1 61: 2,З
3' 3,28-10"3М ДКВ, 4,34-10"2М MgSO4 1,2 67 З
4' 3,28-10"3М ДКВ, 7,4-10"2М CaCl2 0,7 38 З
З 3,28-10"3М ДКВ, 3,28-10"5М Cu(CH3COO)2 1,2 67 З
Иллюстрацией суммарного воздействия впитывания и растекания является изменение динамических углов смачивания во времени на поверхности лецитина, выраженных как зависимость cos 0динам= f т) (рис. 2в). Поскольку поверхностное натяжение растворов уж ~ const ~ 72±4 мДж/м2 (у при концентрации 3,28-10"3 М равна 68,5 мДж/м2), то в каждый момент времени можно оценить баланс поверхностной энергии Гиббса в процессе растекания через уравнение Юнга:
Yж 'со*вдинам = Yлец -Улец-ж.
Увеличение cos 0динам при уж ~ const характеризует уменьшение межфазной энергии на границе раздела «лецитин-ж» (улец.ж) или увеличение улец в определенный момент времени т. Такое резкое уменьшение межфазной энергии справедливо для самопроизвольных процессов в твердой фазе, в данном случае самоорганизации в поверхностном слое лецитина.
Взаимодействие ДКВ с модифицированной поверхностью полиамидокислоты (модель гидрофильного
фрагмента биосистемы)
Краевой угол смачивания на поверхности Н-ПАК, содержащей поверхностные карбоксильные и амидные группы, капли 3,28-10-3 М раствора ДКВ соответствует величине 62±1 град. В отличие от поверхности лецитина, капля раствора ДКВ не растекается в течение длительного времени и сохраняет равновесное стационарное значение (рис. 3, кривая 4'). Модификация поверхности Н-ПАК обработкой в растворе ДКВ различной концентрации при 293 К в течение суток с последующей промывкой и сушкой изменяет кинетические закономерности смачивания и растекания (рис. 3, кривые 1-4). В качестве смачивающей жидкости была использована бидистиллированная вода. Процесс растекания усиливается при увеличении концентрации ДКВ в растворе модификации. Такое поведение, вероятно, свидетельствует об образовании адсорбционных слоев ДКВ на поверхности Н-ПАК. Величина максимальной адсорбции Гщах, дкв определяется концентрацией ДКВ в растворе предварительной модификации.
Процесс адсорбции ДКВ на поверхности солевой формы полиамидокислоты - Na-ПАК, модели более гидрофильного фрагмента биосистемы, протекает более эффективно. Расчет адсорбции ГдКВ по данным УФ-спектрального анализа (Я max = 290 нм) и по прямому анализу ДКВ с помощью цианидинхлоридной пробы показывает значение ГдКВ = 1 ^ 10-10-9 моль/см2 в расчете на геометрическую поверхность без учета пористости в интервале концентраций ДКВ в растворе 0,1—1,5 г/л.
Кинетическая кривая адсорбции р = f (т), где р - доля адсорбции, приведена на рисунке 4 (кривая 2). Процесс адсорбции ДКВ на поверхности Na-ПАК был также изучен методом смачивания. Предварительными опытами установлено, что угол смачивания 0 увеличивается с повышением концентрации от 0 = 22 град (Na-ПАК) до 0 = 62 град (0адс.. дКВ), соответствующему Гтах дКВ. В связи с этим все дальнейшие опыты были проведены при концентрации ДКВ = 3,28-10-3М, обусловливающей достижение предельного значения 0.
Рис. 2в. Изменение динамических углов смачивания в процессе растекания капли растворов дигидрокверцитина в присутствии ионов Me2+ на поверхности лецитина. 1 - ДКВ; 3' -ДКВ + Mg2+; ДКВ + Ca2+; 5' -ДКВ + Cu2+. Концентрация ДКВ = const = 3,28-10-3 М; cos0 динам = 0,35 + a-т
Рис. 4. Зависимость ф = /(т) для адсорбции на поверхности Ма-ИАК 1 - по данным смачивания; 2 - по результатам анализа ДКВ методом цианидинхлоридной пробы и по УФ-спектральному анализу. Доля адсорбционных центров ф, занятая ДКВ была рассчитана по
Рис. 3. Кинетические кривые растекания собВ = /(т) капли бидистиллированной воды (кривые 1-4) на поверхности полиамидокислоты (Н-ПАК), предварительно пропитанной в течение суток растворами дигидрокверцетина различной концентрации. 1 - 0,25 г/л; 2 - 0,50 г/л;-3 - 0,75 г/л; 4 - 1,0 г/л. Поверхность полиамидокислоты - без пропитки; капля смачивающей жидкости - раствор ДКВ - 1 г/л.
данным смачивания:
cos в„
p
cos вх - cos вШ-ПАК
ЫЪвдКВ - cos&Na- ПАК
где
пак - краевой угол смачивания капли воды на исходной поверхности Ыа-ПАК, созвНа-пАк = 22 град ; соивд^ - краевой угол
смачивания капли воды на поверхности Ыа-ПАК после выдержки подложки в течение суток в
3,28-10"3 М растворе ДКВ, вдкв = 62 град .
Для расчета степени адсорбции р принимаем, что 0 чувствителен только к изменению химической природы карбоксильной или карбоксилатной группы; поверхность полимера в процессе адсорбции состоит из участков двух типов: Ыа-ПАК и адсорбционного комплекса Ыа-ПАК-ДКВ.
В соответствии с этими допущениями и комбинацией уравнения Юнга и Касси-Бакстера доля поверхности, занятой ДКВ (степень протекания адсорбции), равна:
p =
соивх -cose.
cos вдкв cos eNa-ПАК
где cos 0x - угол смачивания на поверхности полиамидокислот в процессе адсорбции.
На рисунке 4 представлены результаты расчета р в процессе адсорбции ДКВ на поверхность полимеров (кривая 1). Совпадение кривых 1 и 2 свидетельствует об адекватном представлении процесса адсорбции на полиамидокислоте по данным смачивания.
В качестве модели медьсодержащего фрагмента биосистемы использовали модифицированную щелочным гидролизом поверхность полиамида с адсорбированными на ней ионами меди (II) - Си-ПАК. Структурное звено Си-ПАК может быть представлено солевыми и хелатными формами полиамидокислот типа:
СифС- ОТ 0 ХСи2+ -00С к ~ С00- Си2+Х зг
я-ш-ос' СО-КИ-Я- п -НЫ-ос' ^ СО-ЫИ-Я
Си - ПАК (солевая форма) Си - ПАК (хелатная форма)
Установлено, что в присутствии Си-ПАК убыль ДКВ из раствора, оценивая по уменьшению интенсивности поглощения полосы с Хщах = 290 нм, происходит в несколько раз быстрее, чем это предполагается с учетом адсорбции ДКВ на всех адсорбционных Си2+-содержащих центрах.
Можно предположить, что адсорбция ДКВ на Си2+-содержащих центрах Си-ПАК происходит по хемосорбционному механизму с образованием флавонолятных комплексов меди.
Известно, что флавонолятные комплексы способны проявлять каталитическую активность к процессам окисления, в частности окислительной деструкции гетероциклического кольца и окисление орто-фенольной группы в положении 3',4' до ортодихинонов [13] (кольцо В, схема 2). Конечным продуктом реакции взаимодействия ионов Си2+ с кверцетином в присутствии кислорода воздуха авторы работы [13] считают хиноидные соединения типа:
ОН
О
п
Кверцетин (1) 3',4'-ортодихинон (II)
Схема 2. Каталитическое окисление кверцетина
Для подавления окислительных деструкционных процессов с участием ДКВ и Си2+ и проявления прооксидантного эффекта в раствор ДКВ был введен более мощный антиоксидант - аскорбиновая кислота.
Известно, что действие флавоноидов значительно усиливается в присутствии аскорбиновой кислоты. В литературе имеются также данные о влиянии ряда флавоноидов на деятельность медьсодержащих ферментов (аскорбиноксидазу, цитохромоксидазу), которые также играют важную роль в процессах окислительного превращения аскорбиновой кислоты. Исходя из вышесказанного было изучено взаимодействие ДКВ с аскорбиновой кислотой в присутствии Си-ПАК.
Нами установлено, что в присутствии поверхности, содержащей ионы меди (II), при взаимодействии аскорбиновой кислоты (АК) с ДКВ в реакционной смеси образуется комплексное соединение, характеризующееся появлением в УФ-спектрах поглощения новой полосы высокой интенсивности с ^тах = 280 нм и полным исчезновением двух полос с Хтах = 260 нм и Хтах = 290 нм, характерных для исходных АК и ДКВ (рис. 5).
Изучение адсорбции ДКВ и АК из их водных растворов на поверхности Си-ПАК показало, что кинетические закономерности этого процесса сильно различаются для каждого компонента в отдельности (рис. 6).
Величина абсолютной адсорбции Г для АК почти в 1,5 раза больше, чем для ДКВ за 20 ч. Анализ кинетических результатов в координатах линейного уравнения в = а+в-1^г, справедливого для адсорбции на неоднородных поверхностях, показал, что экстраполяционное время достижения равновесного состояния также ~ в 1,5 раза больше для АК.
На поверхности Си-ПАК оба реагента претерпевают изменения, при этом и в растворе в присутствии Си-ПАК отмечается разложение АК и ДКВ (рис. 7).
Установлено, что каждый из компонентов по отдельности в присутствии Си-ПАК за 20 часов разлагается на ~ 40 ± 5%, тогда как при совместном присутствии АК и ДКВ в растворе в этих условиях разложение не превышало 7-9%. Резкое торможение процесса разложения двух важнейших антиоксидантов в присутствии ионов меди (II) может быть объяснено следующим. В биосистеме флавоноид, являющийся полифенолом, может связываться с медьсодержащим центром аскорбиноксидазы и предохранять АК от окислительного разрушения, тормозя процесс образования ДАК (дегидроаскорбиновой кислоты) и соответственно Б-аскорбиновой кислоты. Флавоноид далее окисляется до ортодихинона, который может восстанавливаться как НАДФ - зависимой хинон оксидоредуктазой, так и непосредственно АК с образованием ДАК:
Си-содержащий фермент
ДКВ = ортодифенол ------------► ортодихинон
ортодихинон + АК --------► ДАК + ортодифенол
Рис. 5. УФ-спектры поглощения растворов биологически активных веществ в присутствии Си2+-содержащей поверхности Си-ПАК: 1 - 4-10-5 М раствор аскорбиновой кислоты; 2 - 4-10-5 М раствор ДКВ; 3 - реакционная смесь 4• 10-5 М раствора аскорбиновой кислоты и 4 • 10-5 М раствора ДКВ
Рис. 6а. Кинетические кривые адсорбции биологически активных веществ на поверхность Си2-содержащей полиамидокислоты Си-ПАК в координатах Г = _Дх, ч): 1 - аскорбиновой кислоты;
2 - дигидрокверцетина
Рис. 6б. Кинетические кривые адсорбции биологически-активных веществ на поверхности Си2+-содержащей полиамидокислоты Си-ПАК в координатах ф = /(1§х), ф = а + в: 1 -
аскорбиновой кислоты; 2 - дигидрокверцетина
Рис. 7. Зависимость степени протекания окислительных процессов а от времени выдержки растворов биологически активных веществ в
присутствии Си2+-содержащей поверхности Си-ПАК
№ Биологически Н N а
кривой активное вещество
1 Аскорбиновая в . (т) а-100% "“. Л (т) 100%
кислота Вотн. Л(т„-0)
2 Дигидрокверцитин а-100% °отн' 290 т 100% Вотн. 290 нм, т0 -0
3 Смесь аскорбиновой а -100% —°отн- 280 нм- т 100%
кислоты и дигидрокверцетина Вотн. 280 нм, т0 -0
Следовательно, благодаря, существованию окислительно-восстановительной системы АК - флавоноид в присутствии Си2+ поддерживается необходимый баланс окисленной и восстановленной форм АК и флавоноидов, что обусловливает эффективный антиоксидантный эффект, минимально уменьшая прооксидантную активность ДКВ.
Выводы
1. Качественная оценка проницаемости растворов дигидрокверцетина через липидные слои (модели липофильного фрагмента биомембраны) по скорости впитывания капли раствора характеризует высокую эффективность массопереноса дигидрокверцетина через мембрану (условная скорость движения фронта жидкости ~ 30 нм-с-1).
2. Проницаемость ДКВ через мембрану уменьшается в присутствии ионов двухвалентных металлов. Относительная впитываемость растворов ДКВ и солей металлов уменьшается в ряду: М^04 (67%) ~ Си(СН3С00)2 (61%) > СаС12 (38%).
3. Методами смачивания и прямых адсорбционных измерений изучен процесс адсорбции ДКВ на модифицированной поверхности полиамидокислот (Н-ПАК, №-ПАК, Си-ПАК) как модели гидрофильного фрагмента биосистемы.
Кинетические закономерности адсорбции ДКВ удовлетворительно описываются эмпирическим уравнением вида 0 = а ^т + в.
4. Выявлены особенности протекания окислительных процессов ДКВ в присутствии Си2+-ПАК (модель прооксидантной активности ДКВ). Установлено, что введение в раствор более мощного антиоксиданта -аскорбиновой кислоты, позволяет уменьшить протекание процесса окисления с 40± 5 до 8±5%.
Список литературы
1. ^кавЕина Н.Л., Руленко И.Л., ^лесник Ю.Л. Природные флавоноиды как пищевые антиоксиданты и биологически активные добавки // Вопросы питания. 1996. №2. С. 33-38.
2. Патент № 2G14841 Россия. Aнтиоксидантное• капилляропротекторное, противовоспалительное и антигистаминное средство / Соколов С .Я., ^^вкина Н.Л., ^лхир В.К и др. // Б.И. 1994. №12.
3. ^лхир B.K.• ^кивкина Н.Л.• Быков B.Л. и др. Диквертин - новое антиоксидантное и капилляропротекторное средство // Хим.-фарм. журнал. 199З. №9. С. 61.
4. Metodiewa D., Jaiswal A.K., Cenas N., Dickancaite E., Segura-Aguilar J. Quercetin may act as a cytotoxic prooxidant after its metabolic activation to semiquinone and quinoidal product // Free radical biology and medicine. 1999. V. 26. P. 1G7-116.
З. Bjeldanes L.F., Chang G.W. Mutagenic activity of quercetin and related compounds // Science. 1977. V. 197. P. З77-З78.
6. Cserjesi A.J. Toxicity and biodegradation of dihydroquercetin // Can. J. Microbiol. 1969. V. ІЗ. P. 1137-114G.
7. Еськин A.П., Левандский В.Л., Полежаева Н.И. Метод количественного фотометрического определения дигидрокверцетина // Химия растительного сырья. 1998. №3. С. 41-46.
8. Гершунс Л.Л., Верезубова A.A., ^лстых Ж.Л. Фотоколориметрическое определение меди с помощью 2,2-бицинхониновой кислоты // Изв. вузов. Химия и химическая технология. 1961. №1. С. 2З-27.
9. Лурье Ю. Ю. Справочник по аналитической химии. М., 1989. 27З с.
1G. Щипунов Ю.Л. Самоорганизующиеся структуры лецитина // Успехи химии. 1997. №4. С. 328-3З2.
11. Shnek D.R., Pack D.W., Sasaki D.Y. and Arnold F.H. Specific protein attachment to artificial membranes via coordination to lipid bound copper (II) // Langmuir.1994. №1G. Р. 2382-2388.
12. Yasuhito Ebara, Hiroshi Ebato, Katsuhiro Ariga, Yoshio Okahata Interaction of calcium ions with phospholipid membranes. Studies on п-A isotherms and electrochemical and quartz-crystal microbalance measurements // Langmuir. 1994. №1G. Р. 2267-2271.
13. Brown J.E., Khodr H., Hider R.C., Rice-Evans C.A. Structural dependence of flavonoid interactions with Cu2+ ions: implications for their antioxidant properties // Biochem. J. 1998. V. 33G. P. 1173-1178.
Поступило в редакцию 29 апреля 2002 г.
