CC BY
77
ФАРМАЦИЯ
УДК 543:615.2/.3: 615.33: 544.723: 547.972.3: 546.56
ПРОГНОЗИРОВАНИЕ ПРОНИЦАЕМОСТИ ФЛАВОНОЛЯТНЫХ КОМПЛЕКСОВ НА ОСНОВЕ ДИГИДРОКВЕРЦЕТИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МОДЕЛЕЙ МЕМБРАННЫХ СИСТЕМ
Н.Б. Мельникова, д. хим. н., профессор, зав. кафедрой фармацевтической химии и фармакогнозии, И.А. Пегова, к. фарм. н., ассистент кафедры фармацевтической химии и фармакогнозии,
А.А. Волков, к. хим. н., доцент кафедры управления и экономики фармации и фармацевтической технологии, С.В. Кононова, д. фарм. н., декан фармацевтического факультета,
ГОУ ВПО «Нижегородская государственная медицинская академия Росздрава»
Продемонстрированы возможности использования моделей искусственных биомембран для прогнозирования свойств и проницаемости лекарственных веществ на примере комплексов дигидрокверцети-на (ДКВ). В качестве моделей биосистем использованы фосфолипидные моно- и бислои, везикулы и медьсодержащие полиамидокислоты (Cu-ПАК). Было установлено, что окислительное разложение смеси ДКВ и аскорбиновой кислоты (АК) в присутствии Cu-ПАК в 5 раз меньше, чем окисление индивидуальных соединений. Лекарственное средство «Биоскан С», содержащее ДКВ и АК, обладает более высокой биологической активностью, чем чистый ДКВ. Проницаемость комплексов ДКВ с Zn и Сг аспа-рагинатами или с Р-метанофуллеренами изучали с использованием Ленгмюровских монослоев и везикул. Установлена корреляция между хорошей проницаемостью комплексов и их биологической активностью.
The potentialities of using of artificial biomembrane models for prediction of properties and permeability of medicine presented by dihydroquercetin (DHQ) complexes have been shown. Phospholipid mono-and bilayers, vesicles and copper-containing polyamidoacids (Cu-PAA) as biosystem models were used. The oxidative degradation of DHQ and ascorbic acid (AA) at the presence Cu-PAA in 5 times less, than oxidation of pure compounds was estimated. The medicinal «Bioscan C» containing DHQ and АА has more effective biological activity than pure DHQ. The permeability of complexes of DHQ with zinc and chromous asparaginates or with P-methanofullerenes was studied by Lаngmuiг monolayers and vesicles. Correlation between good permeability of complexes and biological activity was estimated.
Одним из методов молекулярной фармации является анализ поведения лекарственных веществ, ионов, радикалов и других частиц на простых моделях биологических мембран. Эти исследования обычно предшествуют полномасштабным и трудоемким испытаниям с использованием живых систем, сокращая время экспериментов, и позволяют вскрыть основные закономерности сложных процессов в мембране, протекающих под действием лекарственных веществ (ЛВ).
Согласно современным представлениям, функционирующие биологические мембраны представляют собой двумерный раствор глобулярных интегральных белков (бислой), диспергированных в жидком фосфолипидном матриксе. Для природных мембран характерно также существование сходных с порами структур-каналов, представляющих собой интегральные белки, через которые осуществляется проникновение ионов.
В настоящей работе показаны возможности использования моделей биомембран и биосистем с целью прогнозирования свойств и создания новых лекарственных средств (ЛС) на примере природного флавоноида-антиоксиданта дигидроквер-цетина (таксифолина).
В качестве моделей биосистем использованы фосфолипидные монослои, плоские бислои, липосомы и везикулы, а также медьсодержащие полиамидокислоты (ПАК), моделирующие фрагмент медьсодержащих ферментов. Каждая из этих систем имеет свои достоинства и недостатки и несмотря на их простоту получаемая с их помощью информация оказалась очень ценной при разработке концепций воздействия ЛВ на биомембраны [1].
Выбор дигидрокверцетина в качестве ЛВ обусловлен тем, что это соединение проявляет более 20 видов биологической активности [2-9], что позволило создать на их основе ряд
высокоэффективных и малотоксичных лекарственных средств, оказывающих различные лечебные эффекты: противоопухолевое [4], антидиабетическое [5], противовоспалительное [6], противовирусное [7], капилляроукрепляющее и др. Такой широкий спектр фармакологической активности дигидрок-верцетина обусловлен его влиянием на ферментные системы [8] и антиоксидантной деятельностью [9].
Материалы и методы
Дигидрокверцетин 98% чистоты, полученный из измельченной древесины лиственницы (торговая марка «Биоскан»), был предоставлен ООО «Росбиопром» (г. Саров Нижегородской области). Аспарагинаты цинка Zn(GNO4H6)27n(OH)2 и хрома Cr(C4NO4H6)3.2H2O (ОАО «Кристалл») содержали 28,5% цинка и 13,1% хрома соответственно.
Для исследования модельных биомембран был использован яичный лецитин в виде хлороформного раствора (99%, SIGMA Chemical Co).
Состояние монослоев лецитина было изучено на автоматизированной установке, представляющие собой весы Ленгмюра и тефлоновую ванну, заполненную изучаемыми растворами ЛВ.
Плоские бинослои были получены поливочным методом из хлороформного раствора лецитина [1]. Мультиламеллярные везикулы были получены методом двойного эмульгирования. Первоначально получали однородную обратную эмульсию молочно-белого цвета, состоящую из неводного раствора лецитина и водного раствора ДКВ с последующим диспергированием ультразвуком. Прямую эмульсию получали добавлением необходимого количества воды в обратную эмульсию с последующим ультразвуковым диспергированием и удалением неводного растворителя в вакууме [10].
Электронные спектры были записаны в области 200-700 нм в кварцевых кюветах на UV-Vis спектрофотометре «Specord S 100» bio. Толщина слоя кювет I = 1 см.
Концентрацию ДКВ определяли анализом УФ-спектров в области Л™=290нм в соответствии с калибровочным графиком и спектрофотометрическим методом цианидинхлорид-ной пробы [11].
Результаты и обсуждения
Негативным процессом воздействия дигидрокверцетина (ДКВ) является его концентрационно-зависимая прооксидант-ная активность, приводящая к цитотоксичности. Прооксидантный эффект определяется, главным образом, способностью флавоноидов и их окисленных форм воздействовать на мембрану клетки в присутствии ионов металлов.
Ингибирование прооксидантного эффекта ДКВ возможно аскорбиновой кислотой (АК) с участием медьсодержащих ферментов (аскорбиноксидазы, цитохромоксидазы). АК восстанавливает окисленную форму ДКВ, а ДКВ восстанавливает дегидроаскорбиновую кислоту.
Окислительные процессы при взаимодействии ДКВ с АК были изучены на поверхности медьсодержащих полиамидо-кислот (Cu-ПАК).
Установлено, что в присутствии Cu-ПАК при взаимодействии АК и ДКВ образуется комплексное соединение, характе-
ризующееся новой полосой с \rnax = 280 нм в УФ-спектре (рис. 1а), интенсивность поглощения которой может быть использовано для расчета окисленных форм АК и ДКВ.
D, отн. ед.
X, нм
а,% Б
Рис. 1. а) УФ-спектры поглощения растворов: АК (1), ДКВ (2) и их смеси 1:1 (3) в присутствии Си-ПАК. б) Кинетические кривые окисления а = ^т) : АК(1), ДКВ (2) и их смеси (3) в присутствии Си-ПАК.
В реакционной смеси ДКВ и АК отмечается резкое снижение окислительных процессов каждого из компонентов до 7-9%, тогда как окисление в растворах индивидуальных АК и ДКВ в присутствии Си-ПАК достигает 40±5% (рис. 1б).
Биохимические исследования хорошо согласуются с полученными результатами, что свидетельствует о правомочности использования такой простой модели. С использованием этой модели нами обоснованы концентрации ДКВ и АК, позволяющие поддерживать необходимый баланс окисленной и восстановленной форм АК и ДКВ, для обеспечения минимальной прооксидантной активности ДКВ, что было использовано при создании капсулированной формы БАДа «Биоскан С» и «Биоскан+», содержащего ДКВ (20 мг) и АК (30мг).
Клинические исследования антиоксидантных свойств Биоскана С и Биоскана+ проведены в Областном геронтологическом центре г. Н. Новгород проф. Конторщиковой К.Н., Жулиной Н.И., Руновой А.А, в НИИ травматологии и ортопедии, г. Н.Новгород под руководством проф. Перетягина С.П. и Конторщиковой К.Н., в больнице № 27 «Айболит», г. Н.Новгород, к. м. н. Богдановой Т.А. и др., в дорожной больнице на ст.« Горький», г. Н. Новгород, под руководством Шульца А.А. и проф. Конторщиковой К.Н., в Институте хирургии им. А.В. Вишневского РАМН, г. Москва, в Областном онкологическом центре, г. Н. Новгород, под руководством проф. Конторщиковой К.Н. и др.
показали, что Биоскан+ помимо непосредственного антиоксидантного эффекта у больных атеросклерозом может усиливать ферментативные процессы в печени, направленные на нормализацию липидного обмена, в основном синтеза ЛПОНП, переносящих ТГ и окисление ХС в системе оксидо-редуктаз с участием цитохрома Р-450. У больных с ожоговой травмой наибольший антиоксидантный эффект наблюдается при совместном действии озона и Биоскан+. При лечении детей с аллергическими заболеваниями Биоскан+ проявляет свойства иммуномодулятора. При комплексном лечении цитостатиками и Биосканом+ больных раком молочной железы отмечается иммуномодулирующий и антиоксидантный эффекты.
Кроме того, интересные исследования по разработке БАДов, включающих ДКВ и АК, проведены проф. Тюкавкиной Н.А. (ММА им. И.М. Сеченова), проф. Плотниковой Т.М.
(Сибирский медицинский университет), проф. Плотниковым М.Б. (Томский научный центр СО РАМН), завершившееся созданием БАДа «Антоксид» [12].
Исследования в России показали, что ДКВ подавляет активность нейтрофильных лейкоцитов, сопровождающую воспалительный процесс у пациентов с диабетом II типа и предохраняет от дистрофии желтого пятна сетчатки и катаракты.
Диабетическая ретинопатия, а также некоторые другие заболевания зрительного аппарата, определяются в значительной степени концентрацией ферментообразующих микроэлементов, таких как цинк (контроль функции поджелудочной железы) и хром (симбатное снижение толерантности к глюкозе).
Наиболее благоприятным является введение микроэлементов хрома и цинка «на векторе», т. е. в комплексе с веществами, обеспечивающими более высокую проницаемость через биомембрану и доставку к необходимому органу. ДКВ, проявляющий Р-витаминное действие, способствует повышению чувствительности и проводимости зрительного нерва [2], может служить таким «вектором». Ионы хрома и цинка могут образовывать с ДКВ флавонолятные комплексы, способные оказывать как положительное, так и отрицательное влияние на антиоксидантную активность.
В неферментативных реакциях активирующие и ингибирующие эффекты комплексных соединений металлов с флаво-ноидами вызваны также действием биогенных лигандов на ионы металлов.
В этом плане представляют интерес аспарагинаты хрома и цинка, имеющие в качестве лиганда аспарагиновую кислоту ^-аминоянтарная кислоту - НООССН2СН^^)СООН) и способные взаимодействовать с ДКВ, образуя сложные флавоно-лятные комплексы металлов, включающие в качестве лигандов
аспарагинатион.
тг.мН/м
Ао нм2/молекула
Рис. 2. а), б) Изотермы сжатия -п=^Ао) монослоя лецитина над водной субфазой.
Образование флавонолятных комплексов хрома и цинка в реакционной смеси подтверждается снижением поверхностного натяжения реакционных смесей за счет высвобождения свободной аспарагиновой кислоты, изменениями в УФ-спектрах растворов и ИК-спектрах твердых осадков.
Иммобилизация компонентов комплексов биомембранами была исследована на моделях ленгмюровских № 3 июнь 2008 МЕДИЦИНСКИЙ АЛЬМАНАХ
Проведенные нами исследования, а также анализ литера-
монослоев лецитина и жирных кислот на границе вода-воздух.
Нерастворимые монослои получают нанесением известного количества лецитина или жирной кислоты в хлороформе на поверхность воды (субфазу). Анализируют зависимость ф=КАо), измеряя площадь поверхности А при сжатии монослоя и возникающее при этом поверхностное давление равное (70-7), где 70 и 7 - поверхностное напряжение на границе раздела воздух-вода без монослоя и с монослоем вещества, соответственно.
Аналитической характеристикой является величина молекулярной площади А0, равная площади одной молекулы в плотно-упакованном монослое. Ао рассчитывают экстраполяцией кривой ф=КА) в точку ф=0.
В качестве субфазы при формировании ленгмюровских монослоев использованы водные растворы ДКВ и аспарагина-тов металлов.
На рисунке 2 представлена изотерма сжатия ф=КАо) монослоя лецитина на водной субфазе (кривая 1). Экстраполяционная величина Ао лецитина равна 0,54±0,02 нм2/молекула.
В присутствии аспарагинатов металлов молекулярная площадь Ао лецитина увеличивается (рис. 2а, б). Максимальное увеличение Ао наблюдается при совместном присутствии ДКВ и аспарагинатов металлов в субфазе (рис. 2а, б).
Полученные результаты свидетельствуют об иммобилизации в монослой лецитиносоставляющих комплекса (явление пенетрации), причем ДКВ значительно усиливает пенетрацию, а, следовательно, и проницаемость аспарагинатов металлов в липидные фрагменты биомембран.
№ Субфаза Ао, нм2
1 Нг0 0,54(±0,02)
2 ДКВ, С=5»10-5 М 0,60(±0,02)
3 Сг^р)3 С=2»10-‘ М 0,63(±0,02)
4 Сг^р)з + ДКВ 0,83(±0,02)
5 Zn(Asp)z, С=2»10-5М 0,70(±0,02)
6 Zn(Asp)z+ ДКВ 0,92(±0,03)
7 Zn(Asp)z+Crz(Аsp)з + ДКВ 0,89(±0,03)
Отмечено усиление пенетрации аспарагинатов металлов и в гидрофильную мембрану в присутствии ДКВ. Этот эффект изучен на монослоях пальмитиновой (Сте) и арахиновой (С20) кислот - моделях гидрофильного фрагмента биомембраны. Молекулярная площадь Ао не зависит от природы кислоты, образующей монослой: Ао = 0,205±0,001.
При совместном действии ионов цинка и хрома и ДКВ, отмечается стабилизация монослоев жирной кислоты: Ао жирной кислоты в монослое над субфазой, содержащей ДКВ и ионы металлов, близко к Ао в монослое на поверхности воды. Действие флавонолятов металлов на монослой жирной кислоты более «мягкое», чем в случае лецитина (рис. 3).
Таким образом, на модели липофильного (лецитиновый монослой) и гидрофильного (монослой жирной кислоты) фрагментов биомембраны показана иммобилизация и пенетрация флавонолятных компексов хрома и цинка в липидные слои и стабилизация гидрофильной части мембраны.
турных данных по дозам микроэлементов позволили предложить состав минерало-флавонолятного комплекса, включающего дигидрокверцетин, аскорбиновую кислоту, аспарагина-ты Zn2+ и Сг3+, для лечения диабетической ретинопатии и других заболеваний зрительного аппарата, зарегистрированного под товарным знаком «Офтальвит» (НПП «Росбиопром», г. Саров Нижегородской области).
Ао, Д2/молекула
26
- ■ ДКВ
с г гп
Рис. 3. Молекулярная площадь Ао пальмитиновой кислоты в монослоях над субфазой, содержащей ДКВ и соли металлов.
Клинико-лабораторная оценка минерало-биотического комплекса «Офтальвит», проведенная на базе больницы № 35 под руководством проф. Конторщиковой К.Н., подтвердила его эффективность при лечении больных с заболеванием глаз. У больных, принимавших предлагаемый комплекс в течение 20 дней по 5 капсул в день, средние уровни показателей свободнорадикального окисления по данным хемилюминесценции у больных, принимавших «Офтальвит», по сравнению с контролем не отличались от нормы. Наблюдалось достоверное снижение первичных продуктов перекисного оксиления липидов - диеновых и триеновых конъюгатов на 24 и 41% соответственно. Концентрация конечных продуктов ПОЛ - оснований Шиффа в конце курса приема препарата по сравнению с контрольной группой снизилось на 46%. Стандартная терапия, проводимая в группе контроля, подобного улучшения антиоксидантного статуса не дала.
Использование ДКВ как «вектора» доставки ЛС, основанного на иммобилизации и пенетрации ДКВ в липидные слои, изучено на везикулярных системах. Этот эффект продемонстрирован на примере фосфорилированных метанофуллере-нов [13], молекулы которых имеют большие размеры Ао«1 нм2 и проявляют высокую биологическую активность, но не образуют самостоятельно везикулярных структур.
Введение ДКВ в неводный раствор фосфорилированных метанофуллеренов и лецитина позволяет получить устойчивые везикулы (рис. 4). Критерием проницаемости в этом случае служит скорость перехода вещества, инкапсулированного № 3 июнь 2008 МЕДИЦИНСКИЙ АЛЬМАНАХ
в везикулы из внешней водной фазы во внутреннюю.
Проницаемость оценивали по коэффициенту пропускания Т% в видимой области спектра и мутности.
4 ткгт
251,80 пт
I
0,00 пт
2mki
0 mki
0 ткт
2 ткт
4 ткт
Рис. 4. Визуализация везикул, содержащих комплекс ДКВ и фос-форилированного метанофуллерена методом атомно-силовой микроскопии. В правом углу приведено изменение толщины липидного слоя в везикулах.
Отмечалось уменьшение коэффициента пропускания при \=476 нм с 72 до 5%, что наряду с данными атомно-силовой микроскопии (рис. 4) является одним из доказательств проницаемости комплекса фосфорилированного метанофуллерена с ДКВ через бислойную мембрану.
Таким образом, нами показана возможность использования простых искусственных моделей для изучения и прогнозирования воздействия ЛС на биосистемы на примере флавоно-лятных комплексов. Эффективная иммобилизация и пенетра-ция дигидрокверцетина и его комплексов с аспарагинатами металлов, фуллеренами и другими лекарственными веще-
ствами позволило сформулировать практические рекомендации для создания новых лекарственных средств.
ЛИТЕРАТУРА
1. Геннис Р. Биомембраны: Молекулярная структура и функции. М.: Мир, 1997. 624с.
2.Колхир В.К., Тюкавкина Н.А., Быков В.А. Диквертин - новое антиокси-дантное и капилляропротекторное средство. Хим.-фарм. журн 1995; 9: 61.
3.Тюкавкина Н.А., Руленко И.А., Колесник Ю.А. Природные флавоноиды как пищевые антиоксиданты и биологически активные добавки. Вопросы питания 1996; 2: 33-38.
4. Middleton, E.J., Kandaswami, C., Theoharides, T.C., The Effects of Plant Flavonoids on Mammalian Cells: Implications for Inflammation, Heart Disease, and Cancer. Farmacol. Rev., 2000. Vol. 52: 673-751.
5.Haraguchi H., Ohmi I., Fukuda A., Tamura Y., Mizutani K., Tanaka O., Chou W.H. Inhibition of aldose reductase and sorbitol accumulation by astilbin and taxifolin dihydroflavonols in Engelhardtia chrysolepis. Biosci. Biotechnol. Biochem. 1997; 61; 4: 651-654.
6. Ильюченок Т.Ю., Хоменко А.И., Фригидова Л.М. Фармакологические и радиозащитные свойства некоторых производных 7-пирона (флаваноны и флаванолы). Фармакология и токсикология 1975. 38; 5: 607-611.
7. Bakay M., Mucsi I., Beladi I., Gabor M. Effect of flavonoids and related substances. II. Antiviral effect of quercetin, dihydroquercetin and dihydrofisetin Acta Microbiol. Acad. Sci. Hung. 1968. 15; 3: 223-227.
8. Agullo G., Gamet-Payrastre L., Manenti S., Viala C., Remesy C., Chap H., Payrastre B. Relationship between flavonoid structure and inhibition of phosphatidylinositol 3-kinase: a comparison with tyrosine kinase and protein kinase C inhibition. Biochem. Pharmacol 1997. 53; 11: 1649-1657.
9. Liao K, Yin M. Individual and combined antioxidant effects of seven phenolic agents in human erythrocyte membrane ghosts and phosphatidylcholine liposome systems: importance of the partition coefficient. J. Agric. Food Chem. 2000; 48; 6: 2266-2270.
10. Бабак В.Г. Коллоидная химия в технологии микрокапсулирования: В 2-х ч. Свердловск: Изд-во Урал. ун-та; 1991; 1: 171.
11. Еськин А.П., Левандский В.А., Полежаева НИ. Метод количественного
фотометрического определения дигидрокверцетина. Химия растительного сырья. 1998; 3: 41-46.
12. Регистрационное удостоверение Минздрав РФ № 001384.Р.643.01.2000 на БАД «Антоксид» (ООО Фармтех).
13. Melnikova N.B., Gubanova N.V., Kulikov M.N., Nuretdinov I.A.,Gubskay V.P., Bererhaya L.Sh., Zorin A.D. Infiuence of Cu2+-ions on monolayer stability in an aqueous subphase and vesicle self-organijation on the basis of the phosphorylated methanofullereue-lerithin system. Mendeleev Commun. 2004. 225-227.
