CC BY
126
Химия растительного сырья. 2001. №4. С. 25-33.
УДК 543.544:543.80
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ДИГИДРОКВЕРЦЕТИНА С ИОНАМИ МЕТАЛЛОВ В ВОДНЫХ РАСТВОРАХ ИХ СОЛЕЙ И В ИЗОТОНИЧЕСКИХ МЕДИЦИНСКИХ СРЕДАХ
© Н.Б. Мельникова', И.Д. Иоффе
Нижегородский государственный технический университет, ул. Минина,
24, Нижний Новгород, 603600 (Россия) e-mail: melnikov@nntu.sci-nnov.ru
Методами электронной спектроскопии изучен процесс комплексообразования дигидрокверцетина с ионами Na+, K+, Mg2+, Cu2+ в водных растворах их солей, в буферных растворах с рН от 1,89 до 9,28 и изотонических медицинских средах.
Установлено влияние природы металла, рН среды, поверхностно-активных веществ и концентрации солей металлов на структуру, растворимость и стабильность комплексов в растворе.
Показана возможность создания новых форм фитопрепарата на основе дигидрокверцетина.
Введение
Дигидрокверцетин является ценным оптически активным антиоксидантом растительного происхождения. Область использования этого соединения в пищевой, косметической, фармацевтической промышленности непрерывно расширяется [1-5]. Так, дигидрокверцетин хорошо зарекомендовал себя как консервант плодово-ягодных соков [6, 7], сухого молока, кондитерских изделий, жиров, как компонент лекарственных фитопрепаратов, обладающих капилляро-, радио-, гепато- и онкопротекторной активностью [2-5].
При создании новых лекарственных форм препаратов, косметических и пищевых средств на основе дигидрокверцетина необходимо учитывать его совместимость и взаимодействие с другими компонентами. Одним из факторов, определяющих эффективность действия дигидрокверцетина в биологической среде, является присутствие ионов металла. В частности, в комплексе с ионами металлов дигидрокверцетин может оказывать действие на клетки иммунной системы от прямого до прямо противоположного, в зависимости от концентрации ионов металлов [8]. Антиоксидантная защита аскорбиновой кислоты в соке черной смородины дигидрокверцетином проявляется только в присутствии ионов меди [6, 7].
Настоящая работа посвящена исследованию взаимодействия дигидрокверцетина с ионами Na+, K+, Mg2+ и Cu2+ в водных растворах их солей и в изотонических медицинских средах, содержащих эти ионы.
Информация о механизме взаимодействия ионов металлов и дигидрокверцетина позволит объяснять и предсказывать биохимическое действие компонентов лекарственных форм при их совместном присутствии.
* Автор, с которым следует вести переписку.
Структурная формула дигидрокверцетина (2,3-дигидро-3,5,7-тригидрокси-2-[3',4'- дигидроксифенил]-4H-1 -бензопиран-4-он):
ОН
Экспериментальная часть
Дигидрокверцетин 98% чистоты, полученный из измельченной древесины лиственницы (торговая марка «Биоскан С») был предоставлен ООО «Росбиопром» (г. Саров Нижегородской области). Реагент был дважды перекристаллизован из смеси этилового спирта и воды, высушен до постоянной массы. Соли металлов (хлориды натрия и калия, сульфат магния и ацетат меди (II)) соответствовали марке ч.д.а. Для спектральных исследований был использован абсолютный спирт. Медицинские изотонические растворы были товарными. Универсальные буферные растворы (ацетатно-фосфатно-боратная смесь) готовили в соответствии с [9]. pH буферных растворов были установлены с помощью микропроцессорного рН-метра «рН 320 SET» фирмы «Wissenschaftlich-Technische-Werkstätten GmbH».
Электронные спектры были записаны в области 200-500 нм в кварцевых кюветах на UV-Vis спектрофотометре «Specord M-40» фирмы Карл Цейс Йена (DDR). Спектры записывались как в сравнении с бидистиллированной водой, так и в сравнении с медицинской средой и с растворами солей металлов. Толщина слоя кювет d = 1 см.
Растворимость дигидрокверцетина оценивалась в термостатируемых ячейках при температуре 20±0,5°С при периодическом контроле концентрации дигидрокверцетина спектрофотоколори-метрическим методом цианидинхлоридной пробы [10] и анализом УФ-спектров в области Xmax = 290 нм в соответствии с калибровочным графиком. Цианидинхлорид был получен обработкой аликвоты раствора дигидрокверцетина объемом 5 мл смесью, состоящей из концентрированной соляной кислоты, квалификации о.с.ч., ледяной уксусной кислоты (о.с.ч.) и воды в соотношении 3 : 3 : 1 (об.%), 0,2 г цинковой пыли (ч.д.а.), при температуре 50°С в течение 1 минуты. Калибровочный график и текущие анализы дигидрокверцетина были выполнены при 550 нм на спектрофотометре СФ-46.
ИК-спектры исследуемых образцов были получены на ИК-спектрометре «Perkin-Elmer 180» в области 3200-500 см-1 в виде смесей с бромистым калием при концентрации изучаемых веществ в смеси 0,1-0,3%, а также в тонкой пленке вазелинового масла.
Обсуждение результатов
В целях создания новых лекарственных форм на основе дигидрокверцетина нами изучена его растворимость в изотонических растворах медицинского назначения, таких как «гемодез», «хлосоль», «дисоль», «реополиглюкин», «глюкоза», а также в бидистиллированной воде и смеси спирт-вода (табл.1).
Исходный кристаллический дигидрокверцетин общей формулой 2 С15Н12О7-5Н2О [11] представлял собой беловато-серый порошок. Разбавленные водные растворы практически бесцветны, но по мере достижения концентрации насыщения и при хранении (более трех суток) все растворы приобретают желтый цвет, интенсивность которого увеличивается во времени. В изотонических растворах гемодеза и хлосоли окраска приобретает интенсивный оранжево-красный тон. Поскольку гемодез и реополиглюкин
содержат высокомолекулярные ПАВ, то, соответственно, растворение в них дигидрокверцетина имеет коллоидно-химический характер.
Из данных таблицы 1 следует, что растворимость дигидрокверцетина (от 5 до 36 мг/10 мл) удовлетворяет требованиям ампульной лекарственной формы фитопрепарата. Следует отметить, что в аэробных условиях при критической концентрации (предел растворимости) с течением времени в растворе происходят сложные химические и биохимические процессы, вероятно, имеющие близкую химическую природу к конденсации катехинов [12], приводящие к образованию в растворе мути, волокон, нитей.
В УФ-спектрах всех растворов наблюдаются существенные изменения полосы хромонового фрагмента Хтах = 290 нм как по интенсивности, так и по ее положению. Кроме того, в ряде растворов отмечались изменения в области 200-240 нм в области 320-330 нм. Наибольшие изменения в области 320-330 нм происходят в растворах хлосоли, дисоли и физиологического раствора хлорида натрия, являющихся сильными электролитами (рис. 1 б, кривые 2-4). В коллоидных растворах и в растворах слабых электролитов (вода-спирт, бидистиллированная вода) эти изменения незначительны (рис. 1 а, кривые 1, 6-8).
Вероятным объяснением таких различий может быть реакция взаимодействия ионов щелочных и щелочноземельных металлов К+, №+, Са2+, М^2+ со слабой кислотой - дигидрокверцетином в растворе с образованием внутримолекулярных комплексных соединений типа фенолятов или хелатов [13]. Второй вероятной причиной возникновения новой полосы в области 325 нм является гидроксилирование дигидрокверцетина в аэробных условиях до дигидрогоссипетина (2,3-дигидро-3,5,7,8-тетрагидрокси-2-[3',4'-дигидроксифенил]-4Н-1-бензопиран-4-он) в присутствии ионов металлов. Реакция гидроксилирования, как утверждают авторы работы [14], может протекать как энзиматическим путем, так и в аэробных условиях в присутствии ионов металлов.
Таблица 1. Растворимость и устойчивость растворов дигидрокверцетина в различных медицинских средах
№ Среда Состав водной среды Растворимость дигидрокверце тина при 20° С, Характеристика среды, хранящейся в аэробных условиях в течение двух месяцев
Соль металла, г/л Другие компоненты, г/л г/л цвет вид нерастворимой в воде части
1 Бидистиллированная вода, рН 6,4 — — 1,5±0,5 Желтый Волокнистые структуры
2 Физиологический раствор хлорида натрия NaCl - 9,0 1 М трис-НСІ до рН 5,0-7,5 3,4±0,6 Коричнево- желтый Пушистый мягкий осадок
3 Хлосоль CH3COONa - 3,6; NaCl - 4,75; KCl - 1,5 0,7±0,1 Оранжево- желтый II II II
4 Дисоль NaCl — 0,5±0,1 Темно- оранжевый II II II
5 Гемодез NaCl - 5,5; KCl - 0,42; MgCl2 - 0,005; CaCl2 - 0,5 Поливинил-пирролидон - 60 0,5±0,1 Красновато- оранжевый Осадок
6 Реополиглюкин NaCl - 0,9 Декстран -10 3,6±2,0 Желтый Пушистый осадок
7 Глюкоза NaCl - 0,26 0,1 М трис-НСІ до рН 3,0 - 4,0; глюкоза -100 0,9±0,1 Желтый Поршок
8 Спирт-вода - С 2 Н 5 ОН - 400 2,0±1,0 Светло- желтый Хлопья и нити
D, отн. ед.
Рис. 1. УФ-спектры поглощения растворов дигидрокверцетина в медицинских средах (среда - этанол сравнения) после двух месяцев хранения
№ кривой (рис.) Среда С, М-105 № кривой (рис.) Среда С, М-105
1 (а) вода 6,7 2 (б) Физиологический 5,8
6 (а) Реополиглюкин 1,7 раствор
7 (а) глюкоза 0,6 3 (б) Хлоросоль 4,5
8 (а) этанол - вода 3,4 4 (б) Дисоль 4,9
Для исследования механизма комплексообразования нами проведено детальное исследование поведения дигидрокверцетина в воде, в водном растворе универсальных буферных смесей, а также при различных рН и в водных растворах солей металлов, основных компонентов медицинских изотонических растворов.
В бидистиллированной воде (рН 6,4) дигидрокверцетин как слабая кислота [13] способен частично диссоциировать и образовывать внутримолекулярные комплексы вида:
ОН ОН
Схема 1. Вероятные структуры внутримолекулярных комплексов дигидрокверцетина в водном растворе
Анализ УФ-спектров поглощения дигидрокверцетина в воде показывает, что отношение интенсивностей поглощения анализируемых полос (max = 288 нм и Xmax = 323 нм) практически не изменяется во времени и не зависит от концентрации вещества:
К = °288нм = 2,95 ± 0,25 .
D323hm
Однако отношение интенсивностей анализируемых полос существенно изменяется при переходе от воды к универсальным буферным растворам с различным рН (рис. 2 а, б).
D, отн. ед. D, отн. ед.
230 260 290 320 350 Х.НМ 230 260 290 320 350 Х.НМ
Рис. 2. УФ-спектры поглощения растворов дигидрокверцетина при С = 1,83-10 5 М в универсальной буферной смеси при pH: 1 - 1,81; 2 - 3,29; 3 - 6,80; 4- 9,62
На спектре дигидрокверцетина при рН 1,81 и рН 3,29 вторая полоса имеет незначительную интенсивность поглощения (рис. 2 а), аналогично УФ-спектру дигидрокверцетина в спиртовом растворе. В отличие от этого при рН 6,86 и рН 9,62 интенсивность второй полосы возрастает почти в три раза по сравнению с интенсивностью поглощения в бидистиллированной воде: К = 0,92±0,1 (рис. 2 б).
Эти результаты являются косвенным подтверждением схемы 1, предполагающей равновесное существование структур (II), (III), (IV) со структурой дигидрокверцетина (I).
Для более детального исследования механизма взаимодействия дигидрокверцетина с ионами металлов и выявления числа компонентов в изучаемых растворах нами проанализированы концентрационные зависимости В = /(СМеп+) в интервале концентрации соли от 0,02 М до 1 М раствора при постоянной концентрации дигидрокверцетина С = 3,28-10-5М (рис. 3, табл. 2).
Как следует из представленных данных, интенсивность поглощения частиц в растворе является функцией концентрации соли металла и времени хранения раствора. Появление общей точки пересечения серии спектральных кривых - изосбестической точки (рис. 3) при X = 300 нм может служить одним из доказательств двухкомпонентности системы [15]. Найденное значение длины волны (300 нм) и интенсивности поглощения Ботн. ед. = 0,425 в изосбестической точке практически совпадает с точкой пересечения спектральных кривых, снятых при рН 6, 80 и рН 9, 62 (рис. 2 б).
Таблица 2. УФ-спектральная характеристика дигидрокверцетина в 1 М водных растворах чистых солей металлов. Сдкв -const = 3,28-10-5 М
Соль металла Отношение интенсивностей К К D298hm D328hm Длительность проведения опыта
NaCl 1,27 20 мин
NaCl 1,09 1 сут.
NaCl 1,02 8 сут.
NaCl 0,98 2 месяца
KCl 2,37 20 мин
KCl 2,07 1 сут.
KCl 1,53 1 месяц
MgSO4 2,97 20 мин
MgSO4 2,80 8 сут.
MgSO4 Отсутствие поглощения в области 270-330 нм 2 месяца
Рис. 3. УФ-спектры поглощения ДКВ (СдКВ = 3,2840-5 М) в водном растворе хлорида натрия; Сша, M: 1 - 0,02 М; 2 -
0,09 М; 3 - 0,18 М; 4 - 0,54 М; 5 - 1 М
Полученные данные для поведения дигидрокверцетина в водных растворах хлорида натрия свидетельствуют о большей вероятности реализации схемы образования комплексного соединения дигидрокверцетина с ионами натрия по схеме, аналогичной схеме 1, чем по механизму гидроксилирования дигидрокверцетина (схема 2):
Х-анион соли
Схема 2. Вероятные структуры продуктов реакции взаимодействия ионов металлов с дигидрокверцетином
Данные потенциометрического титрования слабой кислоты дигидрокверцетина в неводной среде (ацетон, диметилформамид) органическими основаниями [13] позволяют рассматривать гидрокси-группу в положении 3 как наиболее реакционноспособную и, соответственно, равновесные структуры (V), (VI), (VII) как наиболее предпочтительные для образования комплексного соединения с ионами одновалентных металлов.
Для солей двухвалентных металлов следует ожидать либо комплексов фенолятного типа VIII, либо образования димерных структур, в которых две молекулы флавонола вовлечены в комплексное соединение. Такие структуры известны для комплексов меди с кверцетином IX [16].
Конечным продуктом реакции взаимодействия ионов Cu2+ с кверцетином в присутствии кислорода воздуха авторы работы [17] считают хиноидные соединения типа X.
ОН
(X), [17]
Взаимодействие дигидрокверцетина с ионами магния происходит с большим индукционным
,,»4 « К _ ^288 нм
периодом (2 месяца), в течение которого не происходит визуальных изменений, а величина К _ ^-----
-^323нм
остается практически неизменной (табл. 2). Быстрое выпадение объемного осадка после индукционного периода приводит к исчезновению полос в области 270 - 330 нм: интенсивность поглощения Б288 нм и 0325 нм падают до 0,07 и 0,03 при соответствующих первоначальных значениях 0,550 и 0,185; цианидинхлоридная проба также показывает исчезновение дигидрокверцетина в растворе.
Принципиально другой характер имеет природа взаимодействия дигидрокверцетина с ионами меди (II): в водном растворе ацетата меди (II). При малых концентрациях дигидрокверцетина (СдКв = 3,28^10-5 М) и мольном соотношении дигидрокверцетин : Си(СН3СОО)2 от 1 : 1 до 1 : 6 в растворе образуются комплексы меди ярко-желтого цвета. В УФ-спектре реакционной смеси наблюдаются батохромный сдвиг до 10 нм (Хшах = 300 нм) и изменение интенсивности поглощения при Хтах = 300 нм при увеличении доли соли меди (рис. 4). Следует отметить одновременное изменение электронного спектра реакционной смеси в видимой области спектра: интенсивность полосы поглощения с Хтах = 780 нм (область поглощения гидратированного иона меди в Си(СН3СОО)2) убывает при увеличении доли дигидрокверцетина (рис. 4 а).
Уменьшение интенсивности поглощения комплекса дигидрокверцетина меди происходит при указанной концентрации медленно и непрерывно (рис. 4 б). По истечении двух месяцев выпадает коричневый осадок комплекса меди. При увеличении концентрации исходных компонентов эта реакция протекает почти моментально.
После промывки образующегося осадка водой и спиртом для удаления следов исходных веществ, сушки осадка на воздухе до постоянного веса продукт реакции был охарактеризован ИК-спектроскопическим методом анализа (табл. 3).
Новый продукт по данным ИК-спектроскопии характеризуется появлением новых интенсивных полос - 1570 см-1 ^а8), 1540 см-1 ^а8) и 1440 см-1 ^а8). По сравнению с исходным Си(СН3СОО)2 эти полосы, соответствующие валентным колебаниям карбоксилат-иона, смещены на 50 см-1 (1620-1615 см-1, 1590 см-1).
2+
Таблица 3. Данные ИК-спектров продукта реакции ацетата меди с дигидрокверцетином
Область поглощения, см-1 Длина волны,см 1
Исходный дигидрокверцетин Продукт реакции
1760-1520 1660-1650 (сильн.) (слаб.),
1570 (сильн.).
1440-1220 1390 (ср.), 1325 (слаб.), 1290 (ср.) 1390 (сильн.),1290 (ср.), 1270 (слаб.),
1440 (сильн.)
1200-1015 1185-1180 (сильн.), 1140 (слаб).,1105 (слаб.) 1185-1180 (ср.),1105 (сред.)
Примечание. Интенсивность поглощения сильн. - сильная; ср. - средняя; слаб. - слабая.
Рис. 4. УФ-спектры поглощения водных растворов реакций ДКВ с Cu2+. а, б)
= const = 3,28-10-5, т = 0; 1 - ДКВ; 2 -[ДКВ] : [Cu2+] = 1 : 1; 3 - [ДКВ] : [Cu2+] = 1 : 3; 4 [ДКВ] : [Cu2+] = 1 : 6; в) [ДКВ] : [Cu2+] = 1 : 6; 4' -т = 0; 4'' - т = 7 сут.; 4''' - т = 2 месяца
Содержание меди в комплексе по результатам анализа с бицинхониновой кислотой в 2% КОН составляет 10±1%. Полученные нами данные хорошо согласуются с образованием бис-флавоноидных комплексов меди аналогично структурам IX, комплексов меди с кверцетином [1б].
Таким образом, можно отметить, что взаимодействие дигидрокверцетина с ионами металлов обусловливает образование различных структур комплексов, определяющихся природой иона металла.
Выводы
Методами электронной спектроскопии (по отношению интенсивности поглощения и в серии пересекающихся кривых с Xmax = 290±2 нм и Xmax = 325±2 нм в изосбестической точке) подтверждено образование внутримолекулярных комплексов дигидрокверцетина с ионами натрия, калия и магния в водных растворах их солей.
Показано, что процесс комплексообразования подавляется в кислой среде (рН<3,8), в присутствии поверхностно-активных веществ (поливинилпирролидон, декстран, глюкоза, спирт) и интенсифицируется в присутствии сильных электролитов.
Определена растворимость дигидрокверцетина в изотонических медицинских средах и оценена стабильность образующихся растворов. Высказано предположение о факторах, определяющих агрегативную устойчивость медицинских сред.
Изучена реакция взаимодействия ацетата меди (II) с дигидрокверцетином в водной среде. Показано, что образование комплексов меди с дигдрокверцетином в растворе сопровождается батохромным
сдвигом полосы поглощения с Xmax = 290±2 нм до Xmax = 300±2 нм, положение которой и интенсивность зависят от соотношения компонентов, времени проведения процесса, а также полным исчезновением второй полосы с Xmax = 325±2 нм. Структура нерастворимого в воде осадка как комплекса меди с дигидрокверцетином установлена ИК-спектральным анализом.
Список литературы
1. Тюкавкина Н.А., Руленко И.А., Колесник Ю.А. Природные флавоноиды как пищевые антиоксиданты и биологически активные добавки // Вопросы питания. 1996. №2. С. 33-38.
2. Патент №2014841 Россия. Антиоксидантное, капилляропротекторное, противовоспалительное и
антигистаминное средство / С.Я. Соколов, Н.А. Тюкавкина, В.К. Колхир и др. // Б.И. №12. 1994.
3. Колхир В.К., Тюкавкина Н.А., Быков В.А. и др. Диквертин - новое антиоксидантное и капилляропротекторное средство // Химический фармацевтический журнал. 1995. №9. С. 61.
4. Kandaswami C., Perkins E., Dizewiecki G., Soloniuk D.S., Middleton E. Jr. Differential inhibition of proliferation of
human squamous cell carcinoma, gliosarcoma and embryonic fibroblast - like lung cells in culture by plant flavonoids //
Anticancer Drugs. 1992. Vol. 3(5). P. 525-530.
5. Ильюченок Т.Ю., Хоменко А.И., Фригидова Л.М. и др. Фармакологические и радиозащитные свойства некоторых производных гамма-пирона (флаваноны и флаванолы) // Фармакология и токсикология. 1975. Т. 38. №5. С. 607.
6. Clegg K. Mary, Marton A.D. Phenolic compounds of black currents juice and their role as conservant of ascorbic acid // J. Food Technol. 1968. Vol. 3(3). P. 277-284.
7. Harper, Kevan A., Morton A.D., Roffe E. Phenolic compounds of black currents juice and their protective action on ascorbic acid. Mechanism of oxidation of ascorbic acid and its inhibition by flavonoids // J. Food. Technol. 1969. Vol. 4(3). P. 255-267.
8. Jung G., Hennings G., Pfeifer M., Bessler W.G. // Mol. Pharmacol. 1983. Vol 23(3). P. 698-702.
9. Лурье Ю.Ю. Справочник по аналитической химии. М., 1989. С. 275.
10. Еськин А.П., Левандский В.А., Полежаева Н.И. Метод количественного фотометрического определения дигидрокверцетина // Химия растительного сырья. 1998. №3. С. 41-46.
11. Селиванова И.А., Тюкавкина Н.А., Колесник Ю.А. и др. Исследование кристаллической структуры дигидрокверцетина // Химический фармацевтический журнал. 1999. №1. С. 51-53.
12. Запрометов М.Н. Биохимия катехинов. М., 1964. 295 с.
13. Кемертелидзе Э.П., Георгиевский В.П. Физико-химические методы анализа некоторых биологически активных веществ растительного происхождения. Тбилиси, 1976. 222 с.
14. Jeffrey A.M., Knight M., Evans W.C. The bacterial metabolism of flavonoids: hydroxylation of taxifolin // The reports of proceeding of the Society for General Microbiology published in J. Microbiology. 1969. Vol. 56(3) P. T-163.
15. Берштейн И.Я., Каминский Ю.Л. Спектрофотометрический анализ в органической химии. Л., 1975. 230 с.
16. Balogh-Hergovich E., Kaizer J., Speier G. Kinetics and mechanism of the Cu (I) and Cu (II) flavonolate-catalyzed oxygenation of flavonol. Functional quercetin 2,3-dioxygenase models // J. Molecular Catalysis A: Chemical. 2000. Vol. 159. P. 215-224.
17. Brown J.E., Khord H., Hider R.C., Rice-Evans C.A. Structural dependence of flavonoid interactions with Cu2+ ions: implications for their antioxidant properties // Biochem. J. 1998. Vol. 330. P. 1173-1178.
Поступило в редакцию 10 июля 2001 г. После переработки 26 сентября 2001 г.
