CC BY
102
УДК 543.553:543.94:543.062
БИОСЕНСОР ДЛЯ ОДНОВРЕМЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЛЮКОЗЫ И ЛАКТАТА В ПОТЕ ЧЕЛОВЕКА
Ю.В. Плеханова, А.Н. Решетилов
Использовали ферментные биосенсоры, содержащие глюкозооксидазу (ГО) и/или лактатоксидазу (ЛО), для определения глюкозы и лактата в поте человека. Разработанные биосенсоры применили для анализа образцов пота, собранных у здоровых людей в условиях повышенной температуры окружающей среды без применения каких-либо стимулирующих потоотделение химических соединений. Разработали и провели необходимые тесты созданной для измерения пота открытой проточной системы. Показали, что биосенсоры измеряют концентрации глюкозы и лактата в сложной смеси и способны выполнять указанный вид анализа одновременно.
Ключевые слова: глюкозооксидаза, лактатоксидаза, печатные электроды, биосенсор, пот, проточная система сбора пота
Глюкоза и лактат являются важными показателями обмена веществ практически у всех живых организмов. В этой связи разработка устройств, в частности биосенсоров, для контроля за их содержанием в различных биологических жидкостях является актуальной задачей. Можно выделить одно из активно развиваемых направлений в настоящее время в диагностических технологиях - осуществление неинвазивных бескровных анализов [1, 2]. Для таких измерений вместо крови используют другие биологические жидкости, например слюну, пот, концентрация глюкозы и лактата в которых коррелирует с их концентрацией в крови [3-5]. В организме человека состав и объём пота может колебаться в широких пределах в зависимости от условий окружающей среды. В состав пота входят продукты минерального обмена, сернокислые соединения, фосфаты, хлористый калий, соли кальция, а также продукты белкового обмена: мочевина, молочная кислота, мочевая кислота, аммиак, некоторые аминокислоты, летучие жирные кислоты. Таким образом, пот может служить источником данных о количестве этих соединений в организме человека.
Ферментные методы определения аналитов, в том числе глюкозы и молочной кислоты (лактата), обеспечивают высокую специфичность, точность и воспроизводимость. Определение глюкозы и лактата с помощью ферментных биосенсоров основано на реакции ферментативного окисления глюкозы, либо лактата в присутствии растворенного кислорода: глюкоза + О2 —ГОД > глюконоваякислота + Н2 О2 (1) лактат + О2 —ЛОД > пируват + Н2 О2 (2)
В амперометрических биосенсорах, основанных на определении выделившегося в этих реакциях пероксида водорода, используется реакция его восстановления:
H2O2->O2 + 2H + + 2e- (3)
Значения рабочих потенциалов таких биосенсоров находятся в районе нулевого потенциала рабочего электрода, что позволяет снизить мешающее влияние восстановителей на отклик биосенсора [6].
Описано большое количество амперометрических ферментных биосенсоров для определения глюкозы [7] и лактата [8]. Но при анализе пота важен не только сам анализ концентрации глюкозы или лактата, но и разработка целых систем, позволяющих собирать и анализировать образцы биологических жидкостей, так называемых нательных сенсоров [1, 2]. Новое поколение недорогих, не оказывающих на окружающую среду заметного воздействия биосенсоров, должно заполнить разрыв между аналитическим набором инструментов, которые обычно применяются в медицинской практике, и потребностями пациента, для которого требуется простой по исполнению, располагаемый на поверхности кожи аппарат, поставляющий своевременную, клинически корректную и действенную информацию, получаемую по принципу беспроводной передачи с мобильной платформы.
Целью данной работы являлось создание ферментных биосенсоров для определения глюкозы и лактата и проверка их функционирования в сконструированной проточной системе сбора пота. В задачи входило тестирование системы при одновременном измерении аналитов в реальных образцах.
Материалы и методы
В работе использовали калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный, натрия гидроокись, хлорид калия, натрий хлористый, лактат, глюкозу, уксусную кислоту (ЗАО "МОСРЕАКТИВ", Россия); хлорид железа шестиводный FeCl3 х 6H2O, гексацианоферрат (III) калия K3[Fe(CN)6], соляную кислоту (Химмед, Россия); хитозан низкомолекулярный ("Sigma-Aldrich", США). Для создания биосенсоров были использованы препараты ферментов: лактатоксидаза из Pediococcus sp., лиофилизированная, активность 37 U/мг и глюкозоксидаза из Aspergillus niger, активность 185000 U/г (Sigma-Aldrich, США).
Основой биосенсора служили 3-контактные электроды, полученные матричной печатью (ООО «КолорЭлектроникс», Москва, Россия).
Осаждение берлинской лазури на поверхность рабочего электрода проводили из реакционной смеси состава: 0,1 М FeCl3 и 0,1 М K3[Fe(CN)6] в фоновом электролите 0,1 M KCl, 0,1 M HCl в соответствии с методикой, описанной в работе [6].
Для иммобилизации ферментов на поверхности электрода использовали 2 %-ый раствор хитозана в 1 %-й уксусной кислоте [9]. Содержание фермента на электроде составляло 7*10-4 мг/мм2.
Измерения проводили в кювете объемом 1 мл. В качестве базового раствора использовали 25 мМ калий-фосфатный буфер, рН 6,5, содержащий 10 мМ хлорида натрия. Объем вносимой пробы (глюкоза) составлял от 2 до 100 мкл. Для регистрации сигналов электрода использовали универсальный портативный потенциостат - гальваностат EmStat (PalmSens ВУ, Нидерланды). Измерения проводили по трехэлектродной схеме. Хроноамперометрические зависимости регистрировали при потенциале 0 мВ. Циклические вольт-амперные характеристики (ЦВА) регистрировали при скорости сканирования потенциала 3 мВ/с в диапазоне от 500 до - 500 мВ.
Результаты и обсуждение
Биосенсоры для определения глюкозы и лактата предполагалось использовать для анализа пота на содержание этих субстратов. Поскольку и глюкоза, и лактат находятся в поту одновременно, необходимо, чтобы каждый из биосенсоров реагировал только на свой субстрат и не зависел от присутствия другого субстрата. Измерения проводили при одновременном нахождении в одной измерительной кювете обоих видов биосенсоров и при одновременной регистрации сигнала с помощью двух потенциостатов. Измерения проводили в кювете на 5 мл. На рис. 1,а показана регистрация изменения уровня тока при введении в кювету глюкозы, лактата и смеси глюкозы с лактатом. На рисунке видно, что лактатный биосенсор не реагирует на введение глюкозы, также, как и глюкозный биосенсор не реагирует на появление в измерительной среде лактата. На рис. 1,б показана регистрация изменения уровня тока при одновременном введении в измерительную среду смеси глюкозы и лактата.
Таким образом, биосенсоры, содержащие ГО и ЛО способны измерять концентрации соответствующих субстратов в сложной смеси и способны работать одновременно с одной пробой.
На рис. 2,а показана градуировочная зависимость сигналов биосенсора с ЛО от концентрации лактата. Измерения проводили в стационарной кювете. Основные характеристики полученной зависимости представлены в табл. 1.
0,0 -
-0,2 -
го ср о
О
-0,8 -
-1,0
200
1 ; а ! б в
а*»!**
2 11 |
щЪЩ УР ■
5Ч1
400 600
Время, с
800
1000
0,4 0,2
<
:> 0,0
т О. -0,2
О о
X -0,4
<и
о
с; -0,6 ГО
^ -0,8 О
-1,0 -1,2
200 400 600
Время, с
800
а б
Рис. 1. Типичные виды сигналов глюкозного (1) и лактатного (2) биосенсоров на введение субстратов: а) - линиями показано введение
а -1 мМ глюкозы; б -1 мМлактата; в - смеси, содержащей 1 мМ глюкозы и 1 мМ лактата; б) - линиями а-г показано введение смеси, содержащей 0,1 мМ глюкозы и 0,1 мМ лактата
0,00 0,05 0,10 0,15 0,20
Концентрация лактата, мМ
1,2
3 1,0
а 0,8
о
к
и о о К ю н Й к
к о
0,6 -
0,4 -
0,2 -
0,0
0,25
1 2 3 4 5
Концентрация глюкозы, мМ
а б
Рис. 2. Градуировочные зависимости сигналов лактатного биосенсора от концентрации лактата (а) и глюкозоного биосенсора от концентрации глюкозы (б) в стационарной кювете
На рис. 2,б представлена градуировочная зависимость сигналов глюкозного биосенсора от концентрации глюкозы. Основные характеристики полученной зависимости представлены в табл. 1.
в
0
0
0
Таблица 1
Характеристики полученных ферментных биосенсоров
Фермент Лактатоксидаза Глюкозооксидаза
Параметры Значение
Уравнение, описывающее калибровочную зависимость, значения основных параметров уравнения V Sh V = max h, где KM + Sh' Vmax= 1; h = 1,25; KM = 0,12; R2=0,99 V Sh V = rx h, где kM + sh' Vmax= 1,40; h = 1,18; KM = 1,52; R2=0,99
Линейный диапазон детекции, мМ 0,04 - 0,16 0,1 - 1
Уравнение регрессии для линейного участка, значение коэффициента корреляции y = 3,282x + 0,091, R2 = 0,99 y = 0,563x + 0,004, R2 = 0,98
Коэффициент чувствительности, мкА/мМ 3,282 0,563
Минимальный предел обнаружения, мМ 0,02 0,13
Диапазон детекции, мМ 0,02 - 0,22 0,13 - 5
Коэффициент вариации, % 4,8 3,5
Для анализа реальных образцов пота была сконструирована и изготовлена открытая проточная система (ОПС) (рис. 3). При разработке этой системы во внимание были приняты конструкции, описанные в работах [10; 11]. Оригинальность подхода была основана на применении тока жидкости (пота), обусловленного гидростатическим давлением, которое создавалось за счет разности уровней в точках «вход» и «выход». Вторым оригинальным решением вопроса являлось введение в конструкцию флюидного канала (влагопроводящей дорожки), обеспечивающего равномерность тока жидкости.
Система имела вид картриджа, содержащего биосенсор, каналы подачи растворов и систему отбора пота. ОПС была выполнена на основе органической подложки (в данном случае использовали органическое стекло) и содержала канал-фиксатор для биосенсора, имеющий размер 10 мм х 65 мм х 0,5 мм и влагопроводящей дорожки с высоким уровнем гигроскопичности. Для этой цели использовали хроматографическую бумагу марки GF/A (фирма Whatman). Влагопроводящую дорожку
размещали в канале-фиксаторе в пространстве между поверхностью биосенсора и поверхностью кюветы (кожи).
Рис. 3. Вид открытой проточной системы, закрепленной на плече
добровольца
Образец пота подавали в систему ОПС на соответствующий биосенсор. По полученным калибровочным зависимостям определяли концентрацию глюкозы и лактата в поту.
Для анализа использовали образцы пота, собранные у здоровых людей в условиях повышенной температуры окружающей среды. Между измерениями образцы хранились в замороженном виде при температуре -20 °С. Данные образцы проверяли в двух системах измерения: в кюветной системе и в проточно-инжекционной системе.
На рис. 4 показано изменение сигнала лактатного биосенсора в кюветной системе при введении образца пота. Рассчитанное содержание лактата в данной пробе составило 33,56±0,46 мМ, при ошибке измерения равной 1,4 %.
Время, с
Рис. 4. Сигнал лактатного биосенсора при анализе пробы пота (моменты введения проб объемом 2 мкл показаны вертикальными
линиями)
На рис. 5 показано изменение сигнала лактатного биосенсора в проточно-инжекционной системе измерения при введении модельных образцов, содержащих лактат, и реальных образцов пота.
Рис. 5. Сигналы лактатного биосенсора при измерении в открытой проточной системе. Стрелками показано введение проб, содержащих
лактат, или образцов пота: 1 - 5 мкл 50 мМ лактата; 2, 3 - 2 мкл 50 мМ лактата; 4, 5 - 2 мкл 5 мМ лактата; 6, 7 - 2 мкл образца № 4; 8,
9 - 2 мкл образца № 1
В табл. 2 и 3 представлены полученные данные по анализу образцов пота на содержание лактата и глюкозы. Измерено 6 образцов пота, отобранных в разное время у разных людей.
Таблица 2
Содержание лактата в пробах пота, измеренное с помощью
лактатного биосенсора
Номер Сигнал, Концентрация Разбавление, Концентрация
пробы нА в кювете, мМ раз в пробе, мМ
1 154,89 0,076 19,0
2 92,94 0,0552 13,8
3 58,27 0,0388 9,7
4 244,47 0,116 250 29,0
5 333,69 0,1808 45,2
6 266,27 0,1284 32,1
Примечание: в таблице приведены средние значения по 5 измерениям.
Таблица 3
Содержание глюкозы в пробах пота, измеренное с помощью глюкозного
Номер пробы Сигнал, нА Концентрация в кювете, мМ Разбавление, раз Концентрация в пробе, мМ
1 25 0,12 0,6
2 15 0,08 0,4
3 15 0,08 5 0,4
4 20 0,09 0,45
5 25 0,12 0,6
6 20 0,09 0,45
Примечание: в таблице приведены средние значения по 5 измерениям.
В заключение следует отметить, что уровень сигнала разработанных биосенсоров в ОПС не зависел от объема пробы, а зависел только от концентрации определяемого вещества (рис. 5). Время жизни лактатного и глюкозного биосенсоров было не менее 6 месяцев. При этом за указанный период наблюдали снижение сигналов биосенсоров, основанное на снижении активности ферментов. Сигнал глюкозного биосенсора через 6 месяцев составлял 13 % от исходного значения. Сигнал лактатного биосенсора через 6 месяцев составлял 60% от исходного значения. При измерении реальных образцов установили, что содержание лактата и глюкозы в реальных образцах пота составляет величины, по диапазону равные от 9 до 45 и от 0,4 до 0,6 мМ, соответственно, что согласуется с литературными данными. Полученные результаты являются новыми и создают основу для разработки биосенсоров для анализа лактата и глюкозы в организме человека с учетом особенностей применения в составе неинвазивной нательной биосенсорной платформы.
Работа выполнена при поддержке проекта «Исследование научно-технических решений и разработка интеллектуальной нательной биосенсорной платформы превентивного мониторинга и оценки показателей организма человека «Сенсорная сеть тела» с возможностью коррелирования данных, полученных от различных датчиков в зашумленной среде», 2016-14-579-0009-456, Министерство образования и науки Российской Федерации.
Список литературы
1. Neethirajan S. Recent advances in wearable sensors for animal health management // Sensing and Bio-Sensing Research. 2017. V. 12. P. 15-29.
2. Enzyme biosensors for biomedical applications: strategies for safeguarding analytical performances in biological fluids. Review / G. Rocchitta, A. Spanu, S. Babudieri [et al]. // Sensors. 2016. V. 16. P. 780-800.
3. Cotton fabric-based electrochemical device for lactate measurement in saliva / R.S.P. Malon, K.Y. Chua, D.H.B. Wicaksono [et al]. // Analyst. 2014. V. 139. № 12. C. 3009-3016.
4. Relationship between lactate concentrations in active muscle sweat and whole blood / D.A. Sakharov, M.U. Shkurnikov, A.G. Tonevitsky, [et al]. // Bull. Experim. Biol. Med. 2010. V. 150. № 1. C. 83-85.
5. Correlation between sweat glucose and blood glucose in subjects with diabetes / J. Moyer, D. Wilson, № Finkelshtein [et al]. // Diabetes Technol Ther. 2012. V. 14. № 5. P. 398-402.
6. Karyakin A.A., Gitelmacher O.V., Karyakina E.E. A high-sensitive glucose amperometric biosensor based on prussian-blue modified electrodes // Anal. Lett. 1994. T. 27. № 15. C. 2861-2869.
7. Scholten K., Meng E. A review of implantable biosensors for closed-loop glucose control and other drug delivery applications // International Journal of Pharmaceutics. 2018. V. 544. № 2. P. 319-334.
8. Biosensors based on electrochemical lactate detection: A comprehensive review / K. Rathee, V. Dhull, R. Dhull [et al]. // Biochemistry and Biophysics Reports. 2016. V. 5. P. 35-54.
9. A glucose biosensor based on Prussian blue/chitosan hybrid film / X. Wang, H. Gu, F. Yin [et al]. // Biosensors and Bioelectronics. 2009. V. 24. № 5. P. 1527-1530.
10. Jia X., Dong S., Wang E. Engineering the bioelectrochemical interface using functional nanomaterials and microchip technique toward sensitive and portable electrochemical biosensors // Biosensors and Bioelectronics. 2016. V. 76. P. 80-90.
11. Soft, stretchable, high power density electronic skin-based biofuel cells for scavenging energy from human sweat / A.J. Bandodkar, J.-M. You, N.-H. Kim [et al.]. // Energy Environ. Sci. 2017. V. 10. № 7. P. 1581-1589.
Плеханова Юлия Викторовна, канд. биол. наук, научный сотрудник, plekhanova'aibpm.piishchino.ni, Россия, Пущино, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН,
Решетилов Анатолий Николаевич, д-р хим. наук, проф., зав. лабораторией, anatol'aibpm.piishchino. ru, Россия, Пущино, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН; Россия, Тула, Тульский государственный университет
BIOSENSOR FOR SIMULTANEOUS DETERMINATION OF GLUCOSE AND
LACTA TE IN HUMAN SWEA T
Y. V. Plekhanova, A.N. Reshetilov Enzyme biosensors containing glucose oxidase (GO) and/or lactate oxidase (LO) were used to determine glucose and lactate in human sweat. The developed biosensors were used to analyze sweat samples collected in healthy people in conditions of elevated ambient temperature without the use of any chemical-sweating chemical compounds. The measurements of sweat in open flow cuvette designed and conducted. It was shown that the developed biosensors measure the glucose and lactate in a complex mixture and are able to perform this type of analysis simultaneously.
Key words: glucose oxidase, lactate oxidase, screen-printed electrodes, biosensor, sweat, sweat collection system
Plekhanova Yulia Viktorovna, candidate of biological sciences, researcher, plekhanova'aibpm.pushchino.rii, Russia, Pushchino, G.K. Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms, Russian Academy of Sciences,
Reshetilov Anatoly Nikolaevich, doctor of chemical sciences, professor, manager of laboratory, anatol@,ibpm.pushchino. ru, Russia, Pushchino, G.K. Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms, Russian Academy of Sciences; Russia, Tula, Tula State University.
