CC BY
232
УДК 602.4:547.455.623:007.573.6
ФЕРМЕНТНЫЕ БИОСЕНСОРЫ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЛЮКОЗЫ, МОЛОЧНОЙ КИСЛОТЫ И КРАХМАЛА НА ОСНОВЕ
МОДИФИЦИРОВАННЫХ ПЕЧАТНЫХ ЭЛЕКТРОДОВ
Л.С. Латунина, С.С. Каманин, В.А. Арляпов
Разработана система биосенсоров на основе графитовых печатных электродов, модифицированных медиатором ферроценом и ферментными препаратами: глю-козооксидазой, лактатоксидазой и смесью глюкозооксидазы и у-амилазы, иммобилизованными в полимерный гидрогель поперечно-сшитого бычьего сывороточного альбумина. Определены основные аналитические и метрологические характеристики биосенсоров. Проведена апробация системы на образцах ферментативного брожения. Значения содержаний глюкозы, молочной кислоты и крахмала, полученные с помощью разработанной системы и референтных методов, различаются между собой незначимо. Разработанная система может рассматриваться как перспективная альтернатива классическим аналитическим методам. Предложенные в работе результаты позволяют расширить сферы и масштаб применения биосенсоров на основе печатных электродов в области биотехнологического производства.
Ключевые слова: биосенсор, печатный электрод, определение глюкозы, определение лактата, определение крахмала, биотехнологическое производство.
Введение
В процессе производства продуктов, получаемых при ферментативном брожении органических веществ, важное место занимает мониторинг содержания компонентов, участвующих в биохимических процессах, таких как, например, глюкозы, молочной кислоты и крахмала. Определение глюкозы играет большую роль при мониторинге процессов ферментации и для контроля качества конечного продукта при спиртовом брожении виноградного сусла, так как она является основным субстратом для данного процесса. В случае молочнокислого брожения (производство кваса и кефира), одним из продуктов сбраживания глюкозы является молочная кислота. Квас - продукт незаконченного молочнокислого и спиртового брожения хлебного сусла. В нем содержится от 0,21 до 0,58 % молочной кислоты (лактата). При этом отсутствие молочной кислоты в конечном продукте является однозначным индикатором нарушения технологического регламента производителем [1]. Крахмалсодержащие продукты являются доступным исходным сырьем промышленных бродильных процессов. В спиртовом производстве, для оптимального проведения технологического процесса особенно важно иметь информацию о содержании крахмала в исходном сырье. Существующие в настоящее время методы определения крахмала не совершенны и зачастую требуют предварительного гидролиза крахмала. Наиболее
распространенные физико-химические методы анализа крахмала сильно зависят от внешних условий, таких как температура, рН, амилозо-амилопектиновое соотношение в крахмале (колориметрия), либо требуют отделения всех оптически активных компонентов, например, белков, из раствора (поляриметрия) [1].
В данной ситуации ферментные биосенсоры являются многообещающей альтернативой: помимо их хорошей селективности, они могут быть легко интегрированы в автоматические схемы и используются для разработки простого и переносного оборудования, что позволяет быстро и на месте исследовать образцы [2, 3]. Одним из перспективных технологий развития биосенсорики является использование печатных электродов. Они получили широкое распространение в решении ряда практических задач, например, в глюкометрах - биосенсорах амперометрического и оптического типа для определения содержания глюкозы в крови. Печатные графитовые электроды отличаются компактностью, низкой себестоимостью, многофункциональностью и возможностью модификации, что позволяет создавать на их основе различного рода биосенсоры, удобные для промышленного производства
[4].
В литературных источниках описаны модели медиаторных биосенсоров на основе фермента глюкозооксидазы (ГО), иммобилизованного на поверхности графитовых печатных электродов, позволяющих определять содержание глюкозы в среднем интервале 0,01-1 мМ [5, 6]. Описаны также биосенсоры на основе графитовых печатных электродов, содержащие фермент лактатоксидазу (ЛО), позволяющие определять концентрацию лактата со значением операционной стабильности в районе 3-4 % [7, 8]. Определение содержания крахмала биосенсорным методом осуществляется с применением биферментного рецепторного элемента, включающего в себя глюкозооксидазу и амилазу (ГО+Ам). В литературных источниках существуют примеры разработки биосенсоров данного типа [9], однако их представлено не так много. Сообщений о разработке биосенсоров для определения крахмала на базе печатных электродов в научной печати не зафиксировано.
Преимущества печатных электродов в полной мере проявляют себя при объединении нескольких биосенсоров в единую аналитическую систему, способную одновременно определять содержание нескольких компонентов бродильных сред. Именно эта задача, традиционно сложная для физико-химических методов анализа, может быть успешно решена с использованием биосенсоров. Что касается систем биосенсоров для селективного анализа состава многокомпонентных проб - такие системы пока довольно мало распространены. Известна система амперометрических биосенсоров, позволяющая проводить одновременное селективное определение содержания глюкозы и лактата с использованием
проточно-инжекционной системы, включающей электрод с иммобилизованными глюкозооксидазой и лактатоксидазой [10]. Описана система амперометрических биосенсоров для анализа этанола, лактата и глюкозы в образцах вин (рабочие диапазоны - 0,3-20 мМ для этанола, 0,042,5 мМ для глюкозы и 0,008-1 мМ для лактата) [11].
В связи с этим, представляется актуальной разработка системы биосенсоров на основе печатных электродов, модифицированных ферментами, для контроля содержания глюкозы, молочной кислоты и крахмала в биотехнологических процессах.
Материалы и методы
Биосенсорные измерения. Сигнал регистрировали, используя графитовые печатные электроды (Русенс, Россия), на поверхности которых располагали рецепторный элемент. Измерения проводили в кювете объемом 4 см в натрий-калиевом фосфатном буферном растворе (Sigma-Aldrich, США) с рН=6,8 при перемешивании магнитной мешалкой (Экрос, Россия) со скоростью 200 об/мин. Ввод пробы осуществляли автоматическими микропипетками переменного объема (5-50 мкл, 20-200 мкл, 200-1000 мкл, 1000-5000 мкл) (Ленпипет, Россия). Рабочий потенциал для электродов задавали по эмпирическим данным циклической вольтамперометрии с использованием потенциостата EmStat (PalmSens, Нидерланды). Для электродов, содержащих ГО, он составил +200 мВ, для электродов с ЛО и ГО+Ам +0,25 В. Выходные данные обрабатывались на персональном компьютере с применением программы PS Trace. Аналитическим сигналом (ответом биосенсора) являлась амплитуда изменения выходного сигнала биосенсора при добавлении лактата, глюкозы или крахмала. После каждого измерения осуществляли промывание электрода буферным раствором в течение 1-2 минут.
Изготовление рецепторного элемента биосенсора. На поверхность рабочего электрода наносили 2 мкл раствора ферроцена (Sigma-Aldrich, США) в ацетоне (Химсервис, Россия) с концентрацией 0,1 М и оставляли до полного высыхания. Затем поверх ферроцена наносили слой ферментного препарата. Для придания электродам селективности по отношению к лактату, поверх слоя ферроцена наносили 0,5 мкл раствора лактатоксидазы (Sigma-Aldrich, США) с удельной активностью 20 Е/мг. Для формирования электрода, селективного по отношению к глюкозе, на поверхность рабочего электрода наносили 1 мкл раствора глюкозооксидазы (Sigma-Aldrich, США) с удельной активностью 25 Е/мг. Селективность электродов по отношению к крахмалу обеспечивалась одновременным нанесением 1 мкл раствора глюкозооксидазы и 1 мкл коммерческого препарата у-амилазы (Sigma-Aldrich, США). Далее оставляли электрод до полного высыхания при комнатной температуре и затем покрывали гидрогелем поперечно-сшитого бычьего сывороточного
альбумина. Для его получения в микропробирку помещали 3,5 мг бычьего сывороточного альбумина (Sigma-Aldrich, США), 50 мкл фосфатного буфера (рН=6,8, 33 мМ) и перемешивали с помощью центрифуги/миксера CM70M (ELMI, Латвия). К полученному раствору добавляли 7,5 мкл 25 % раствора глутарового альдегида (Panreac Química S.L.U., Испания). После повторного перемешивания 3 мкл полученной смеси быстро переносили на электрод. Время полимеризации составляло около 30 минут. Модифицированный печатный электрод перед использованием промывали в буферном растворе.
Определение содержания молочной кислоты и глюкозы в образцах методом капиллярного электрофореза. Измерения проводили на системе капиллярного электрофореза Капель-104Т (Люмэкс, Россия) с отрицательной полярностью высокого напряжения, оснащенной кварцевым капилляром (внутренний диаметр 50 мкм, эффективная длина 65 см и полная длина 75 см) и фотометрическим детектором, позволяющим проводить измерения при длине волны 254 нм.
Определение содержания крахмала методом
высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Определение проводили на хроматографе марки HP 1100 (Hewlett Packard, США) с использованием детектора рефрактометрического типа и колонки (300x6,5 мм), заполненной сульфированным сополимером полистирола и дивинилбензола в кальциевой ионной форме с размером частиц 30 мкм. Условия анализа: температура колонки 80°С, скорость потока элюента (деионизированная вода) 0,5 мл-мин"1. При определении содержания крахмала проводили предварительный гидролиз анализируемого образца. Для этого его нагревали на водяной бане в разбавленном растворе соляной кислоты (1,124 %) в течение 15 мин, осаждали белковые вещества, отфильтровывали и проводили хроматографический анализ, как описано выше.
Модельный процесс брожения и получение сброженной массы.
Образец пшеничной муки суспендировали в тёплой дистиллированной воде и нагревали до 90oC. В полученную массу добавляли ферментный препарат Termamyl (Novozymes A/S, Дания) и термостатировали 2 часа при перемешивании. После чего реакционную массу охлаждали до 60oC и добавляли ферментный препарат SAN Super 360L (Novozymes A/S, Дания), помещали в термостат и перемешивали 2 часа. После этого охлаждали колбу до 30°C, добавляли дрожжевой препарат SuperStart (Россия) и термостатировали 70 часов для брожения. Пробы отбирали через 2, 12, 48 и 72 часа после добавления дрожжевого препарата.
Результаты и обсуждение
В качестве медиатора электронного транспорта выбран один из наиболее распространенных посредников при переносе электронов от
активного центра фермента на электрод - ферроцен. Его уникальная сэндвич-подобная структура позволяет не менять координационную сферу и геометрию комплекса при переходе из восстановленной формы в окисленную, что обеспечивает высокую стабильность и другие характеристики сенсоров на его основе [12].
Основные характеристики разработанной системы биосенсоров. Для определения чувствительности и интервала определяемых концентраций были построены градуировочные зависимости ответов биосенсоров на основе разработанных печатных электродов от концентрации субстратов в измерительной кювете (рис.).
6000
5000
<
К
<й Л о о К и о о К ю
н 2000 -
4000 -
3000 -
я н О
1000 -
12 3 4
Концентрация глюкозы в кювете, мМ
1200
1000
й л о о К и о о К ю н и т н О
а
б
800 -
600 -
400
200 -
50 100 150 200
Концентрация лактата в кювете, мМ
100
в
й Л
о о К и о о к ю
н и И
н
о
80 -
60 -
40 -
20
0 200 400 600 800 1000 1200 Титр крахмала в кювете, мг/л
Градуировочные зависимости ответов биосенсоров от содержания анализируемого вещества при использовании печатных электродов,
модифицированных: а - глюкозооксидазой; б - лактатоксидазой; в - смесью глюкозооксидазы и у-амилазы. Врезка - линейные участки
градуировочных зависимостей
0
0
0
Рецепторные элементы на основе ферментов являются биорецепторами каталитического типа, т. е. биологический ответ в таких системах обеспечивается ферментативными реакциями. Градуировочные зависимости, приведенные на рисунке (а, б), имеют сигмоидальный вид и описываются уравнением Хилла (1).
КМ +]А, (1)
где Ятах — максимальный ответ биосенсора, при котором все молекулы фермента биорецепторного элемента участвуют в образовании фермент-субстратного комплекса; Км — эффективная константа Михаэлиса, численно равная концентрации субстрата, при которой уровень ответа биосенсора достигает половины максимального значения; [Б] — концентрация субстрата, И — коэффициент Хилла.
Градуировочная зависимость биосенсора на основе смеси глюкозооксидазы и у-амилазы (рис., в) имеет гиперболический вид и была аппроксимирована по уравнению Михаэлиса-Ментен (2).
^ _ ^тах[^]
КМ +] (2)
Для снижения ошибок анализа измерения проводили на линейных участках градуировочных зависимостей. Линейные участки для биосенсоров на основе ферментов глюкозооксидазы и лактатоксидазы были выбраны по максимальному значению коэффициента корреляции. На их основе были найдены коэффициенты чувствительности и основные их характеристики (табл. 1). Верхнюю границу определяемых концентраций получали из уравнения Михаэлиса-Ментен. Ее численное значение равно константе Михаэлиса. Нижняя граница определяемых концентраций была рассчитана по стандартному отклонению холостого опыта. В табл. представлены характеристики биосенсоров на основе полученных модифицированных печатных электродов.
Таблица 1
Основные характеристики биосенсоров разработанных печатных
электродов
Фермент ГО ЛО ГО+Ам
Относительное стандартное отклонение, % 2,2 2,8 5,4
Коэффициент чувствительности, нА-мМ-1 88±6 13,0±0,7 1,1±0,1 нА-л/мг
Нижняя граница определяемых концентраций, мМ 0,50 27,9 2 мг/л
Верхняя граница определяемых концентраций, мМ 2,50 99,10 30 мг/л
Предел обнаружения, мМ 0,250 0,050 0,6 мг/л
Долговременная стабильность, сутки 30 18 17
Разработанная система по аналитическим и метрологическим характеристикам не уступает аналогичным литературным разработками на основе графитовых печатных электродов, модифицированных медиатором, и отличается широким интервалом определяемых концентраций и высокой операционной стабильностью сенсоров [7, 9, 11, 13, 14]. Особенностью системы является возможность проводить селективное определение содержания глюкозы, лактата и крахмала в бродильных средах и продуктах биотехнологических производств.
Апробация системы биосенсоров на основе разработанных модифицированных печатных электродов. С помощью системы биосенсоров на основе разработанных печатных электродов определяли содержание глюкозы, лактата и крахмала в образцах продуктов ферментативного брожения (безалкогольная и алкогольная продукция, бродильные массы). В качестве референтных методов использовали метод капиллярного электрофореза и ВЭЖХ. Результаты сравнения представлены в табл. 2.
Таблица 2
Определение содержания компонентов в образцах продуктов
ферментативного брожения
Образец Биосенсорный метод Референтный метод
Концентрация глюкозы, мМ
Вино «С1апе11» 13±1 14±1
Вино «Лыхны» 140±10 140±6
Вино «Уа11ейоге» 8,7±0,8 9,8±0,2
Концентрация лактата, мМ
Квас «Очаковский» 19±1 21±4
Квас «Яхонт» 7,7±0,4 8±2
Квас «Дикси Традиционный» 21±2 22±4
Концентрация крахмала, мг/л
Бродильная масса №1 17±3 19±1
Бродильная масса №2 13,8±0,8 14,1±0,6
Бродильная масса №3 16±1 17±1
Статистический анализ полученных данных с использованием модифицированного теста Стьюдента показал, что значения концентрации определяемых веществ в продуктах ферментативного брожения, полученные с помощью разработанной системы биосенсоров и референтными методами различаются незначимо. Предложенная система
позволит проводить селективный анализ многокомпонентных продуктов биотехнологического производства с высокими показателями точности.
Таким образом, разработанная система может рассматриваться как альтернатива классическим аналитическим методам. Предложенные в работе результаты позволяют расширить сферы и масштаб применения биосенсоров на основе печатных электродов в области биотехнологического производства.
Заключение
Разработана система биосенсоров на основе печатных электродов, модифицированных ферментами глюкозооксидазой, лактатоксидазой и смесью глюкозооксидазы с у-амилазой и медиатором ферроценом. Диапазон определяемых концентраций глюкозы, лактата и крахмала составил 0,5 - 2,5, 27,9 - 99,1 мМ и 2 - 30 мг/л соответственно.
С использованием системы биосенсоров на основе модифицированных печатных электродов проведен анализ образцов продуктов ферментативного брожения. Полученные значения незначимо отличаются от значений, полученных с использованием референтных методов из чего следует, что предложенная система биосенсоров может быть использована для определения содержания лактата, глюкозы и крахмала в продуктах биотехнологических производств.
Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ и Правительства Тульской области № 16-48-710959 р_а (договор ДС/44) и гранта Президента Российской Федерации для государственной поддержки молодых российских ученых - кандидатов наук, договор № 14.Z56.16.5425-MK.
Список литературы
1. Ковалевский К.А. Технология бродильных производств. Киев: ИНКОС, 2004. 340 с.
2. Понаморева О.Н., Решетилов А.Н., Алферов В.А. Биосенсоры и биотопливные элементы. Тула: Изд-во ТулГУ, 2011. 215 с.
3. Баника Ф.Г. Химические и биологические сенсоры: основы и применения: пер. с англ. / под ред. Баника Ф.Г. М: Техносфера. 2014. 880 с.
4. Toward the development of smart and low cost point-of-care biosensors based on screen printed electrodes / M. U. Ahmed, M. M. Hossain, M. Safavieh [et al.] // Critical reviews in biotechnology. 2016. V. 36. P. 495505.
5. Sato N., Okuma H. Development of single-wall carbon nanotubes modified screen-printed electrode using a ferrocene-modified cationic surfactant for amperometric glucose biosensor applications // Sens. Actuators B. 2008. V. 129. P. 188-194.
6. Monitoring of monosaccharides, oligosaccharides, ethanol and glycerol during wort fermentation by biosensors, HPLC and spectrophotometry / R. Monosík, P. Magdolen, M. Stred'ansky [et al.] // Food Chem. 2013. V. 138. № 1. P. 220-226.
7. Electrochemical lactate biosensor based upon chitosan/carbon nanotubes modified screen-printed graphite electrodes for the determination of lactate in embryonic cell cultures. / N. Hernández-Ibáñez, L. García-Cruz, V. Montiel [et al.] // Biosensors and Bioelectronics. 2016. V. 77. P. 1168-1174.
8. Development of a lactate biosensor based on conducting copolymer bound lactate oxidase. / S. Suman, R. Singhalb, A.L. Sharma [et al.] // Sensors and Actuators B: Chemical. 2005. V. 107. № 2. P. 768-772.
9. Co-immobilization of glucoamylase and glucose oxidase for electrochemical sequential enzyme electrode for starch biosensor and biofuel cell / Q. Lang, L.Yin, J. Shi [et al.] //Biosensors and Bioelectronics. 2014. V. 51. P. 158-163.
10. Simultaneous monitoring of glucose and L-lactic acid during a fermentation process in an aqueous two-phase system by on-line FIA with microdialysis sampling and dual biosensor detection / R. W. Min, V. Rajendran, N. Larsson [et al.]//Analytica chimica acta. 1998. V. 366. № 1-3. P. 127-135.
11. Goriushkina T. B., Soldatkin A. P., Dzyadevych S. V. Application of amperometric biosensors for analysis of ethanol, glucose, and lactate in wine //Journal of Agricultural and Food chemistry. 2009. V. 57. P. 6528-6535.
12. Van Staveren D.R., Metzler-Nolte N. Bioorganometallic chemistry of ferrocene // Chemical reviews. 2004. V. 104. № 12. P. 5931-5986.
13. Pérez S., Fábregas E. Amperometric bienzymatic biosensor for L-lactate analysis in wine and beer samples //Analyst. 2012. V. 137. № 16. P. 3854-3861.
14. Sato N., Okuma H. Amperometric simultaneous sensing system for d-glucose and l-lactate based on enzyme-modified bilayer electrodes // Analytica Chimica Acta. 2006. V. 565. P. 250-254.
Латунина Любовь Сергеевна, магистрант, l. s. latunina@,gmail. com, Россия, Тула, Тульский государственный университет,
Каманин Станислав Сергеевич, канд. хим. наук, асс., [email protected], Россия, Тула, Тульский государственный университет,
Арляпов Вячеслав Алексеевич, канд. хим. наук, доц., [email protected], Россия, Тула, Тульский государственный университет
ENZYMATIC BIOSENSORS FOR GLUCOSE, LACTATE AND STARCH
DETECTION BASED ON THE MODIFIED SCREEN-PRINTED
ELECTRODES
L.S. Latunina, S.S. Kamanin, V.A. Arlyapov
The system of biosensors based on graphite screen-printed electrodes, modified with ferrocene and enzymes (glucose oxidase, lactate oxidase and the mixture of glucose oxidase and y-amylase), immobilized in a polymer hydrogel of cross-linked bovine serum albumin, was developed. Basic analytical and metrological characteristics of biosensor system were studied. The system was tested on the enzymatic fermentation samples. Results of glucose, lac-tate and starch determination, obtained by using developed system and reference methods, do not significantly differ from each other. The developed system can be considered as a promising alternative to classical analytical methods. The proposed results allow to expand the sphere and application scale of biosensors based on screen-printed electrodes in the field of biotechnological production.
Key words: biosensors, screen-printed electrodes, determination of glucose, determination of lactate, determination of starch.
Latunina Lyubov Sergeevna, master student, l.s.latunina@,gmail.com, Russia, Tula, Tula State University,
Kamanin Stanislav Sergeevich, candidate of chemical sciences, assistant, [email protected], Russia, Tula, Tula State University,
Arlyapov Vyacheslav Alekseevich, candidate of chemical sciences, associate professor, [email protected], Russia, Tula, Tula State University
