CC BY
18
УДК 543.31 DOI: 10.24412/2071-6176-2022-2-12-20
БИОРЕЦЕПТОРНЫЙ ЭЛЕМЕНТ НА ОСНОВЕ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI И МЕДИАТОРА ФЕРРОЦЕНА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТОКСИЧНОСТИ ПОВЕРХНОСТНЫХ ВОД
Р.В. Лепикаш, А.С. Харькова, В.А. Арляпов
В ходе работы были исследованы характеристики биорецепторного элемента на основе бактерий Esherichia coli и медиатора ферроцена. В качестве референтных токсикантов выбраны фенол и ионы меди (II). Исследована кинетика окисления глюкозы бактериями в присутствие указанных токсикантов. Установлено, что ингибирова-ние обратимо и относится к смешанному типу. Долговременная стабильность биорецепторного элемента составила 3 дня, операционная стабильность - 6,92%, воспроизводимость аналитического сигнала серии электродов - 7% Полученный био-рецепторный элемент был апробирован на образцах поверхностных вод, результаты оценки токсичности биосенсорным методом коррелировали с результатами референтного метода биотестирования, в котором в качестве тест-объекта использованы водоросли Chlorella vulgaris.
Ключевые слова: токсичность, биотестирование, бактерии Escherichia coli, микробный биосенсор.
Введение
В настоящий момент времени человечество столкнулось с практически повсеместным загрязнением различными токсикантами: тяжелыми металлами[1], пестицидами [2], нефтепродуктами [3]. Загрязнители окружающей среды негативно влияют не только на окружающую среду, но и на жизнедеятельность человека, накапливаясь в гетеротрофных пищевых цепях и поступая в организм человека, что приводит к риску возникновения опухолей, заболеваний крови и нервной системы, генетическим отклонениям [1].
Для выявления токсикантов используют физико-химические методы анализа, которые, несмотря на свою высокую точность и воспроизводимость результатов, обладают высокой стоимостью оборудования, а также неспособностью оценить воздействие токсикантов на экосистему [4]. Токсическое влияние компонентов анализируемого образца можно выявить с помощью биологических методов, в которых в качестве тест-объектов применяют живые организмы (ряска, хлорелла, рыбы, дафнии), способные давать ответную реакцию на введение токсиканта в систему. Однако биотестирование имеет высокую длительность анализа, что не позволяет оперативно получать информацию о состоянии окружающей среды. Биосенсорные методы определения интегральной токсичности более перспективны для оценки токсичности и
обладают следующими преимуществами: низкой стоимостью, миниатюризацией, простотой применения, возможность оперативно получать информацию об изменениях в окружающей среде.
Известна работа [9], в которой описана биорецепторная система на основе дрожжей Saccharomyces cerevisiae и системы, состоящей из двух медиаторов - менадиона и гексацианоферрата (III) калия. Липофильный медиатор менадион использовался как внутриклеточный акцептор электронов с ферментативных систем клетки, а гидрофильный гексацианоферрат (III) калия - в качестве внеклеточного акцептора электронов, осуществляя перенос электронов от менадиона к аноду. Для иммобилизации микроорганизмов использовали гидрогель на основе хитозана с частицами нанокристаличесского алмаза, который был легирован бором. К недостаткам исследования можно отнести использование сложной системы из двух медиаторов, что увеличивает трудоемкость выполнения анализа, а также сложный и дорогой метод иммобилизации микроорганизмов. Поэтому целью данного исследования является создание недорого и простого в использовании биоанализатора на основе бактерий Esherichia coli и медиатора ферроцена для определения интегральной токсичности водных сред.
Материалы и методы
Реактивы и материалы. Все требуемые реактивы имели степень чистоты х.ч. или ч.д.а.. Для приготовления среды и культивирования бактерий использовали триптон («Sigma», США), дрожжевой экстракт («OxoidLtd., Великобритания), хлорид натрия («Диаэм», Россия). Для изготовления рабочих электродов использовали графитовую пудру («Fluka», Германия), минеральное масло («Fluka», Германия), ацетон («Диаэм», Россия), диализную мембрану («Roth», Германия) и медиатор ферроцен («Sigma-Aldrich», Германия). В качестве рабочего электролита применяли фосфатный натрий-калиевый буферный раствор с рН=6,8 и концетрацией солей 33мМ. В качестве субстрата использовали глюкозу («AppliChem», Германия)
Культивирование микроорганизмов. Бактерии E. coli были культивированы на среде LB.Состав жидкой среды: триптон - 10 г/дм3, дрожжевой экстракт - 5 г/дм3, хлорид натрия - 10 г/дм3. Среду для выращивания клеток стерилизовали автоклавированием при давлении 1 атм. в течение 45 мин. Клетки выращивали аэробно 20-24 часов в качалочных колбах объемом 750 см3 при температуре 29 оС. Затем полученную биомассу центрифугировали при комнатной температуре при 10000 об/мин 10 минут и отмывали от культуральной среды20 мМ фосфатным буфером рН 6,8 (2 раза). Осевшие клетки рассуспендировали в свежей порции буфера, распределяли по порциям и осаждали на
центрифуге «Eppendorf» 10 минут при 10000 об/мин. Промытую биомассу взвешивали и хранили в микропробирках при температуре -10оС.
Формирование рабочего электрода. Электрод наполняли графитовой пастой следующего состава: ферроцен - 10 мг, графитовая пудра - 90 мг, минеральное масло - 40 мкл. Ферроцен растворяли в ацетоне объемом 500 мкл. После испарения ацетона данной смесью наполняли пластиковый корпус электрода. Поверхность электрода зачищали о бумагу.
Биоматериал объемом 5 мкл наносили на поверхность электрода, подсушивали при комнатной температуре, а затем наносили еще 5 мкл биомассы. После подсушивания конец электрода накрывали диализной мембраной, зафиксированной пластиковым кольцом.
Между измерениями электроды хранились в холодильники при температуре +4оС.
Электрохимические измерения. Для регистрации сигнала биосенсорной системы использовали электрохимический преобразователь гальванопотенциостат, регистрирующий зависимость силы тока от времени - «IPC Micro» (НПО «Вольта», Россия), к которому подключались электроды. Измерения проводили при постоянном потенциале 0,25 В.
Измерения проводили в двухэлектродной системе, погруженной в измерительную кювету объемом 5 мл, содержащую калий-натрий фосфатный буфер (рН=6,8). Рабочим электродом служил угольно-пастовый, модифицированный медиатором ферроценом с иммобилизованными клетками, электродом сравнения - насыщенный хлорсеребряный.Измерения проводили при непрерывном перемешивании с помощью магнитной мешалки. Температура измерения составляет 20oC, объем ячейки равен 5 см3.
После установления стабильного уровня тока в ячейку микропипеткой вводят 500 мкл анализируемого раствора глюкозы (концентрация 0,1 М) и 500 мкл раствора глюкозы и токсиканта, вызывающего снижение дыхательной активности микроорганизмов. После каждого измерения производят промывку ячейки калий-натрий-фосфатным буферным раствором.
Аналитическим сигналом служил индекс ингибирования1С, рассчитываемый по формуле:
_ ^глюкоза- Д^глюкоза+ингибитор 100%
ДЛжлюкоза
где Д1глюкоза - ток при добавлении раствора глюкозы, Д1глюкоза+ингибитор - ток при добавлении раствора глюкозы с ингибитором.
Проведение анализа на определение токсичности водных сред с помощью стандартного метода и биосенсора. Анализируемые проб воды для анализа были приготовлены согласно методике [5]. Приготовленная проба воды в объеме 100 см3 была отфильтрована и перенесена в стакан на
200 см3. Для получения анализируемой пробы в четыре аналогичных стаканах добавляли по 48 см3 воды. После этого в первый из них перенесли 24 см3 тестируемой воды, во второй, третий и четвертый - по 24 см3, соответственно, из первого, второго и третьего стаканов. 24 см3из последнего стакана отбросили. Для проведения биотестирования в каждый стакан была добавления культура водорослей в объеме 2 см3. Для анализа с помощью биосенсорав пробы была добавлена глюкоза, концентрация которой составила 0,1 моль/дм3. В качестве аналитического сигнала брали степень ингибирования 1С. Затем определяли переход «токсичный-нетоксичный» между двумя разбавлениями и рассчитывали ТКР согласно методике [5].
Результаты и обсуждения
В работе сформирован биорецепторный элемент на основе бактерий Е. евИ и медиатора ферроцена. Выбор бактерий был обусловлен тем, что они используются в качестве тест-объекта в референтном методе биотестирования [6]. Медиатор ферроцен обладает хорошими электрохимическими характеристиками: константа скорости переноса электронов на электрод на порядок выше, чем в других системах [7]; кроме того, применение медиатора ферроцена позволяет сформировать безреагентную систему, что существенно упрощает анализ.
При токсикологическом мониторинге необходимо удостоверится, что используемый биоматериал является пригодным для проведения анализа, с этой целью рекомендуется предварительно оценить чувствительность биоматериала к референтным токсикантам, в качестве которых были выбраны ионы меди (II) и фенол. Предварительно оценивали степень обратимости взаимодействия биоматериала с токсикантами. Биоэлектроды предварительно выдерживали в указанных растворах токсиканта в течение суток, затем электрод промывали буферным раствором и фиксировали изменение скорости окисления глюкозы бактериями в составе рецепторного элемента. Ответ биосенсора не изменялся после контакта с токсикантами и составлял 98% от первоначальной величины: ионы меди (II) и фенол обратимо взаимодействуют с ферментами микроорганизмов.
Установлен принцип ингибирующего действия исследуемых токсикантов [8], анализируя зависимости ответа биосенсора от концентрации глюкозы до и после введения ингибиторов (рис. 1А), полученные результаты аппроксимировали в рамках кинетики Михаэлиса-Ментон и определяли кажущиеся константы Михаэлиса Км в присутствии субстрата и Км-константа в присутствии ингибиторов - ионов меди (II) или фенола; максимальную скорость ферментативной реакции (Гтах — скорость окисления глюкозы бактериями, ГтаХ - скорость окисления глюкозы бактериями в присутствии ингибитора). Тип ингибирования
определили после обработки полученных результатов по методу Лайнуивера - Берка (рис. 1Б).
ZA
го
|
II
: ■ £
■Э 1.0
IV
г
О
a.s
C,ö
* Глюкоза + Гпцкозэ * Сч^
и>
к
4 4 '¡Г -1 D \
Концентрация гпюкшы дм;||имопь
Рис. (Б)
Концентрация гжим5ы. илмипм
1. График зависимости (А) и обработка полученных результатов в двойных обратных координатах (метод Лайнуивера - Берка) в
присутствии Си2+
Найденные кинетические параметры ингибирования дыхательной активности рецепторного элемента (Км, К'м, Гтах, Гтахг) представлены в табл. 1.
Таблица 1
Параметры уравнения Михаэлиса-Ментон
Биорецепторный элемент Токсикант КМ' 3 ммоль/дм Кмь 3 ммоль/дм r , max мкА r , мкА maxi Тип ингибирования
Ферроцен/Е. coli 2+ Си 2,1±0,9 0,25±0,05 2,5±0,3 1,97±0,03 Смешанный
Фенол 2,1±0,5 1,0±0,3 2,9±0,2 2,3±0,2 Смешанный
Из полученных данных следует, что оба токсиканта воздействуют на ферментативные центры микроорганизмов по смешанному типу, то есть ионы меди (II) и фенол могут связываться как с активным центром фермента, так и вне его.
Далее в работе были определены основные характеристики биорецепторного элемента: операционная (рис. 2А) и долговременная стабильность (рис. 2Б) сенсора, а также воспроизводимость аналитических сигналов 5 электродов. Определение операционной стабильности проводились путем введения раствора субстрата (0,1М 500 мкл) и ингибитора. Долговременную стабильность определяли путем измерения степени ингибирования микроорганизмов. Для этого измеряли ответ
биосенсора в присутствии субстрата и в присутствии субстрата и ингибитора, концентрация которого вызывает снижение дыхательной активности бактерий Е. соИ. Между измерениями электрод хранился в фосфатном буферном растворе (рН = 6,8).
А 1:6
1,4 < 1,2
Л 1 а
2 0.8
0,6
и 0.4
н
Е
О а2
о
_♦
♦ ♦
♦ ♦_♦ ♦
•—♦
О 2 4 6 8 10 12 14
Номер измерения
Сутки
Рис. 2. Операционная стабильность (А) и долговременная стабильность (Б) биорецептронго элемента
Результаты исследований представлены в табл. 2.
Таблица 2
Параметры биорецепторного элемента
Токсикант Долговременная стабильность, сутки Операционная стабильность Относительное стандартное отклонение серии электродов, %
Ответ, мкА Sr, %
Си2+ 3 1,28 ± 0,04 6,92 7
Фенол 3 0,74 ± 0,04 10,81 9
Из полученных результатов следует, что биорецепторный элемент работоспособен в течение трех дней, на четвертый день сенсор перестал работать, что может быть связано с гибелью биомассы на электроде из-за влияния токсикантов. Ионы меди (II) могут быть использованы в качестве модельного токсиканта для определения качества иммобилизованного биоматериала за счет менее токсичного воздействия на биоматериал и лучшей стабильности при длительных измерениях.
Для апробации биорецепторного элемента при определении токсичности, проводили пробоотбор из реки Упа, Щегловский ручей, реки Тулица. Параллельно производился анализ проб методом биотестирования (тест-объект СЫогеПауи^аш) и определяли токсичная кратность разбавления (ТКР). Результаты представлены в табл. 3.
Таблица 3
Результаты апробации биорецепторного элемента
Метод анализа ТКР анализируемых проб
Щегловский ручей р. Упа р. Тулица
Биотестирование (Chlorella vulgaris) 56 раз (высокотоксичная) 21 раз (токсичная) 7 раза (среднетоксичная)
Биосенсор (ферроцен/E.coli) 63 раз (высокотоксичная) 16 раз (токсичная) 5 раз (среднетоксичная)
В результате определения интегральной токсичности водных сред метод биотестирования с использованием водорослей Chlorella vulgaris и биосенсорным методом с использованием микроорганизмов E. coli и медиатора ферроцена можно заключить, что разрабатываемый в ходе данной работы биосенсор может быть использован для определения класса токсичности водных сред.
Заключение
Таким образом, в работе была создана простая в применении и недорогая модель биорецепторного элемента для экспресс-определения интегральной токсичности водных сред. Исходя из результатов апробации биосенсора можно заключить, что исследуемую систему на основе бактерий Escherichia coli и медиатора ферроцена можно использовать для экологического мониторинга для определения класса токсичности поверхностных природных вод.
Работа выполнена в рамках гранта Президента Российской Федерации для государственной поддержки молодых российских ученых -кандидатов наук, договор №МК-4815.2022.1.4
Список литературы
1. Карась Е.М. Загрязнение окружающей среды тяжелыми металлами // Научно-технический прогресс: актуальные и перспективные направления будущего. 2019. С. 137-138.
2. Воздействие пестицидов на агроэкосистемы / Н.А. Малыгина, К.В. Багина, В.Т. Рахимова [и др.] // Уральская горная школа-регионам. 2016. С. 568-568.
3. Кочетова Ж. Ю. Экомониторинг нефти и нефтепродуктов в объектах окружающей среды. Воронеж: ВУНЦ ВВС «ВВА», 2016. 204 с.
4. Игнатенко А. В. Биотестирование химической безопасности осадков сточных вод // Труды БГТУ. Серия 2: Химические технологии, биотехнология, геоэкология. 2017. №. 2 . С. 199.
5. ПНД Ф Т 14.1:2:3:4.10-04 «Методика измерений оптической плотности культуры водоросли хлорелла (Chlorella vulgaris beijer) для определения токсичности питьевых, пресных природных и сточных вод, водных вытяжек из грунтов, почв, осадков сточных вод, отходов производства и потребления». - М.: 2004. 38 с.
6. ПНД Ф Т 14.1:2:3:4.11-04 «Методика определения интегральной токсичности поверхностных, в том числе морских, грунтовых, питьевых, сточных вод водных экстрактов почв, отходов, осадков сточных вод по изменению интенсивности бактериальной биолюминесценции тест-системой Эколюм». - М.: 2004. 18 с.
7. A mediator microbial biosensor for assaying general toxicity / A.S. Kharkova, V.A. Arlyapov, A.D. Turovskaya [et al]. // Enzyme and Microbial Technology. 2019. P. 1 - 13.
8. Варфоломеев С. Д., Гуревич К. Г. Биокинетика: практический курс //М.: Фаир-пресс, 1999. 720 c.
9. A double-mediator based whole cell electrochemical biosensor for acute biotoxicity assessment of wastewater / G. Gao, D. Fang, Y. Yu [et al]. // Talanta. 2017. V. 167. P. 208-216.
Лепикаш Роман Владимирович, студент, [email protected], Россия, Тула, Тульский государственный университет,
Харькова Анна Сергеевна, канд. хим. наук, доц., [email protected], Россия, Тула, Тульский государственный университет,
Арляпов Вячеслав Алексеевич, канд. хим. наук, доц., ведущий научный сотрудник лаборатории биологически активных соединений и биокомпозитов, [email protected], Россия, Тула, Тульский государственный университет
BIORECEPTOR ELEMENT BASED ON ESCHERICHIA COLI BACTERIA AND FERROCENE MEDIATOR FOR SURFACE WATERS
TOXICITY DETERMINATION
R.V. Lepikash, A.S. Kharkova, V.A. Arlyapov
In the course of the work, the characteristics of the bioreceptor element based on Escherichia coli bacteria and the ferrocene mediator were studied. Phenol and copper (II) ions were chosen as reference toxicants. The kinetics of glucose oxidation by bacteria in the presence of these toxicants was studied. It was found that the inhibition is reversible and corresponding to mixed type. The long-term stability of the bioreceptor element was 3 days, the operational stability was 6.92%, the reproducibility of the analytical signal of a series of electrodes was 7%. The resulting bioreceptor element was tested on surface water samples, Tox-icity assessment by the biosensor method correlated with the results of the reference biotest-ing method, in which Chlorella vulgaris algae were used as a test object.
Key words: toxicity, biotesting, Escherichia coli bacteria, microbial biosensor.
Lepikash Roman Vladimirovich, student, [email protected], Russia, Tula, Tula state university,
Kharkova Anna Sergeevna, candidate of chemical sciences, docent, [email protected], Russia, Tula, Tula state university,
Arlyapov Vyacheslav Alekseevich, candidate of ohemical sciences, docent, leading researcher of Bioactive Compounds and Biocomposites Laboratory, [email protected], Tula, Russia, Tula State University
