CC BY
36
СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ, 2020, том 55, № 2, с. 364-377
Ветеринарная медицина
УДК 579.62:[573.6.086.83+577.21] doi: 10.15389/agrobiology.2020.2.364rus
БИОПРЕПАРАТ НА ОСНОВЕ ШТАММА Escherichia coli ZP. Сообщение I. ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ КОЛИЦИНА ПРИ КОНЪЮГАТИВНОЙ ДОСТАВКЕ colE7 В КЛЕТКИ APEC in vitro И in vivo*
М.В. КУЗНЕЦОВА1, И.Л. МАСЛЕННИКОВА1, Ю.С. ГИЗАТУЛЛИНА1, D. ZGUR BERTOK2, M. STARCIC ERJAVEC2
Обеспечение защиты сельскохозяйственных животных от инфекционных болезней — приоритетное направление ветеринарной медицины. Широкое распространение в птицеводческих хозяйствах патогенных и условно-патогенных бактерий, устойчивых к антибиотикам, требует разработки современных способов поддержания здоровья птицы при ее промышленном производстве. В качестве меры по предупреждению и ограничению распространения возбудителей с устойчивостью к противомикробным агентам перспективно использование бактериальных препаратов направленного действия — пробиотиков. В настоящей работе в экспериментальных моделях in vitro и in vivo мы впервые показали антагонистическое действие генно-модифицированного штамма Escherichia coli ZP против возбудителей эшерихиозов у птиц — ÄPEC (avian pathogenic Escherichia coli). Установлено, что in vitro конъюгативный перенос гена colE7 в клетки APEC проходит эффективно в условиях как планктонного роста, так и формирующейся биопленки. In vivo штамм E. coli ZP способен активно заселять кишечник крыс и маньчжурских перепелов и сохраняться там, способствуя нормализации микробиоты животных. Цель исследования — оценка эффективности киллинга клеток APEC при конъюгативном переносе гена колицина E7 и определение конкурентоспособности штамма E. coli ZP in vitro и in vivo. В работе использовали ColE7-опосредованную kill—anti - kill систему на основе пробиотического штамма Nissle 1917, включающую генно-модифицированный штамм E. coli ZP (киллерный донор), несущий на конъ-югативной плазмиде pOX38а ген колицина E7 (colE7) с ДНКазной активностью, а также ген immE7 в хромосоме, и штамм E. coli N4i без colE7 на плазмиде (контрольный донор). В качестве реципиентов использовали устойчивые к ампициллину штаммы APEC (n = 6), изолированные из внутренних органов инфицированных цыплят-бройлеров. Филогенетическую принадлежность культур определяли методом мультиплексной полимеразной цепной реакции (quadriplex PCR). Конъюгативный перенос осуществляли в среде Луриа-Бертани (LB) в течение 6 и 24 ч в планктонной культуре и в биопленке в полистироловых плоскодонных иммунологических 96-луночных планшетах. Опыты на крысах (линия Wistar) и маньчжурских перепелах (Coturnix coturnix) выполняли в виварии (ГБОУ ВО Пермский государственный медицинский университет им. академика Е.А. Вагнера МЗ РФ). Нами экспериментально подтверждена конкурентоспособность E. coli ZP при совместном культивировании с клетками APEC штаммов, в том числе продуцентами бактериоцинов, в различных моделях. Доказан конъюгативный перенос гена colE7 в клетки APEC in vitro в условиях планктонного роста и формирующейся биопленки: в экспериментах с донорным штаммом E. coli N4i частота конъюгации варьировала в пределах 10"6-10"2. Эксперимент in vivo показал, что штамм E. coli ZP способен эффективно заселять кишечник крыс и маньчжурских перепелов, сохраняясь там, как минимум, в течение 1 мес. Введение клеток E. coli ZP с питьевой водой увеличивало общее содержание комменсальных эшерихий в кишечнике, подавляя развитие патогенных представителей этого вида без заметного влияния на молочнокислую и бифидофлору. Доказана возможность конъюгативного переноса плазмиды от донора E. coli N4i в условиях кишечного тракта обоих видов животных, который происходил с высокой частотой (в среднем 10"2). В экспериментах in vitro и in vivo с E. coli ZP трансконъ-юганты обнаружены не были, то есть клетки реципиентов, получившие ген colE7 посредством конъюгативного переноса, экспрессировали его и были лизированы вследствие ДНКазной активности колицина. В группах, получавших штамм ZP, также отмечено снижение числа реципиентов АРЕС. Полученные результаты свидетельствуют, что штамм E. coli ZP способен эффективно заселять кишечник животных и обладает антибактериальной активностью против энтеропатоге-нов за счет конъюгативного механизма передачи гена колицина. Он эффективно действует на резистентные и толерантные к бактериоцинам клетки, что позволяет предположить возможность создания на его основе высокоэффективного пробиотического препарата нового поколения.
Ключевые слова: колицины, ^lE7, конъюгативный перенос, kill—anti - kill система, аль* Исследование выполнено при финансовой поддержке Правительства Пермского края в рамках научного проекта № С-26/792, а также Словенского исследовательского агентства (ARRS), гранты № P1-0198 и № BI-RU/16-18-047.
364
тернатива антибиотикам, пробиотики, патогенные Escherichia coli птиц (APEC), подопытные животные.
Птицеводство — один из наиболее быстрорастущих сегментов сельского хозяйства (1, 2). Для повышения эффективности производства птицы широко используются различные кормовые добавки, такие как синтетические гормоны и антибактериальные препараты (3). Многолетнее применение антибиотиков привело к формированию устойчивых к этим веществам грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов, которые становятся основной причиной гибели молодняка на птицефабриках (4, 5). Кроме того, инфицированные особи промышленного стада служат резервуаром возбудителей острых кишечных инфекций для человека (6). В 2014 году Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ, World Health Organization, WHO) принята стратегия, предусматривающая ограничение использования антибактериальных препаратов для профилактики инфекционных заболеваний в сельском хозяйстве (7). В 2017 году к этой программе присоединилась Россия (8).
Перспективным направлением в рамках совершенствования мер по предупреждению и ограничению распространения возбудителей с устойчивостью к противомикробным агентам считается использование пробио-тиков — бактериальных препаратов направленного действия, которым отводится ведущая роль при замене антибиотиков (9, 10). Пробиотики представляют собой моновидовую или смешанную культуру живых клеток микроорганизмов, которые применяются в качестве кормовых добавок и действуют как стимулятор роста, а также благотворно влияют на физиологические параметры и микробиоту хозяина (11, 12). Уже в первые часы жизни животных их кишечник искусственно заселяют штаммами бактерий и/или биокомплексами, обеспечивающими антагонистическое действие в отношении патогенных или условно-патогенных микроорганизмов. Такой эффект достигается за счет конкурентного вытеснения последних бактериями, продуцирующими антибактериальные вещества — бактериоцины, которые угнетают представителей близкородственных таксонов. Имеется значительное количество сообщений о положительном опыте применения пробиотиков для профилактики и лечения инфекций у птицы (1, 13-15). Существенное внимание уделяется искусственно сконструированным штаммам с множественной продукцией бактериоцинов (16-19). Например, в связи с утратой антагонистических свойств пробиотическим штаммом Escherichia coli M17 предложено восстановить его конкурентоспособность в условиях кишечника животных с помощью рекомбинантных плазмид, детерминирующих продукцию колицина E1 (20) или микроцина С51 (21). Тем не менее даже эти препараты могут быть недостаточно эффективными из-за появления бактериоциноустойчивых бактерий (22) с модифицированными поверхностными рецепторами и транслокационными системами. Возможным решением этой проблемы может стать использование альтернативного механизма доставки колицинов на основе горизонтального переноса col-генов при участии конъюгативных плазмид (23), что позволит воздействовать на резистентные и толерантные к бактериоцинам штаммы бактерий.
Антимикробная бактериальная kill—anti-kill система была апробирована с референтным (E. coli K-12 TG1) и уропатогенным (E. coli DL82) штаммами. С помощью ПЦР в реальном времени, биолюминесцентного метода и проточной цитометрии подтверждено, что плазмида pOX38a переносит colE7 в клетку реципиента, где начинается его немедленная тран-
скрипция и синтез бактериоцина, который убивает получателя (24).
В настоящей работе в экспериментальных моделях in vitro и in vivo мы впервые показали антагонистическое действие генно-модифицирован-ного штамма E. coli ZP против возбудителей эшерихиозов у птиц — АPEC (avian pathogenic Escherichia coli). Установлено, что in vitro конъюгативный перенос гена colE7 в клетки APEC проходит эффективно в условиях как планктонного роста, так и формирующейся биопленки. In vivo штамм E. coli ZP способен активно заселять кишечник крыс и маньчжурских перепелов и сохраняться там, способствуя нормализации микробиоты животных. Выявлено, что в условиях кишечного тракта конъюгативный перенос плазмиды от донора в штаммы APEC происходит с высокой частотой, в результате чего колицин действует на резистентные и толерантные к бак-териоцинам клетки, что позволяет предположить возможность создания на этой основе высокоэффективного пробиотического препарата нового поколения.
Цель нашего исследования — оценка эффективности киллинга клеток APEC (avian pathogenic Escherichia coli) при конъюгативном переносе гена колицина E7, а также конкурентоспособности штамма Escherichia coli ZP in vitro и in vivo.
Методика. В работе использовали ColE7-опосредованную kill—anti-kill систему на основе пробиотического штамма Nissle 1917, включающую генно-модифицированный штамм E. coli ZP pOX38а GmrCmr (киллерный донор, KD), несущий на конъюгативной плазмиде ген колицина E7 (colE7) с ДНКазной активностью, а также ген immE7 в хромосоме, и штамм E. coli N4i pOX38 GmrCmr (контрольный донор, D) без colE7 на плазмиде (25). Реципиентами (R) были устойчивые к ампициллину штаммы E. coli (n = 6), выделенные из внутренних органов инфицированных цыплят-бройлеров (APEC). Культуры имели индивидуальный генетический профиль согласно rep-ПЦР типированию с праймерами ERIC 1R/ERIC 2 (26). Филогенетическую принадлежность изолятов определяли методом мультиплексной по-лимеразной цепной реакции (quadriplex PCR) (27). Праймеры, использованные в работе, синтезированы в ООО «Синтол» (г. Москва). Амплификацию проводили на термоциклере DNA Engine Dyad Thermal Cycler («BioRad», США). Визуализацию полос и документирование данных осуществляли с помощью системы гель-документации Gel-Doc XR («Bio-Rad», США).
Штаммы были сохранены в коллекции культур промышленных микроорганизмов (Zbirka industrijskih mikroorganizmov, ZIM) биотехнологического факультета Университета Любляны (Univerza v Ljubljani, Словения).
Скрининг культур APEC на чувствительность к бактериоцинам проводили с использованием коллекции индикаторных штаммов-продуцентов бактериоцинов и микроцинов BZB (Университет Любляны) с помощью техники двойного слоя по методу отсроченного антагонизма (22). В качестве контрольного (чувствительного к бактериоцинам) штамма использовали E. coli DH5a. Продукцию бактериоцинов штаммами АРЕС и чувствительность E. coli ZP к бактериоцинам исследуемых штаммов оценивали аналогичным методом (22).
Конъюгативный перенос осуществляли в среде Луриа-Бертани (LB) («Amresco», США) в течение 6 и 24 ч в планктонной культуре и в биопленке в полистироловых плоскодонных иммунологических 96-луночных планшетах («Ленполимер», Россия).
Конъюгативную смесь формировали из 100-кратно разведенных ночных культур (стандартизованных до 2,0 по стандарту мутности McFar-land) донора и реципиента в соотношении 1:4. Предварительно отмытые
(0,89 % NaCl) биопленки разрушали ультразвуком (37 Гц, Elmasonic 30S, «Elma Schmidbauer GmbH», Германия) в 100 мкл физиологического раствора в течение 1 мин (5 циклов). Число колониеобразующих единиц (КОЕ) подсчитывали на селективных агаризованных средах с учетом разведения: трансконъюганты учитывали на LB-среде с добавлением антибиотиков хлорамфеникола (50 мкг/мл) и ампициллина (50 мкг/мл), клетки реципиента — на LB-среде с ампициллином (50 мкг/мл), клетки донора — на LB-среде с гентамицином (40 мкг/мл). Частоту конъюгативного переноса (Y) оценивали как отношение числа КОЕ клеток-трансконъюгантов (Т) к количеству КОЕ клеток-реципиентов (R) (28).
Биомассу биопленок определяли по методике J.H. Merritt с соавт. (29) на микропланшетном ридере Benchmark Plus («Bio-Rad», США) при X = 570 нм в единицах оптической плотности (OD).
Совместный рост бактерий оценивали с использованием богатой (LB) и бедной (М9) сред в лунках полистиролового плоскодонного иммунологического 96-луночного планшета при 37 "С с 1-х по 3-и сут. Высев проводили из децимальных разведений бактериальной суспензии на соответствующие селективные агаризованные среды с антибиотиками.
Опыты на крысах (линия Wistar) и маньчжурских перепелах (Co-turnix coturnix) выполняли в виварии на базе ГБОУ ВО Пермский государственный медицинский университет им. академика Е.А. Вагнера МЗ РФ. Условия содержания (плотность посадки, фронт кормления и поения, температура, влажность, освещенность) были в пределах норм, рекомендуемых ВНИТИП. Общий уход за крысами и птицей осуществляли в соответствии с ГОСТ 34088-2017 (30).
Эксперимент по конъюгативному переносу in vivo проводили в два этапа. В первом эксперименте использовали самцов 30-суточных крыс массой 175,25± 10,31 г, разделенных на три группы по 10 особей в каждой. Крыс содержали 21 сут в пластиковых клетках (по 5 особей в клетке) в отапливаемом (температурный режим 21-23 "С) и вентилируемом помещении с естественным освещением, доступ к корму и воде ad libitum. Живые клетки контрольного (I группа) и киллерного (II группа) донора вводили с водой в концентрации 108 бактерий/гол. в течение 7 сут. Заселение кишечника на 3-и и 6-е сут эксперимента определяли, высевая фекалии на селективные среды. С 8-х до 21-х сут в обеих опытных группах с водой вводили живые клетки штамма APEC, устойчивого к ампициллину (реципиент), в концентрации 108 бактерий/гол., через 6 ч меняли воду и вводили донорные штаммы. Контрольная группа не получала ни один из штаммов E. œli. Наличие в кишечнике ампициллиноустойчивых реципиентов, контрольного/киллерного донора и трансконъюгантов определяли на 10-е, 14-е и 21-е сут эксперимента.
На втором этапе эксперимента использовали маньчжурских перепелов массой 114,0±7,50 г, которых разделили на три группы по 5 особей в каждой и содержали в условиях, аналогичных таковым на первом этапе, в течение 1 нед. Живые клетки контрольного (группа I) и киллерного (группа II) донора вводили с водой (108 бактерий/гол.) в течение 3 сут, ежесуточно контролируя заселение кишечника высевом фекалий на селективные среды. Со 2-х по 6-е сут эксперимента в обеих опытных группах вводили живые клетки штамма APEC, устойчивого к ампициллину (108 бактерий/гол.), через 6 ч меняли воду и вводили донорные штаммы. Контрольная группа не получала ни один из штаммов E. rnli. Присутствие в кишечнике устойчивых к ампициллину реципиентов и трансконъюгантов определяли на 2-е, 3-и и 6-е сут.
На обоих этапах эксперимента число жизнеспособных клеток рассчитывали на 1 г фекалий, частоту конъюгации определяли аналогично эксперименту in vitro.
Статистический анализ осуществляли в программах Microsoft Office Excel и STATISTICA 10 («StatSoft, Inc.», США). Результаты представлены в виде среднего арифметического (M) и его ошибки (±SEM). Достоверность различий средних величин оценивали с помощью ¿-критерия Стью-дента при p < 0,05, связь между количественными значениями — с использованием линейного коэффициента корреляции Пирсона (гр).
Результаты. Согласно quadriplex ПЦР, использованные в работе штаммы APEC принадлежали к филогенетическим группам В1, В2 и Е. Колициногения была выявлена у четырех культур, одна из которых оказалась нечувствительной к бактериоцину ColE7 (рис. 1, табл. 1). Все APEC были устойчивы к десяти и более бактериоцинам, в том числе с порофор-мирующим, ДНКазным, рРНКазным, тРНКазным механизмами действия.
1. Характеристика штаммов Escherichia coli, изолированных из внутренних органов инфицированных цыплят-бройлеров (avian pathogenic E. coli, APEC)
Штамм APEC Филогруппа Продукция бактериоцинов Резистентность к колицинам Резистентность к микроцинам
RB1 В1 Нет A, B, D, E1, E3, E5, E7, Ia, Ib, K, N, M, S4 B17, C7, V
RB2 Е Нет A, B, D, E1, E5, E7, Ia, Ib, K, N, M, S4 C7, V
RB3 Е Есть A, B, D, E1, E2, E3, Ia, Ib, K, N, M, S4 B17, C7, V
RB4 Е Есть A, B, D, E1, E, E5, E7, E8J, Ia, Ib, K, N, M B17, C
RB5 В1 Есть A, B, D, E1, E5, E6, Ia, Ib, K, N, M, S4 B17, C7, V
RB6 В2 Есть A, B, D, Ia, Ib, N, M, S4 B17, C7, V
Рис. 1. Продукция бактериоцинов (А) и чувствительность к бактериоцинам (Б) у штаммов APEC (avian pathogenic Escherichia coli): А — штаммы E. coli ZP, N4i, APEC RB1-RB6, после выращивания тестируемых штаммов поверх них выращивали индикаторный штамм E. coli DH5a, Б — штамм ZP, верхний слой — разные штаммы APEC RB1-RB6 (метод отсроченного антагонизма).
В экспериментах с контрольным донорным штаммом E. coli N4i частота конъюгативного переноса в течение 6 ч варьировала в пределах 10"6-10"2 и оказалась выше в формирующейся биопленке, чем в планктоне (соответственно 1,73х 10-2±2,24х10"2 и 2,27х10-5±2,40х10"5), а в течение 24 ч была сопоставима в обеих моделях (4,45х10"4±5,46х10"4 против 6,25х10_3±8,63х10~3) (табл. 2). Модель биопленки была необходима, поскольку in vivo, в том числе в кишечном тракте, микроорганизмы существуют в основном в составе прикрепленных сообществ. При переносе в течение 24 ч корреляция между передачей плазмиды в планктоне и био-
А
Б
2. Число клеток доноров, реципиентов, трансконъюгантов (КОЕ/мл) и частота конъюгации в планктоне и биопленке в экспериментах по конъюгативному переносу плазмиды pOX38 в штаммы APEC (avian pathogenic Escherichia coli) in vitro (M±SEM)
Штамм APEC
I группа, E. coli N4i (контрольный донор)
D
R
Y
II группа, E. coli ZP (киллерный донор)
KD
R
T
Y
RB1 RB2 RB3 RB4 RB5 RB6
RB1 RB2 RB3 RB4 RB5 RB6
1,04x107±1,13x106 1,76x106±6,63x105 5,71x107±2,79x 107 1,74x106±5,63x105 2,36x107±7,63x106 3,88x 107±1,13x107
1,15x107±6,15x106 4,07x106±3,81x106 5,32x 106±3,93x106 8,16x106±3,44x106 7,43x106±3,07x106
_ 7,82x 106±3,20x 106
Примечание. D — контрольный донор,
1,70x 108±2,50x 107 1,16x 108±1,13x 107 5,50x 107±2,25x107 3,65x108±1,56x107 2,89x 108±4,88x107 2,79x 107±1,46x 107
1,15x107±1,04x106 7,76x 106±3,56x 106 4,78x106±8,75x105 3,96x 107±7,56x 106 2,02x 107±1,73x107 2,01x107±1,75x107
Планктон 10x 105±7,25x104 1,33x10-3±6,22x 10-4
62x106±2,21x106 16x105±2,01x105 84x105±1,66x105 13x104±1,25x103 80x 105±2,20x 105
2,46x 10-2±2,13x10-2 2,92x10-3±2,46x10-3 5,03x10-4±4,55x10-4 3,94x10-5±2,31x10-6 8,13x10-3±3,63x10-3
Биопленка 13x102±3,63x102 4,89x 10-5±2,06x 10-5
38x 103±6,88x103 13x103±7,75x102 49x 104±1,91x104 50x 101±2,50x 101 10x 103±1,00x102
1,60x 10-3±3,42x 10-4 2,13x10-4±1,23x10-4 5,58x10-4±3,76x10-4 8,47x10-6±8,47x10-6 2,40x 10-4±2,13x10-4
3,14x107±2,13x106 8,43x107±5,08x107 1,70x 108±3,40x 107 2,03x107±1,45x107 6,83x107±4,75x107 2,35x108±1,84x 108
7,94x106±1,29x106 3,43x107±2,22x107 4,70x106±2,08x106 1,48x106±3,25x105 1,55x106±3,00x105 9,38x106±3,63x106
9,13x107±3,75x106 3,86x107±3,63x106 6,80x 107±1,45x107 1,59x 108±3,63x107 1,88x 108±3,25x107 3,58x 107±2,34x107
3,04x 107±2,67x 107 3,03x107±2,62x107 5,25x106±2,00x106 2,83x107±2,50x107 2,96x 106±1,16x106 7,74x 106±5,26x 106
0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
KD — киллерный донор, R — реципиент, Т — трансконъюгант, Y — частота конъюгативного переноса.
T
о\
\D
пленке составила гр = 0,905 (p = 0,05). Во всех вариантах конъюгации с киллерным донором E. coli ZP и штаммами-реципиентами трансконъюганты не были детектированы. То есть клетки реципиентов, получившие colE7 ген посредством конъюгативного переноса, экспрессировали его и были лизи-рованы из-за ДНКазной активности колицина.
Дополнительно через 24 ч в смешанных культурах определяли биомассу биопленки. Для разных штаммов величина OD варьировала от 0,100 до 0,187 ед. и составила в среднем 0,144±0,007 ед. Была выявлена обратная умеренная связь между биомассой биопленки и частотой конъюгации в прикрепленной модели (гр = -0,630, р = 0,05).
Необходимо отметить, что число клеток контрольного и киллерно-го доноров в конъюгативной смеси через 24 ч в планктоне составило в среднем 2,22х107±2,03х107 и 1,02х108±7,69х107 КОЕ/мл, в биопленке — 7,38х106±2,33х106 и 9,89х106±1,13х107 КОЕ/мл, что может свидетельствовать о высокой конкурентоспособности доноров в полимикробных сообществах. Это предположение было проверено в опытах при совместном выращивании киллерного донора и штаммов APEC в смешанной культуре.
Кривые роста культур киллерного донора E. coli ZP и трех штаммов APEC — RB2 (не продуцирующий бактериоцины и нечувствительный к ColE7), RB3 (продуцирующий бактериоцины и чувствительный к ColE7) и RB4 (продуцирующий бактериоцины и нечувствительный к ColE7) на богатой (LB) и бедной (M9) средах представлены на рисунке 2.
Рис. 2. Рост клеток штаммов APEC (avian pathogenic Escherichia coli) в смешанных культурах c E. coli ZP на богатой (LB) среде (слева) и минимальной (М9) среде (справа): 1 — реципиент (АРЕС), 2 — киллерный донор (ZP); А, Б — штамм RB2, В, Г — штамм RB3, Д, Е — штамм RB4. Звездочками (*) отмечены статистически значимые различия (р < 0,05) между ростом реципиента и киллерного донора в соответствующие периоды времени.
Конкурентная динамика между E. coli ZP и штаммами APEC в
условиях богатой среды (см. рис. 2, А, В, Д) существенно различалась. В отсутствие антагонизма между штаммами (реципиент RB2) сразу же после инокуляции увеличивалась численность клеток обеих культур, а некоторое изменение в соотношении бактерий конкурирующих штаммов было обусловлено, скорее всего, преимуществом в скорости роста природного штамма RB2. Через 5 ч совместного роста число клеток E. coli ZP было стабильным. Отмечалась тенденция к снижению числа бактерий E. œli RB2 за счет их лизиса в результате конъюгативного переноса плазмиды, который был достаточно эффективным (частота 2,46х10_2±3,02х10~2). При совместном росте E. coli ZP и RB4 число клеток E. coli ZP к достижению стационарной фазы, напротив, снижалось. По-видимому, на этом этапе проявлялась антагонистическая активность штамма APEC, обусловленная синтезом бактериоцина, который индуцируется увеличением плотности культуры, начиная с конца логарифмической фазы роста. Учитывая, что бактерии E. coli RB4 нечувствительны к ColE7, а частота конъюгации была невысока, соотношение клеток через 24 ч в этой паре вполне объяснимо. Интересно, что в смешанной культуре E. coli ZP и RB3, в которой RB3 также продуцирует бактериоцины, но чувствителен к ColE7, антагонистической активности между штаммами не наблюдалось.
На среде М9 (см. рис. 2, Б, Г, Е) соотношение между E. coli ZP и RB2 не менялось, в то время как APEC, продуцирующие колицины (RB3 и RB4), подавляли рост киллерного донора в конце логарифмической— начале стационарной фазы. Однако отсутствие достоверных различий между ассоциантами в конце культивирования, по-видимому, может быть связано с неэффективной конъюгацией со стороны E. coli ZP и низкой интенсивностью синтеза колицинов реципиентами (RB3 и RB4) при росте на бедной культуральной среде.
В предварительных исследованиях по конъюгативному переносу плазмиды in vivo в кишечнике крыс и перепелов не были обнаружены бактерии E. coli, устойчивые к ампициллину, хлорамфениколу и гентамицину. На крысиной модели в I группе на 3-и сут после введения штаммов число жизнеспособных клеток контрольного донора и реципиента в среднем составило соответственно 3,50х104±2,15х103 и 3,54х103±1,23х103 КОЕ/г (табл. 3). Трансконъюгантные E. coli с фенотипом AmprCmr были детектированы на 3-и сут после введения реципиента, в среднем их число составило 2,15х102±1,75х102 КОЕ/г, частота конъюгации — 6,07х10"2±5,58х10"2. В этой группе наблюдался рост числа клеток как донора, так и реципиента в течение всего времени эксперимента. Во II группе число жизнеспособных клеток киллерного донора и реципиента на 3-и сут составляло соответственно 1,50х104±1,25х103 и 2,19х103±1,25х103 КОЕ/г. В последующие сроки количество клеток E. coli ZP увеличивалось до 107 КОЕ/г, в то время как число клеток реципиентов после первого введения возросло незначительно. Трансконъюганты в этой группе не обнаружили ни в один из контрольных сроков. В группе животных, которые не получали донорные штаммы, во все сроки бактерии E. coli, устойчивые к ампициллину, хло-рамфениколу и гентамицину, не были детектированы.
Учитывая результаты колонизации кишечника крыс донорными штаммами в предварительном эксперименте, в модели с маньчжурскими перепелами введение реципиента и оценку конъюгативного переноса проводили на более ранних сроках. Уже через 2 сут после применения бактериальной суспензии численность клеток донорного и киллерного штаммов E. coli в кишечнике птицы составила соответственно 2,70х106±2,01х105 и 8,12х105±2,22х105 КОЕ/г. Частота конъюгативного переноса в I группе
LO
to
3. Число клеток доноров, реципиентов, трансконъюгантов (КОЕ/г) и частота конъюгации в условиях кишечного тракта крыс линии Wistar и маньчжурских перепелов в экспериментах по конъюгативному переносу плазмиды pOX38 в штаммы APEC (avian pathogenic Escherichia coli)
(M+SEM)
Срок, сут
I группа, E. coli N4i (контрольный донор)
D
R
T
Y
II группа, E. coli ZP (киллерный донор)
KD
R
T
Y
Крысы н.о н.о
н.о н.о
2Д5х102±1,75х102 6,07х10-2±5,58х10-2 4,11х104±4,00х103 7,87х 10-2±8,32х 10-3 6,15х104±1,02х 103 7,08х10-3±9,64х10-4 Перепела н.о н.о
5,00х 103±1,12х 103 1,00х 10-2±1,12х 10-1 1,05х 104± 1,11х104 3,44х 10-3±2,46х 10-3 4,18х105±4,00х 105 4,58х10-2±2,12х 10-1
Примечание. D — контрольный донор, КD — киллерный донор, R — реципиент, Т — трансконъюгант, Y — частота конъюгативного переноса, н.о. — не определяли. а Различия с показателями на начало эксперимента статистически значимы при р < 0,05 (Л — по группам относительно соответственно 3-х и 1-х сут, R — относительно 10-х и 2-х сут, ЕЛ — относительно 3-х и 1-х сут).
ь Различия с показателями в группе с контрольным донором статистически значимы при р < 0,05.
3-и 6-е 10-е 14-е 21-е
1-е
2-е
3-и 6-е
3,50х104±2,15х103 7,21х105±5,29х104 2,96х 106±2,01х 106 а 1,26х 107±8,64х 106 а 7,25х107±2,35х107 а
8,00х 103±5,21х 103 2,70х 106±2,01х 105 а 4,45х106±3,05х106 а 6,42х 107±6,16 х 107 а
н.о н.о
3,54х 103±1,23 х 103 5,21х 105±2,13х104 8,69х 106±5,55х 106 а
н.о
5,00х 105±4,55 х 105 3,05х106±2,41х105 9,12х 106±7,15 х 106 а
1,50х 104±1,25 х 103 2,34х 105±1,74х 105 а 5,97х105±2,58х105 а 5,64х 107±8,96х 106 а 2,23х107±1,00х 107 а
5,04х 104±1,22х 104 8,12х 105±2,22х 105 1,74х 106±1,96х 106 а 2,57х 107±3,01х 107 а
н.о н.о
2,19х 103±1,25 х 103 4,22х 104±2,36х 104 5,91х 104±4,98 х103 b
н.о
4,68х104±2,25х104 7,39х 105±5,57х 105 8,29х 105±5,55х 105 b
н.о н.о 0,00 0,00 0,00
н.о 0,00 0,00 0,00
н.о н.о 0,00 0,00 0,00
н.о 0,00 0,00 0,00
(контрольный донор) оставалась равной 10_2-10_3 в течение 6 сут наблюдения. Аналогично эксперименту с крысиной моделью, трансконъюганты во II группе (киллерный донор) не были обнаружены ни в один из сроков. В контроле бактерии E. соН, устойчивые к ампициллину, хлорамфениколу и гентамицину, обнаружены не были.
Создание новых методов и средств специфической профилактики и/или терапии бактериальных инфекций сельскохозяйственных животных активно осуществляется в России и за рубежом (31). Поддержание эффективного симбиоза между организмом птицы и кишечной микробиотой — необходимый компонент успешной кормовой стратегии и сохранения поголовья. Разрабатываются высокоэффективные пробиотические препараты, способные контролировать размножение возбудителей эшерихиозов, саль-монеллезов, кампилобактериозов и других инфекций в кишечнике птицы. Представлены доказательства того, что бактериоцины могут заменить антибиотики в сельском хозяйстве.
Поиск микроорганизмов — продуцентов бактериоцинов, которые можно использовать в качестве пробиотиков, ведется исследователями постоянно. M.A.C. Torshizi с соавт. (32) провели скрининг молочнокислых бактерий, выделенных из образцов кишечника цыплят, и обнаружили два изолята (Lactobacillus fermentum и Lactobacillus rhamnosus), способных инги-бировать рост эшерихий in vitro. S.T. Ogunbanwo с соавт. (33) изучили потенциальную терапевтическую эффективность бактериоциногенного штамма Lactobacillus plantarum при экспериментальной инфекции E. coli у цыплят-бройлеров. Штамм E. coli S5/98, продуцирующий микроцин В 5/98 с широким спектром антагонистической активности против бактерий родов Escherichia, Salmonella, Klebsiella, выделенный из фекалий взрослой свиньи, уже используют для производства пробиотика микроцикола в жидкой и сухой форме (34). Испытание микроцикола при выращивании цыплят-бройлеров показало, что препарат представляет собой эффективное средство регуляции кишечной микрофлоры, повышения неспецифической резистентности, сохранности и продуктивности птицы, а также улучшения качества мяса (35). Колицины, класс бактериоцинов, продуцируемых E. coli и действующих против представителей близкородственных таксонов, были исследованы в качестве возможной альтернативы антибиотикам: колицин Е1 ингибировал рост штаммов энтеропатогенной E. coli (ETEC) (36), а его добавление в рацион животных снижало частоту и тяжесть экспериментальной диареи, вызванной ETEC (37). Эти результаты показывают, что использование бактерий-продуцентов или чистых бактериоцинов при выращивании животных может положительно влиять на безопасность продуктов животноводства и птицеводства — основного источника диареегенных штаммов E. coli, вызывающих эшерихиозы и токсикоинфекции у человека.
Считается, что биопрепараты медицинского и ветеринарного назначения на основе рекомбинантных микроорганизмов с доказанной безопасностью можно направленно и эффективно использовать для лечения и профилактики разнообразных заболеваний (16). На сегодняшний день обосновано применение комбинированных пробиотических препаратов, сочетающих несколько культур с различными свойствами или искусственно сконструированных штаммов с множественной продукцией бактерио-цинов. Основу для разработки новых пробиотических препаратов составляют представители естественной желудочно-кишечной микробиоты, такие как молочнокислые бактерии (Lactobacillus и Bifidobacterium) и эшери-
хии, например E. coli Nissle 1917 (38). Будучи комменсальными микроорганизмами, они обычно оказывают терапевтический эффект сами по себе и выступают отличным материалом для инженерной синтетической биологии (39, 40). На основе штамма E. coli M17 и природного продуцента E. coli S5/98 с использованием векторов pColap и pPAL3 созданы рекомбинант-ный штамм E. coli M17 (pPAL4), продуцирующий микроцин В и колицин Е1, и штамм E. coli M17 (pPAL5), синтезирующий микроцин, но устойчивый к колицину Е1 (35). Предложен пробиотик ромакол на основе генно-инженерного штамма E. coli M17 (p74), образующего микроцин С51 (21).
Штамм E. coli ZP перспективен в качестве основы пробиотического препарата за счет возможности воздействия на устойчивые к антибиотикам и бактериоцинам энтеробактерии, циркулирующие в условиях птицеводческих и животноводческих комплексов. Введение клеток E. coli ZP увеличит общее содержание комменсальных эшерихий в кишечнике животных, подавляя при этом развитие патогенных представителей этого вида без заметного влияния на молочнокислую и бифидофлору. Эффективность штамма определяется альтернативной системой доставки колицина, что обеспечивает его высокую конкурентоспособность в различных экологических нишах, где могут присутствовать, в том числе, и продуценты бактериоцинов.
Таким образом, в смешанных культурах итог взаимодействия между штаммами Escherichia coli ZP и APEC (avian pathogenic E. coli) обусловлен не только скоростью роста культур и чувствительностью к бактерио-цинам, но и конъюгативным переносом плазмид. Совокупность этих факторов будет определять конкурентную динамику нового пробиотического штамма E. coli ZP и гетерогенных APEC в условиях желудочно-кишечного тракта птицы. Эксперимент in vivo показал, что штамм E. coli ZP способен эффективно заселять кишечник крыс и маньчжурских перепелов и сохраняться на протяжении длительного времени. Конъюгативный перенос плазмиды от контрольного донора в условиях кишечного тракта происходил с достаточно высокой частотой, в то время как в группе с киллер-ным донором трансконъюганты отсутствовали. Сниженное число клеток реципиентов во второй группе также доказывает эффективность действия изучаемого штамма на патогенные формы E. coli. Использование конъю-гативного механизма при создании нового пробиотического средства в птицеводстве соответствует мировым тенденциям. В полной мере раскрыть биотехнологический потенциал генно-модифицированного штамма E. coli ZP, в том числе его действие на зоотехнические показатели птицы, помогут дополнительные исследования. В частности, представляется важным изучение его эффективности при лечении и профилактике эше-рихиозов у животных и оценка терапевтического и противоэпидемического потенциала.
ЛИТЕРАТУРА
1. Фисинин В.И. Стратегические тренды развития мирового и отечественного птицеводства: состояние, вызовы, перспективы. В сб.: Мат. XIX Межд. конф. «Мировые и российские тренды развития птицеводства: реалии и вызовы будущего». Сергиев Посад, 2018: 9-48.
2. Нефедова В.Н., Майорова С.В. Российский рынок мяса птицы в 2001-2017. Экономика и Бизнес: теория и практика, 2017, 8: 60-64.
3. Мезенцев С.В., Телегин Н.Г. Профилактика инфекционных болезней птиц. БИО, 2004, 10: 5-8.
4. Miles T.D., McLaughlin W., Brown P.D. Antimicrobial resistance of Escherichia coli isolates from broiler chickens and humans. BMC Veterinary Research, 2006, 2(7): 1-9 (doi: 10.1186/1746-6148-2-7).
5. Koga V.L., Rodrigues G.R., Scandorieiro S., Vespero E.C., Oba A., de Brito B.G., de Bri-to K.C.T., Nakazato G., Kobayashi R.K.T. Evaluation of the antibiotic resistance and virulence of Escherichia coli strains isolated from chicken carcasses in 2007 and 2013 from Parana, Brazil. Foodborne Pathogens and Disease, 2015, 12(6): 479-485 (doi: 10.1089/fpd.2014.1888).
6. Mora A., Viso S., Lypez C., Alonso M.P., García-Garrote F., Dabhi G., Mamani R., Herrera A., Marzoa J., Blanco M., Blanco J.E., Moulin-Schouleur M., Schouler C., Blanco J. Poultry as reservoir for extraintestinal pathogenic Escherichia coli O45:K1:H7-B2-ST95 in humans. Veterinary Microbiology, 2013, 167(3-4): 506-612 (doi: 10.1016/j.vetmic.2013.08.007).
7. Antimicrobial resistance: Global report on surveillance. WHO Library Cataloguing-in-Publication Data, 2014.
8. Проект Распоряжения Правительства Российской Федерации «Об утверждении Стратегии предупреждения и преодоления устойчивости микроорганизмов и вредных организмов растений к лекарственным препаратам, химическим и биологическим средствам на период до 2030 года и дальнейшую перспективу» (подготовлен Минздравом России 08.06.2017).
9. Jadhav K., Sharma K.S., Katoch S., Sharma V.K., Mane B.G. Probiotics in broiler poultry feeds: a review. International Journal of Animal and Veterinary Science, 2015, 2: 4-16.
10. Bidarkar V.K., Swain P.S., Ray S., Dominic G. Probiotics: potential alternative to antibiotics in ruminant feeding. Trends in Veterinary and Animal Sciences, 2014, 1: 1-4.
11. Parker R.B. Probiotics the other half of the antibiotics story. Animal Nutrition and Health, 1974, 29: 4-8.
12. Kavitha R.B., Desai J., Deepika Reddy A.R., Radhakrishna P.M. Effect of probiotics supplementation on the performance of broilers. Indian Journal of Animal Nutrition, 2007, 24(3): 142-146.
13. Рождественская Т.Н., Яковлев С.С., Кононенко Е.В. Профилактика сальмонеллеза птиц. Животноводство, 2012, 1(1): 54-56.
14. Сушкова В.И., Устюжанинова Л.В. Перспективы развития производства кормовых про-биотиков. Кормопроизводство, 2017, 3: 34-40.
15. Higgins J.P., Higgins S.E., Vicente J.L., Wolfenden A.D., Tellez G., Hargis B.M. Temporal effects of lactic acid bacteria probiotic culture on Salmonella in neonatal broilers. Poultry Science, 2007, 86(8): 1662-1666 (doi: 10.1093/ps/86.8.1662).
16. Старовойтова С.А., Скроцкая О.И. Пробиотики на основе трансгенных микроорганизмов. Biotechnologia Acta, 2013, 6(1): 34-45.
17. Лебедева И.А., Проккоева Ж.А., Щепеткина С.В. Эффективность применения в птицеводстве биокомплексов на основе пробиотических штаммов. Мат. Межд. науч.-практ. конф. «Биотехнология и общество в XXI веке». Барнаул, 2015: 370-374.
18. Crittenden R., Bird A.R., Gopal P., Henriksson A., Lee Y.K., Playne M.J. Probiotic research in Australia, New Zealand and the Asia-Pacific region. Current Pharmaceutical Design, 2005, 11(1): 37-53 (doi: 10.2174/1381612053382304).
19. Ушакова Н.А., Некрасов Р.В., Правдин В.Г., Кравцова Л.З., Бобровская О.И., Павлов Д.С. Новое поколение пробиотических препаратов кормового назначения. Фундаментальные исследования, 2012, 1: 184-192.
20. Лившиц В.А., Чеснокова В.Л., Алешин В.В., Сокуренко Е.В., Далин М.В., Кравцов Э.Г., Быков В.А. Штамм бактерий Escherichia coli m17 fimh::kan/p colap, используемый для получения пробиотического препарата. (РФ) МПК7 C 12 N 1/21, A 61 K 35/74. № 2144954. За-явл. 15.01.98. Опубл. 27.01.2000.
21. Соколова Н.А., Хмель И.А., Шегидевич Э.А. Использование ромакола в ветеринарии. Ветеринария, 2001, 11: 46-49.
22. Budic M., Rijavec M., Petkovsek Z., Zgur-Bertok D. Escherichia coli bacteriocins: antimicrobial efficacy and prevalence among isolates from patients with bacteraemia. PLoS ONE, 2011, 6(12): e28769 (doi: 10.1371/journal.pone.0028769).
23. Filutowicz M., Burgess R., Gamelli R.L., Heinemann J.A., Kurenbach B., Rakowski S.A., Shankar R. Bacterial conjugation-based antimicrobial agents. Plasmid, 2008, 60(1): 38-44 (doi: 10.1016/j.plasmid.2008.03.004).
24. Maslennikova I.L., Kuznetsova M.V., Toplak N., Nekrasova I.V., Zgur-Bertok D., Starcic Er-javec M. Estimation of the bacteriocin ColE7 conjugation-based «kill»—«anti-kill» antimicrobial system by real-time PCR, fluorescence staining and bioluminescence assays. Letters in Applied Microbiology, 2018, 67(1): 47-53 (doi: 10.1111/lam.12884).
25. Starcic Eq'avec M., Petkovsek Z., Kuznetsova M.V., Maslennikova I.L., Zgur-Bertok D. Strain ZP — the first bacterial conjugation-based «kill»—«anti-kill» antimicrobial system. Plasmid, 2015, 82: 28-34 (doi: 10.1016/j.plasmid.2015.10.001).
26. Versalovic J., Koeuth T., Lupski J.R. Distribution of repetitive DNA sequences in eubacteria
and application to fingerprinting of bacterial genomes. Nucleic Acids Research, 1991, 19(24): 6823-6831 (doi: 10.1093/nar/19.24.6823).
27. Clermont O., Christenson J.K., Denamur E., Gordon D.M. The Clermont Escherichia coli phylo-typing method revisited: improvement of specificity and detection of new phylo-groups. Environmental Microbiology Reports, 2013, 5(1): 58-61 (doi: 10.1111/1758-2229.12019).
28. Guglielmetti E., Korhonen J.M., Heikkinen J., Morelli L., von Wright A. Transfer of plasmid-mediated resistance to tetracycline in pathogenic bacteria from fish and aquaculture environments. FEMS Microbiology Letters, 2009, 293(1): 28-34 (doi: 10.1111/j.1574-6968.2009.01512.x).
29. Merritt J.H., Kadouri D.E., O'Toole G.A. Growing and analyzing static biofilm. Current Protocols in Microbiology, 2005, 00(1): 1B.1.1-1B.1.18 (doi: 10.1002/9780471729259.mc01b01s00).
30. ГОСТ 34088-2017. Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными. Правила содержания и ухода за сельскохозяйственными животными. М., 2018.
31. Gillor O., Kirkup B.C., Riley M.A. Colicins and microcins: the next generation of antimicrobials. Advances in Applied Microbiology, 2004, 54: 129-146 (doi: 10.1016/S0065-2164(04)54005-4).
32. Karimi Torshizi M.A., Rahimi S.H., Mojgani N., Esmaeilkhanian S., Grimes J.L. Screening of indigenous strains of lactic acid bacteria for development of a probiotic for poultry. Asian-Australasian Journal of Animal Science, 2008, 21(10): 1495-1500 (doi: 10.5713/ajas.2008.80081).
33. Ogunbanwo S.T., Sanni A.I., Onilude A.A. Influence of bacteriocin in the control of Escherichia coli infection of broiler chickens in Nigeria. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2004, 20(1): 51-56 (doi: 10.1023/B:WIBI.0000013311.43842.74).
34. Тараканов Б.В. Штамм бактерий Escherichia coli, используемый для производства пробио-тика микроцикола В5/98. (РФ) МПК C 12 N 1/20, A 61 K 35/74, C 12 R 1/19. № 2268297. Заявл. 29.12.03. Опубл. 20.01.06. Бюлл. № 02.
35. Тараканов Б.В., Алёшин В.В., Николичева Т.А., Полякова Л.Л., Яковлева А.А., Никулин В.Н., Палагина Т.Е. Клонирование генов синтеза микроцина типа В и исследование сукцессии микробиоциноза кишечного тракта животных при введении природных и рекомбинантных продуцентов микроцинов и бактериоцинов. Проблемы биологии продуктивных животных, 2008, 1: 20-36.
36. Stahl C.H., Callaway T.R., Lincoln L.M., Lonergan S.M., Genovese K.J. Inhibitory activities of colicins against Escherichia coli strains responsible for postweaning diarrhea and edema disease in swine. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2004, 48(8): 3119-3121 (doi: 10.1128/AAC.48.8.3119-3121.2004).
37. Cutler S.A., Lonergan S.M., Cornick N., Johnson A.K., Stahl C.H. Dietary inclusion of colicin E1 is effective in preventing postweaning diarrhea caused by F18-positive Escherichia coli in pigs. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2007, 51(11): 3830-3835 (doi: 10.1128/AAC.00360-07).
38. Sonnenborn U. Escherichia coli strain Nissle 1917 — from bench to bedside and back: history of a special Escherichia coli strain with probiotic properties. FEMS Microbiology Letters, 2016, 363(19): fnw212 (doi: 10.1093/femsle/fnw212).
39. Chua K.J., Kwok W.C., Aggarwal N., Sun T., Chang M.W. Designer probiotics for the prevention and treatment of human diseases. Current Opinion in Chemical Biology, 2017, 40: 8-16 (doi: 10.1016/j.cbpa.2017.04.011).
40. Álvarez B., Fernández L.A. Sustainable therapies by engineered bacteria. Microbiology and Biotechnology, 2017, 10(5): 1057-1061 (doi: 10.1111/1751-7915.12778).
Институт экологии и генетики микроорганизмов Поступила в редакцию
УрО РАН — филиал Пермского федерального 12 января 2020 года
исследовательского центра УрО РАН, 614000 Россия, г. Пермь, ул. Голева, 13,
e-mail: info@iegm.ru, mar@iegm.ru Н, i.maslennikova1974@gmail.com, gizatullina.julia@yandex.ru;
2Department of Biology, Biotechnical Faculty, University of Ljubljana, Jamnikarjeva 101, 1000 Ljubljana, Slovenia, e-mail: biologija@bf.uni-lj.si, darja.zgur@bf.uni-lj.si, marjanca.starcic.erjavec@bf.uni-lj. si
Sel'skokhozyaistvennaya biologiya [Agricultural Biology], 2020, V. 55, № 2, pp. 364-377
А PROBIOTIC BASED ON THE Escherichia coli ZP STRAIN. I. EFFICIENCY ASSESSMENT OF THE CONJUGATIVE TRANSFER OF THE COLICIN E7 ACTIVITY GENE INTO AVIAN PATHOGENIC E. coli STRAINS in vitro AND in vivo
M.V. Kuznetsova1, I.L. Maslennikova1, J.S. Gizatullina1, D. Zgur Bertok2,
M. Starcic Erjavec2
institute of Ecology and Genetics of Microorganisms, Perm Federal Research Center of Ural Branch RAS, 13, ul. Goleva, Perm, 614081 Russia, e-mail info@iegm.ru, mar@iegm.ru (H corresponding author), i.maslennikova1974@gmail.com, gizatullina.julia@yandex.ru;
2Department of Biology, Biotechnical Faculty, University of Ljubljana, Jamnikarjeva 101, 1000 Ljubljana, Slovenia,
e-mail biologija@bf.uni-lj.si, darja.zgur@bf.uni-lj.si, marjanca.starcic.erjavec@bf.uni-lj.si
ORCID:
Kuznetsova M.V. orcid.org/0000-0003-2448-4823 Zgur Bertok D. orcid.org/0000-0003-4166-552X Maslennikova I.L. orcid.org/0000-0002-2776-8023 Starcic Erjavec M. orcid.org/0000-0003-0200-573X Gizatullina J.S. orcid.org/0000-0001-9625-1151 The authors declare no conflict of interests Acknowledgements:
Supported financially by the Government of the Perm Krai within the framework of the scientific project No. C-26/792, and by Slovenian Research Agency (ARRS), grant Nos. P1-0198 and BI-RU/16-18-047 Received January 12, 2020 doi: 10.15389/agrobiology.2020.2.364eng
Abstract
The protection of farm animals against infectious diseases is a priority in veterinary medicine. The wide spread of pathogenic and opportunistic bacteria resistant to antibiotics on poultry farms requires the development of modern methods to maintain the health of birds in industrial production. A promising direction to improve measures to prevent and limit the spread of pathogens resistant to antimicrobial agents is the use of targeted bacterial drugs — probiotics. Veterinary probi-otics based on genetically modified microorganisms can be used for the treatment and prophylaxis of infectious diseases in farm animals. We demonstrated the antagonistic effect of the genetically modified Escherichia coli ZP strain against agents of avian colibacillosis, the avian pathogenic Escherichia coli (APEC) in both in vitro and in vivo models. The colE7 gene (colicin E7 synthesis gene) carried on a conjugative plasmid was efficiently transferred by conjugation in conditions of planktonic and biofilm growth in vitro. The E. coli ZP strain was shown to actively colonize the intestine of rats and quails and to contribute to beneficial effects of the microbiota. Our aim was to evaluate the competitive ability of the E. coli ZP strain as well as the efficiency of killing APEC based on the conjugative transfer of the colE7 gene, encoding a DNasae, in vitro and in vivo. We used the ColE7-mediated kill—anti-kill system based on the Nissle 1917 probiotic strain, the genetically modified E. coli ZP strain (killer donor) carrying the colE7 gene on the conjugative plasmid pOX38a, as well as the im-mE7 gene (colicin E7 immunity gene) on the chromosome. As control, the E. coli N4i strain without colE7 gene on the conjugative plasmid pOX38 (control donor) was used. Six APEC strains with resistance to ampicillin isolated from organs of broilers with colibacillosis were used as recipients in performed conjugation assays. The phylogenetic group of used APEC strains was detected with quadruplex PCR. The conjugation transfer was conducted in Luria-Bertani (LB) medium in immunological polystyrene 96-walls flat bottom plates in plankton and in biofilm culture. The experiments with rats (Wistar line) and Manchurian quail (Coturnix coturnix) were conducted in the vivarium of the Wagner Perm State Medical University. The competitive ability of E. coli ZP strain was confirmed in co-cultivation assays with APEC strains, including bacteriocin producers, in various models. Conjugative colE7 gene transfer to APEC was detected in vitro in plankton and in biofilm: in experiments with the control donor strain E. coli N4i the conjugation frequency varied from 10 ~6 to10~2. In vivo, it was shown that E. coli ZP strain was able to effectively colonize the rat (line Wistar) and Manchurian quail (Coturnix coturnix) intestine and persist there at least for a month. Introduced E. coli ZP cells increased the total amount of commensal Escherichia in the intestine of the animals and reduced the growth of the pathogenic microbes without affecting the lactic acid bacteria. The transfer ability of the conjugative plasmid pOX38 in the intestinal tract of both animal species was demonstrated. The conjugation in the intestinal tract occurred with a high frequency, on average 10~2. No transconjugants were detected in both in vitro and in vivo experiments with the E. coli ZP strain harboring the conjugative plasmid pOX38a; the recipient cells that received the colE7 gene via the conjugative transfer expressed it and were lysed due to the colicin DNase activity. This was reflected in the number of APEC recipient cells, it was namely reduced in the assays with the ZP strain. The results obtained indicated that the E. coli ZP strain was able to colonize the intestine of animals and had antibacterial activity against enteropathogens due to the conjugative mechanism of colicin gene transfer. As the ZP strain was also effective on APEC cells that were resistant and tolerant to bacte-riocins, it has the potential to become the basis for a highly effective new generation of probiotics.
Keywords: colicins, ColE7, conjugative transfer, kill—anti-kill system, antibiotic alternative, probiotics, avian pathogenic Escherichia coli (APEC), animal models.
