CC BY
38
УДК 579.61; 579.861.2; 616-095
Е. В. ЛИСКОВА, С. Б. КИРГИЗОВА, О. О. ЖЕРЕБЯТЬЕВА, Е. А. МИХАЙЛОВА, И. Э. ЛЯШЕНКО, М. В. ФОМИНА, Л. М. АЗНАБАЕВА
БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА STAPHYLOCOCCUS AUREUS И KLEBSIELLA PNEUMONIAE ПОД ВОЗДЕЙСТВИЕМ ПРЕПАРАТА ИНДУКТОРА ЭНДОГЕННОГО ИНТЕРФЕРОНА ИРС-19
ФГБОУ ВО «Оренбургский государственный медицинский университет» Минздрава России
E. V. LISKOVA, S. B. KIRGIZOVA, O. O. ZHEREBYATYEVA, E. A. MIKHAYLOVA, I. E. LYASHENKO, M. V. FOMINA, L. M. AZNABAYEVA
BIOLOGICAL PROPERTIES OF STAPHYLOCOCCUS AUREUS AND KLEBSIELLA PNEUMONIAE UNDER THE INFLUENCE OF THE DRUG OF THE INDUCTOR OF ENDOGENOUS INTERFERON IRS-19
FSBEI HE «Orenburg State Medical University» of the Ministry of Health of Russia
РЕЗЮМЕ
Изучено влияние препарата индуктора эндогенного интерферона ИРС-19 на биологические свойства Staphylococcus aureus и Klebsiella pneumoniae, изолированных со слизистой оболочки больных ОРВИ. Выявлено модифицирующее действие препарата ИРС-19 in vitro на штаммы микроорганизмов, а именно установлено, что препарат подавлял персистентный потенциал K. pneumoniae и S. aureus (антилизоцимную
Лискова Елена Викторовна - к. м. н., ассистент кафедры микробиологии, вирусологии, иммунологии; тел. 8 (3532) 500-606 (доб. 205); e-mail: k_microbiology@orgma.ru
Киргизова Светлана Борисовна - к. б. н., доцент кафедры микробиологии, вирусологии, иммунологии; тел. 8 (3532) 500-606 (доб. 205); e-mail: infosector@mail.ru
Жеребятьева Ольга Олеговна - к. м. н., доцент кафедры микробиологии, вирусологии, иммунологии; тел. 8 (3532) 500-606 (доб. 205); e-mail: fenixmih@yandex.ru
Михайлова Елена Алексеевна - д. б. н., заведующая кафедрой микробиологии, вирусологии, иммунологии; тел. 8 (3532) 500-606 (доб. 205); e-mail: lelenaalekseevna@yandex.ru
Ляшенко Ирина Эдуардовна - к. м. н., доцент кафедры микробиологии, вирусологии, иммунологии; тел. 8 (3532) 500-606 (доб. 205); e-mail: lyashenko.64@inbox.ru
Фомина Марина Викторовна - к. м. н., доцент кафедры микробиологии, вирусологии, иммунологии; тел. 8 (3532) 500-606 (доб. 205); e-mail: fomina_m.v@mail.ru
Азнабаева Лилия Мидехатевна - к. м. н., доцент кафедры микробиологии, вирусологии, иммунологии; тел. 8 (3532) 500-606 (доб. 205); e-mail: lkhus@yandex.ru
активность и биопленкообразование), а также снижал ростовые характеристики микроорганизмов. Оценка лечебного эффекта in vivo при использовании препарата ИРС-19 для терапии острых респираторных вирусных инфекций показала достоверное сокращением сроков заболевания и уменьшение количества осложнений у больных ОРВИ после перенесенного заболевания. Полученные данные показывают, что область применения препарата индуктора интерферона ИРС-19 можно значительно расширить, используя его как для лечения вирусных и бактериальных инфекций, так и для коррекции дисбиотических нарушений в микробиоценозах тела человека.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: ИНДУКТОР ИНТЕРФЕРОНА, ПРЕПАРАТ ИРС-19, KLEBSIELLA PNEUMONIAE, STAPHYLOCOCCUS AUREUS, БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА.
SUMMARY
The effect of the drug inducer of endogenous interferon IRS-19 on the biological properties of Staphylococcus aureus and Klebsiella pneumoniae isolated from the mucous membrane of SARSpatients was studied. The modifying effect of IRS-19 in vitro on microbial strains was revealed, namely, it was found that the drug suppressed the persistent potential of K. pneumoniae and S. aureus (antilysocymal activity and biofilm formation), as well as reduced the growth characteristics of microorganisms.
Evaluation of the therapeutic effect in vivo while using the drug IRS-19 for the treatment of acute respiratory viral infections showed a significant reduction in the duration of the disease and a decrease in the number of complications in patients with SARS after the disease. The obtained data show that the scope of the drug interferon inducer IRS-19 can be significantly expanded if it is used both for the treatment of viral and bacterial infections, and for the correction of dysbiotic disorders in the microbiocenosis of the human body.
KEY WORD: INDUCER OF INTERFERON, IRS-19, KLEBSIELLA PNEUMONIAE, STAPHYLOCOCCUS AUREUS, BIOLOGICAL PROPERTIES.
АКТУАЛЬНОСТЬ
Острые респираторные заболевания остаются до настоящего времени неуправляемыми инфекциями, наносящими существенный ущерб здоровью населения и экономике стран во всем мире [16]. Массовые поражения людей, инициированные вирусами гриппа и вирусами иных таксономических групп, с сезонной периодичностью продолжают отмечаться во всех уголках планеты и практически во всех странах мира [8]. Острые респираторные вирусные инфекции (ОРВИ) представляют одну из медицинских проблем здравоохранения, а способы борьбы с ними не достигли высоких результатов [15]. Существуют данные о роли вирусной инфекции, потенцирующей развитие бактериальных осложнений [9]. Известно, что бактериальные осложнения при острых респираторных вирусных инфекциях вызываются условно-патогенной микрофлорой [13].
Установлено, что персистентный потенциал микроорганизмов, представляющий совокупность биологических свойств бактерий в условиях их адаптации к хозяину, имеет значение в стабильности и пластичности микросимбиоце-ноза верхних дыхательных путей [1, 7]. Работы, посвященные изучению количественных и качественных изменений микрофлоры верхних дыхательных путей при острых респираторных вирусных инфекциях, многочисленны, однако изменение микросимбиоценоза и биологических свойств микросимбионтов слизистой верхних
дыхательных путей при ОРВИ и возможные пути их коррекции, а также роль микробного фактора, определяющего характер течения и вероятность развития бактериальных осложнений при острых респираторных вирусных инфекций, изучена недостаточно [9, 13].
Среди наиболее интенсивно разрабатываемых в последние годы лекарственных средств антивирусные препараты занимают одно из первых мест, при этом особую значимость приобретают препараты, влияющие на механизмы естественного (врожденного) иммунитета (интерферо-ны и их индукторы) [2]. Главной особенностью препаратов является широкий спектр биологической активности, выявленный в процессе многолетнего клинического применения, но если механизм действия на макроорганизм подробно описан [10, 11, 14], то характер их влияния на биологические свойства бактериальных патогенов изучен недостаточно.
ИРС-19 - иммуностимулирующий препарат, полученный на основе бактериальных лизатов и представляющий собой респираторный спрей, содержащий микробную взвесь антигенов. Известно, что ИРС-19 способен оказывать влияние на специфический и неспецифический иммунитет человека, при местной иммунизации сорбированные антигены препарата стимулируют в слизистой оболочке верхних дыхательных путей выработку антител, секреторного IgA (sIgA), усиливают фагоцитоз, осуществляемый альвеолярными макрофагами, способствуют увеличению содержания лизоцима, комплемента, опсони-нов, пропердина и эндогенного интерферона [6]. В литературе имеются работы по практическому применению препарата ИРС-19 для профилактики ОРВИ, но не отражено влияние препарата ИРС-19 на биологические свойства микроорганизмов, изолированных из микробиоценоза верхних дыхательных путей [10, 11].
Staphylococcus aureus и Klebsiella pneumoniae, обладающие высокой этиологической значимостью в патологии человека и встречающиеся в микробиоценозах верхних дыхательных путей в 34,6% и 26,9% случаев у пациентов с осложненным течением ОРВИ, могут стать причиной
не только развития дисбиотических изменений [4], но и благодаря наличию набора биологических, в частности персистентных, свойств способны вызвать развитие целого ряда гнойно-воспалительных заболеваний различной локализации [5].
В связи с вышесказанным нами была предпринята попытка оценить способность препарата индуктора эндогенного интерферона ИРС-19 оказывать влияние на биологические свойства представителей микробиоценоза верхних дыхательных путей, таких как Staphylococcus aureus и Klebsiella pneumoniae.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
При изучении влияния препарата индуктора эндогенного интерферона ИРС-19 на биологические свойства микроорганизмов были выбраны модельные штаммы микроорганизмов видов K. pneumoniae (n = 60) и S. aureus (n = 60), изолированные со слизистой верхних дыхательных путей пациентов с осложненным течением ОРВИ. Выделение и идентификацию S. aureus и K. pneumoniae проводили общепринятыми методами на основании морфологических, тинкториальных, куль-туральных свойств [3]; биохимический профиль оценивали с помощью тест-систем «STAPHYtest» фирмы LACHEMA (Чехия).
В экспериментальных условиях для изучения влияния ИРС-19 («ЭбботтХелскеа САС», Франция) на исследуемые культуры микроорганизмов проводили соинкубирование в стерильном бульоне Luria Bertani (LB-бульон) 0,1 мл микробной взвеси (0,5 McFarland) и препарата ИРС-19 в количестве: 0,025; 0,05; 0,1; 0,2 мл. Расчет доз, применяемых in vitro, производился с учетом терапевтических концентраций препарата при его интраназаль-ном применении. Контролем служили посевы, в которые вместо ИРС-19 добавляли соответствующий объем физиологического раствора (0,025; 0,05; 0,1; 0,2 мл). Посевы инкубировали при 37 °C в течение 18-24 часов. Рост контролировали турбидиметрически на спектрофотометре Elx 808 (BioTek, США) при X = 540 нм через каждые 20 мин. По полученным данным строили зависимости lg (D) = f (t). По тангенсу угла наклона определяли удельные скорости роста микроорганизмов в ц, ч-1.
Эксперименты по изучению влияния ИРС-19 на биологические свойства микроорганизмов проводили субингибиторной концентрацией, а именно при 1/2 МПК препарата [12]. Определение гемолитической, антилизоцимной активности (АЛА) и биопленкообразования (БПО) проводили фотометрическим методом [4, 17].
Определение антибиотикочувствительности (цефазолина - коммерческая марка «Biobasal AG», Швейцария, и ципрофлоксацина - коммерческая марка «Grünenthal GmbH», Германия) проводили методом серийных разведений в LB-бульоне. Минимальную подавляющую концентрацию (МПК) и минимальную бактерицидную концентрацию (МПБ) антибиотиков определяли в присутствии ИРС-19 (опыт) и без данного препарата (контроль).
Для клинической апробации препарата ИРС-19 были сформированы 2 группы пациентов. Первая опытная группа (24 человека) получала ИРС-19 по рекомендуемой схеме, и вторая - контрольная - группа (74 человека, группа сравнения) не получала данный препарат. Клинически оценка состояния больных осуществлялась ежедневно, с определением выраженности катарального и интоксикационного синдромов. Работа проводилась на базе ГБУЗ «Оренбургская областная клиническая инфекционная больница».
Статистическая обработка проводилась в компьютерной оболочке Windows с помощью процессора электронных таблиц Microsoft Office Excel-2003 и программы «Биостат» путем подсчета средней арифметической (M) и средней ошибки средней величины (m). Данные по определению регулирующего влияния ИРС-19 на биологические свойства микроорганизмов были подвергнуты статистической обработке непараметрическим методом с применением критерия Манна - Уит-ни и параметрическим методом с применением t-критерия Стьюдента и представляли в виде средней арифметической и ее ошибки (M ± m). Разница между сравниваемыми величинами считалась достоверной при значении р < 0,05. Все эксперименты проводили в двух сериях при трехкратном воспроизведении.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Для исследования влияния препарата ИРС-19 на ростовые характеристики и биологические свойства микроорганизмов в условиях in vitro были выбраны модельные штаммы S. aureus и K. pneumoniae, изолированные со слизистой верхних дыхательных путей пациентов с осложненным течением ОРВИ.
Количественная оценка влияния ИРС-19 на рост популяции изученных штаммов, с использованием удельной скорости роста микроорганизмов (ц, ч-1), позволила установить, что результат действия препарата ИРС-19 зависел от его дозы. Результаты эксперимента по влиянию дозы препарата на удельную скорость роста K. pneumoniae показали, что при дозе 0,025 мл препарата численность исследуемых микроорганизмов находилась в пределах физиологических колебаний. Выраженный подавляющий эффект ИРС-19 отмечался при культивировании микроорганизмов с 0,1 мл препарата, при котором происходило угнетение средней скорости роста бактерий до 0,1 ц, чЛ в сравнении с контролем 0,15 ц, ч-1. При этом наблюдался дозозависимый эффект препарата - с увеличением дозы фиксировалось усиление ингибирующего эффекта ИРС-19 на ростовые свойства микроорганизмов, так, при дозе 0,2 мл прирост микроорганизмов был равен 0 ц, ч-1, таким образом, минимальная подавляющая концентрация препарата для штаммов K. pneumoniae составила 0,2 мл. Аналогичные данные были получены при исследовании влияния ИРС-19 на ростовые свойства штаммов S. aureus. Как видно из полученных результатов, в опытных пробах с препаратом ИРС-19 наблюдался дозозависимый эффект, т. е. с увеличением дозы отмечалось усиление ингибирующего действия ИРС-19 на ростовые свойства микроорганизмов, что свидетельствует о бактериостатическом действии in vitro препарата ИРС-19 на ростовые свойства штаммов S. aureus и K. pneumoniae, изолированных со слизистой оболочки верхних дыхательных путей.
Далее было изучено влияние препарата на биологические свойства исследуемых штаммов
микроорганизмов, а именно факторы вирулентности и персистенции: гемолитическую и анти-лизоцимную активности, биопленкообразование и антибиотикочувствительность.
При изучении влияния препарата ИРС-19 на гемолитическую активность штаммов S. aureus и K. pneumoniae были получены следующие результаты. Оказалось, что ИРС-19 практически не оказывал модифицирующего действия на способность бактерий продуцировать токсин гемолизин. Средние уровни выраженности способности продукции гемолизина среди изученных штаммов до эксперимента составляли: в популяции штаммов K. pneumoniae - 40,6 ± 0,4% и S. aureus - 39,3 ± 0,4%, после инкубации с ИРС-19-41,8 ± 0,4% и 38,3 ± 0,3% случаев соответственно.
Формирование биопленочных сообществ является одной из основных стратегий выживания бактерий. Образование микроорганизмами биопленок сопровождается появлением перси-стентных клеток, обеспечивающих выживание популяции в условиях действия антимикробных факторов различного происхождения. В связи с этим на следующем этапе было изучено модифицирующее влияние препарата ИРС-19 на способность к биопленкообразованию исследуемых штаммов S. aureus и K. рneumoniaе. В результате эксперимента было установлено, что препарат ингибировал способность к биопленкообразованию штаммов K. pneumoniaе: среднее значение показателя биопленкообразования у штаммов K. pneumoniaе до эксперимента составило 0,75 ± 0,02 ед/ОП, а после соинкубирования с препаратом ИРС-19-0,38 ± 0,03 ед/ОП. Аналогичные результаты были получены и при воздействии препарата ИРС-19 на способность к биопленкообразованию штаммов S. aureus - наблюдалось достоверное ингибирование данного признака в среднем с 1,49 ± 0,03 ед/ОП до 1,22 ± 0,05 ед/ОП (р < 0,05).
Сходная направленность влияния препарата ИРС-19 была выявлена при исследовании его модифицирующего действия на антилизоцимную активность штаммов изученных микроорганизмов: так, до опыта среднее значение антилизоцимной активности штаммов K. pneumoniaе составляло 0,65 ± 0,02 мкг/мл*ОБ, а после соинкубирования
с препаратом ИРС-19-0,34 ± 0,03 мкг/мл*OD, у штаммов S. aureus способность ингибиро-вать лизоцим была в среднем равна показателю 0,68 ± 0,06 мкг/мл*OD, а после соинкубирования с препаратом ИРС-19-0,47 ± 0,03 мкг/мл*OD.
При изучении влияния на чувствительность к антибиотикам микроорганизмов в присутствии препарата ИРС-19 in vitro были выбраны наиболее часто применяемые в медицинской практике антибиотики двух разных групп - це-фазолин и ципрофлоксацин. Было выявлено, что минимальная подавляющая концентрация (МПК) ципрофлоксацина под действием препарата ИРС-19 снижалась: для K. рneumoniaе до опыта - 0,05 мг/мл, а после - 0,01 мг/мл, для S. aureus до опыта МПК - 0,5 мкг/мл, а после соинкубирования с препаратом - 0,1 мкг/мл. Также под действием препарата ИРС-19 отмечено снижение и минимальной бактерицидной концентрации (МБК) данного антибиотика: для K. рneumoniaе до опыта - 0,1 мг/мл, после воздействия препарата МБК составила 0,05 мг/мл; для S. аш-eus до опыта - 0,05 мг/мл, а после соинкубации с препаратом МБК - 0,01 мг/мл. При изучении модифицирующего действия препарата на совместное инкубирование цефазолина с изученными штаммами было установлено, что препарат ИРС-19 не оказывал существенного влияния на антибиотико-чувствительность микроорганизмов.
Для проверки действия клинической эффективности препарата проведен анализ лечебного эффекта ИРС-19 при острых респираторных вирусных инфекциях (грипп) в условиях стационара. Помимо общепринятой терапии больных гриппом был и ИРС-19, прием препарата осуществлялся больными три раза в день, на протяжении 5-7 дней (препарат ИРС-19 получали 24 человека). Для сравнительного анализа полученных результатов наблюдалась и группа из 74 человек с аналогичной патологией, лечившихся одновременно с основной группой, но без использования ИРС-19 (контрольная группа). Клиническая динамика отслеживалась ежедневно до полного стихания воспалительных явлений и выписки больных из стационара. Гиперемия, отечность слизистых оболочек верхних дыхательных путей
при использовании ИРС-19 уже на вторые сутки наблюдалась только у 33,3 ± 9,6% больных (против 41,7 ± 5,7% больных, не получавших препарат), а развитие осложнений после перенесенного вирусного заболевания было отмечено только у 4,2 ± 4,1% больных (против 20,8±5,2% группы сравнения). Длительность лечения составила 4,1 ± 0,04 койко-дня у пациентов, получавших ИРС-19, тогда как в контрольной группе - 5,1±0,04 койко-дня. Таким образом, у больных гриппом, получающих ИРС-19, наблюдалось сокращение сроков лечения и было отмечено снижение частоты осложнений после перенесенной вирусной инфекции.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
При изучении влияния препарата ИРС-19 in vitro на биологические свойства микроорганизмов было установлено, что препарат оказывал инги-бирующее действие на персистентный потенциал K. pneumoniae и S. aureus, а именно угнетал рост, снижал уровень выраженности антилизоцимной активности и биопленкообразования микроорганизмов. Кроме того, под действием ИРС-19 отмечалось снижение минимальной подавляющей и минимальной бактерицидной концентрации ципрофлоксацина. Изучение лечебного эффекта in vivo при использовании препарата ИРС-19 для терапии острых респираторных вирусных инфекций показало достоверное сокращение сроков заболевания и снижение количества осложнений у больных ОРВИ после перенесенного заболевания.
Таким образом, проведенные исследования по изучению действия препарата индуктора эндогенного интерферона ИРС-19 как в экспериментальных, так и клинических условиях показали, что ИРС-19 может быть препаратом выбора при лечении ОРВИ и пригоден для профилактики бактериальных осложнений (пневмоний, бронхитов, синуситов). Результаты проведенных исследований также свидетельствуют, что область применения индукторов интерферона, таких как ИРС-19, может быть значительно расширена использованием их как в качестве весьма перспективных лекарственных веществ, подавляющих персистентный потенциал патогенов, что может
иметь существенное значение в лечении и профи- так и коррекции дисбиотических нарушений лактике вирусных и бактериальных инфекций, в микробиоценозах тела человека.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Азнабаева, Л. М. Микробиологические критерии диагностики хронического тонзиллита у часто болеющих детей /Л. М. Азнабаева, Б. Я. Усвяцов // Педиатрия им. Сперанского. - 2012. - Т. 91, № 2. -С. 57-61.
2. Беседнова, Н. Н. Антиинфекционное, антитоксическое и антипаразитарное действие экзогенной ДНК / Н. Н. Беседнова, Т. С. Запорожец // Антибиотики и химиотерапия. - 2010. - Т. 55, № 7-8. - С. 46-54.
3. Биргер, М. О. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования/ М. О. Биргер. - М.: Медицина, 1982. - 462 с.
4. Бухарин, О. В. Персистенция микроорганизмов / О. В. Бухарин. - Екатеринбург: УрО РАН, 1999. -366 с.
5. Бухарин, О. В. Экология микроорганизмов человека / О. В. Бухарин, А. В. Валышев, Ф. Г. Гильмутдинова [и др.]. - Екатеринбург: УрО РАН, 2006. - 479 с.
6. Волгин, Р. В. Опыт применения бактериального лизата ИРС-19 для профилактики заболеваний органов дыхания в организованных коллективах/ Р.В. Волгин //Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. - 2005. - № 3. - С. 82-84.
7. Дерябин, Д. Г. Стафилококки. Этиология и па-тогенность /Д. Г. Дерябин. - Екатеринбург: УрО РАН, 2000. - 238 с.
8. Деева, Э. Г. Грипп. На пороге пандемии : руководство для врачей / Э. Г. Деева. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2008. - 208 с.
9. Егоров, А. Ю. Проблема бактериальных осложнений при респираторных респираторных вирусных инфекциях / А. Ю. Егоров //Microbiology Independent Research Journal. - 2018. - Т. 5, № 1. - С. 1-11.
10. Ершов, Ф. И. Антивирусные препараты / Ф. И. Ершов. - М., 2006. - 312 с.
11. Ершов, Ф. И. Использование иммуномодулято-ров при вирусных инфекциях / Ф. И. Ершов // Антибиотики и химиотерапия. - 2003. - Т. 48, № 6. - С. 27-32.
12. Кириллов, Д. А. Лекарственная регуляция перси-стентных свойств микроорганизмов : автореф. дис. ... канд. мед. наук/Д. А. Кириллов. - Оренбург, 2004. - 22 с.
13. Кочетков, П. А. Профилактика и лечение острых вирусных инфекций верхних дыхательных путей и их бактериальных осложнений / П. А. Кочетков, И. Ю. Мейтель // РМЖ. - 2016. - Т. 26, № 4. -С. 231-235.
14. Михайлова, Е. А. Санация стафилококкового бактерионосительства - новые возможности и перспективы / Е. А. Михайлова, С. Б. Киргизова, А. Ю. Миронов, О. О. Жеребятьева, Г. О. Махалова // Клиническая лабораторная диагностика. - 2015. -Т. 60, № 7. - С. 56-57.
15. Орлова, Н. В. Современные подходы к терапии острых респираторных вирусных инфекций верхних дыхательных путей/Н. В. Орлова, И. И. Чукаев // Медицинский совет. - 2017. - № 5. - С. 58-59.
16. Сельникова, Е. П. ОРВИ и грипп: в помощь практическому врачу /Е. П. Сельникова, О. В. Калюжин. -М., 2015. - 224 с.
17. O'Tool, G. A. Biofilm formation as microbial development / G. A. O'Tool [et al.] // Ann. Rev. Microbial. -2000. - V: 4. - P. 49-76.
