CC BY
30УДК 632.937.15
БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ПЕПТИДОВ И ГЕПТАЕНОВЫХ АРОМАТИЧЕСКИХ МАКРОЛИДОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ БТБ.ЕРТОМУСЕБ СИКУБОМЛЬЬиБ Р-21 И ОЬОЫБРОШБ Л-242 - ШТАММОВ-ПРОДУЦЕНТОВ ПОЛИФУНКЦИОНАЛЬНЫХ БИОПРЕПАРАТОВ ХРИЗОМАЛ И ГЛОБЕРИН ДЛЯ ЗАЩИТЫ РАСТЕНИЙ ОТ БОЛЕЗНЕЙ РАЗНОЙ ЭТИОЛОГИИ
И.И. Новикова, Ю.Д. Шенин, |А.Е. Цыпленков|, Т.С. Фоминых, П.В. Суика, И.В. Бойкова
Всероссийский НИИ защиты растений, Санкт-Петербург
Выделены и охарактеризованы соединения пептидной и полиеновой природы, входящие в состав метаболитных комплексов штаммов chrysomallus P-21 и gloЫsporus Л-242, обладающие фунгицидной активностью, в значительной степени повышающие болезнеустойчивость растительного организма в отношении ВТМ и препятствующие развитию вирусной инфекции томата.
В последние годы проблема создания эффективных микробиологических
средств защиты растений от болезней встала особенно остро в связи с развитием современных тенденций в растениеводстве, связанных с формированием концепции экологического земледелия, рассматривающей сельскохозяйственное производство как живую экосистему, образец которой взят из самой природы и которая представляет собой альтернативу интенсификации, специализации и химизации. Правила IFOAM (Международной федерации экологического земледелия) устанавливают рамки, которые считаются критерием экологичного хозяйствования на земле, однако предусматривают создание региональных систем земледелия в зависимости от местных условий.
Экологическое земледелие основано на восстановлении и активизации природных биологических циклов в системе земледелия, включающих микроорганизмы, почвенную флору и фауну, растения и животных. Подобный подход обеспечивает как сохранение генетического многообразия в земледельческой системе и ее окружении, так и охрану среды обитания диких животных и растений. В этой связи в качестве альтернативы химическим средствам защиты растений все большее применение находят биопрепараты на основе микроорганизмов и их метаболитов. Им присущи высокая специфичность, низкая токсичность, хо-
рошая совместимость с другими биологическими средствами защиты растений и быстрая деградация в естественных круговоротах веществ, что позволяет не нарушать природное равновесие в биоценозах в процессе их использования (Новикова, 2005а).
Основа полифункциональных биопрепаратов для защиты растений от болезней - штаммы микроорганизмов, обладающие комплексной биологической активностью, перспективные для регуляции численности ряда вредных объектов (фитопатогенных грибов, бактерий, вирусов, нематод и т.д.). Микроорганизмы, синтезирующие разнообразные биологически активные вещества, такие как антибиотики, ферменты и их ингибиторы, гормоноподобные вещества, не только обеспечивают длительную регуляцию численности популяций фитопатогенов. Комплексы БАВ, эффективно подавляющие размножение популяций фито-патогенных микроорганизмов и обладающие фиторегуляторной активностью, положительно влияют на рост и развитие, активизируют обмен веществ, повышают болезнеустойчивость и продуктивность растений. В ряде случаев их использование увеличивает в растениеводческой продукции содержание витаминов и белков и снижает концентрацию вредных соединений, в частности, нитратов. Таким образом, главная цель нашей работы - создание нового поколения экологически безопасных небиоцидных пре-
паратов полифункционального действия на вредные организмы, не оказывающих отрицательного влияния на окружающую среду.
В качестве основы биопрепаратов для фитосанитарной оптимизации агроэкоси-стем весьма перспективны штаммы ак-тиномицетов. Среди огромного биологического разнообразия одна из наиболее многочисленных групп актиномицетов -представители рода Streptomyces. В формировании супрессивности почвы по отношению к фитопатогенным грибам, помимо синтеза гидролаз, может быть очень существенной роль макролидных, полиеновых и пептидных антибиотиков стрептомицетов. Именно эта группа микроорганизмов наиболее перспективна для отбора штаммов - продуцентов новых полифункциональных биопрепаратов для защиты сельскохозяйственных культур от болезней.
В течение ряда лет на основе метабо-литных комплексов штаммов S. chryso-mallus Р-21 и S. globisporus Л-242 - активных антагонистов ряда фитопатоген-ных грибов, отобранных из Государственной коллекции микроорганизмов ВИЗР, проводится работа по созданию новых биопрепаратов. Ранее было показано, что метаболитные полифункциональные комплексы хризомал и глобе-рин, выделенные из этих штаммов, обладают фунгицидной, противовирусной и фиторегуляторной активностью (Новикова и др., 2002; Новикова, Бойкова, 2004; Новикова, 2005б; Новикова, Шенин,
Вестник защиты растений, 2, 2009 2005). Комплексный характер действия штаммов обусловлен сложностью компонентного состава их активных соединений, в состав которых входят вещества разной химической природы: пептидов и полиенов. Из мицелия штамма S. chrysomallus Р-21 - продуцента полифункционального биопрепарата хризо-мал, обладающего фунгицидными, фито-регуляторными и антивирусными свойствами, выделен комплекс, представляющий смесь полипептидного (хризо-мал-А), ароматических гептаеновых антибиотиков (хризомал-В), неполиенового антибиотика из группы олигомицинов (хризомал-С). Изучены физико-химические и биологические свойства полипептида - хризомала-А. На основании проведенных исследований хризомал-А был отнесен к группе пептидолактонов трео-нинового типа. Показана оригинальность его химического строения. Из мицелия штамма S. globisporus Л-242 выделен геп-таеновый комплекс (глоберин-А) и неполи-еновый компонент (глоберин-В).
Цель настоящего исследования - отработка условий выделения и углубленное изучение физико-химических и биологических свойств ароматических геп-таеновых и неполиеновых антибиотиков, входящих в состав метаболитных комплексов S. chrysomallus Р-21 и S. globisporus Л-242, с целью выявления индивидуальных соединений, ответственных за целевую активность штаммов-продуцентов полифункциональных биопрепаратов.
Методика
Для изучения антибиотических веществ, синтезируемых стрептомицетами, штаммы выращивали глубинным способом в колбах Эрленмейера в течение 5 суток на соево-глюкозной среде при 28 °С на качалке (200 об/мин). Биомассу отделяли центрифугированием в течение 30 мин (2000 об/мин).
Спектры ЯМР (1Н и 13С) получили на приборе "Вгискег" АС-200 (Германия) с рабочей частотой 200 МГц в растворе (CDз)2SO с внутренним стандартом ГМС. ИК-спектр регистрировали на спектрофотометре "Shimadzu" (Япония) в таблетках КВг. УФ-спектры получены на приборе СФ-26 (Россия). Удельное вращение измеряли на поляриметре А1-ЕПО (Россия), температуру плавления определили на столике Кофлера РНМК (Германия).
Высокоэффективную жидкостную хроматогра-
исследований
фию проводили на хроматографе "Waters", США. Использовали колонку, наполненную "Symmetry-С18" (250x4.6 мм). В качестве подвижной фазы служила система ацетонитрил - 0.05М H3PO4 (42:58). Детекцию осуществляли при 380 и 400 нм. Скорость элюции 1 мл/мин. Хроматографию в тонком слое сорбента проводили на пластинках "Silufol" (Чехия) в различных системах растворителей (указаны по тексту). Проявление веществ на хроматограммах осуществляли с помощью УФ-света, в парах иода и с тест-культурой Candida albicans.
Кислотный и щелочный гидролиз антибиотиков описаны ранее (Dutcher et al., 1963; Шенин, Круг-ликова, 1976).
Антимикробный спектр определяли методом серийных разведений в жидких питательных средах. Для определения специфической биологической активности использовали культуру фитопато-генного гриба Alternaría solani. Активность проверяли с использованием метода лунок в твердых питательных средах.
Выделение антибиотиков: 140 г мицелия штамма S. chrysomallus Р-21 экстрагировали дважды этанолом в соотношении 1:5 и 1:2 соответственно. Объединенные экстракты упарили до образования желтого маслянистого остатка (0.5 г). Последний, трижды по 50 мл, тщательно промыли гексаном. После сушки в вакуум-эксикаторе в остатке получили порошок серого цвета в количестве 0.3 г. Последний растворили в 20% изопропаноле и внесли в колонку с силикагелем L (100-160 ц). После удаления гексана в остатке получили маслянистый желтый продукт. После колоночной хроматографии на силикагеле (элюент гексан, гексан-этилацетат 1:1) получили 0.13 г желтого масла, имеющего в УФ-спектр максимум 225 нм (хризомал-С). В аналогичных условиях было получено масло желтого цвета при обработке суммарного препарата из S. globisporus Л-242 (глоберин-В).
Антибиотики хорошо растворимы в гексане и спиртах, нерастворимы в воде. В их УФ-спектрах имеется поглощение в области 225 нм и (при больших концентрациях) 280 (sh) нм. Неактивны в отношении бактерий, но активны в отношении дрожжей и грибов. Даны их хроматографические характеристики в ряде систем растворителей, изучены ИК- и ЯМР-спектры, качественные реакции. Антибиотики отнесены в группу олигомицинов (Smith et al., 1954; Marty, McCoy, 1959; Kobayashi, Nishino, 1987; Laatsch et al., 1993; Kim et al., 1999).
Затем колонку промыли 20% изопропанолом, отбирая фракции, имеющие поглощение при 380 нм. После удаления растворителей получили коричневый порошок (0.2 г) с Е1%1см при 380, равной 200. Полученное вещество растворили в минимальном количестве теплого диметилформамида и к раствору прибавили эфир до прекращения выпадения осадка. После 2-часовой экспозиции в холодильнике осадок отделили, промыли сухим эфиром и высушили. Операцию переосаждения повторили. Получили 0.07 г желтого порошка. Препарат растворили в метаноле и пропустили через колонку, наполненную сефадексом G-50. После удаления метанола получили аморфный гигроскопический порошок (0.05 г) желтого цвета с Е1%1см при 380 нм равном 920 (хризомал-В).
В таких же условиях был получен гептаеновый антибиотик из S. globisporus Л-242 (глоберин-А). Получили желто-коричневый порошок с Е1%1см при 380 нм равной 1010.
Для определения антагонистической и антибиотической активности лабораторных образцов биопрепарата использовали стандартные микробиологические методы лунок и блоков. В состав тест-культур входили представители грибов рр. Fusarium Lk : Fr, Verticillium Nees, Whetzelinia (Lib.) dBy, Phoma sp, Colletotrichum Sacc., Bipolaris Sacc., Septoria Fr., Alternaria Nees, Ascochyta Lib,
Pythium и бактерий рр. Pseudomonas Migula 1894, Clavibacter Davis, Gillaspie, Vidaver, Harris 1984, Xanthomonas и Erwinia Winslow, Broadhurst, Buchanan, Krumwiede Roders and Smith. Учет антагонистической активности по диаметру подавления роста тест-культур проводили через 5 суток выращивания при 25-27°С.
В связи с тем, что исследуемые препараты плохо растворяются в воде, мы предварительно растворили их в 0.3 мл DMSO (Dimetylsulfoxyde) и, медленно встряхивая, добавили дистиллированную воду до 5 мл. Таким образом получили 0.1% водную суспензию препаратов, которую использовали при проведении модельных опытов на растениях.
В работе использовали следующие образцы: S. chrysomallus Р-21 (суммарный метаболитный комплекс), S. chrysomallus Р-21 (гептаеновый комплекс), S. globisporus Л-242 (фракция неполиено-вых соединений группы олигомицина), S. globisporus Л-242 (суммарный метаболитный комплекс). В качестве контроля использовали воду и 0.1% раствор диметилсульфоксида (DMSO).
Вирус мозаики томата (ВМТо) получили из лаборатории вирусных и микоплазменных болезней растений ВИЗР. Возможность использования препаратов как индукторов устойчивости томата к ВМТо изучали in vivo в вегетационных опытах.
Обработку вегетирующих растений проводили путем опрыскивания 0.1% суспензией образцов препаратов в воде и в 0.1% растворе DMSO в фазе 2-3 настоящих листьев (Бобырь, 1976). Препараты растворяли в 0.3 мл DMSO, затем добавляли воду до 5 мл (0.1%), медленно и при встряхивании. Водные суспензии препаратов наносили стеклянной палочкой на поверхность листьев дурмана обыкновенного (Datura stramonium L.) и томата обыкновенного (Solanum lycopersicum L.). Через 48 часов растения подвергали инокуляции ВМТо по стандартной методике путем нанесения водной суспензии вируса на листья (M/V : 1/20). В качестве контроля служили растения, обработанные водой и 0.1% раствором DMSO. О степени воздействия препаратов как индукторов устойчивости судили по концентрации вируса (количеству некрозов на листьях тест-растений). Степень поражения растений томата определяли по 5-балльной шкале, разработанной в ВИЗР:
0 - отсутствие симптомов.
1 - слабая мозаика верхушечных листьев. Листья среднего и нижнего ярусов внешне не отличаются от здоровых листьев.
2 - зеленая и желтая мозаика, деформация мозаичных участков листа в виде вздутий. Листья среднего и нижнего ярусов не имеют симптомов заболеваний. Цветки и плоды без изменений.
3 - мозаика отчетливо выражена на листьях верхнего яруса. Листья нижнего и среднего ярусов хлоротичны. Плоды без признаков поражения.
4 - мозаичные участки отчетливо проступают на листьях верхнего и среднего ярусов. При поражении стриком некротические участки наблюдаются на листьях, черешках, стеблях, плоды без симптомов поражения.
В особых экологических условиях, таких как резкое понижение температуры и освещенности, вместо мозаики на томате могут развиваться симптомы нитевидности листьев, когда пластинка листа частично или почти полностью редуцируется вплоть до центральной жилки.
5 - пораженные растения резко отличаются от здоровых. Отчетливо выражена мозаика, деформация листьев, растения угнетены. При стрике некро-
Вестник защиты растений, 2, 2009 тические симптомы распространены на листьях, стеблях, плодах. Цветки и завязи, как правило, опадают.
Фитотоксическое и стимулирующее действие препаратов оценивали по биометрическим показателям роста и развития растений томата. Биометрические показатели измеряли после 20, 42 и 59 дней заражения вирусом. Развитие болезни подсчитывали по стандартной формуле.
Результаты
Проведенные исследования показали, что хризомал-В представляет собой желтый гигроскопический порошок, хорошо растворимый в DMSO, DMФА, пиридине, умеренно растворимый в низших спиртах, водном ацетоне и нерастворимый в хлороформе, гексане и воде. Хризомал-В не имеет четкой температуры плавления, темнеет с разложением выше 120°С. Хризомал-В оптически активен [a]D18 = + 118 (с 0.5 МеОН); +292 (с 0.7 МеОН); -58 (с 0.7 DMSO). В УФ-спектре вещество имеет максимумы поглощения при 334336, 358, 378, 399 нм (Е1%1см 320, 590, 920, 685). В ИК-спектре, записанном в
исследовании
2929, 1711, 1640, 1595, 1443, 1413, 1175, 1150, 1009, 1069, 1011, 872.
1260,
KBr, 3574,
1147,
-1
В
имеется поглощение в области: 2934, 1713, 1665, 1600, 1406, 1260, 1108, 1076, 1032, 991, 942, 840, 803
см
протонном спектре ЯМР вещество имеет сигналы: (5) 0.85, 1.00, 1.21, 1.35, 1.50, 1.85, 2.27, 2.76, 3.15, 3.22, 3.54, 3.75, 3.87, 4.23, 4.45, 5.85, 6.48, 7.65 м.д. В 13С ЯМР спектре вещество имеет сигналы: 12.35, 13.97, 16.35, 17.00, 21.70, 26.50, 30.00, 31.56, 36.50, 39.70,
53.79, 54.00, 56.20, 61.09, 65.19, 67.00, 70.25,
71.80, 73.05, 77.71, 80.05, 93.20, 96.00, 128.10, 131.45, 131.93, 132.09, 134.05, 166.87, 173.01, 174.56, 195.90, 201.87 м.д.
Глоберин-А представляет собой желтый аморфный порошок, растворимый в DMSО, DMФА, пиридине, ограниченно растворимый в низших спиртах и нерастворимый в гексане, воде и ацетоне. Гло-берин-А оптически активен [а^ = -20 (с 0.1 МеОН). В УФ-спектре имеются максимумы поглощения при 340, 362, 376 и 398 нм (Е1%1см 405, 765, 1010, 885). Соединение не имеет четкой температуры плавления (выше 120°С разл.). В ИК-спектре, записанном в КВг, имеется поглощение в области: 3400-3500, 2934,
шш
1 2 3 4 5 6 Высота (см)
1 2 3 4 5 6 Кол-во листьев
Рис. Влияние фракций метаболитного комплекса штаммов S.сhrysomaПus Р-21 и S. globisporus Л-242 на высоту и количество листьев растения томата 1- контроль вода, 2- контроль DMSO, 3-Р-21 метаболитный комплекс, 4- Р-21 гептае-новая фракция, 5- Л-242 олигомициновая фракция, 6- Л-242 остаток (препарат после обработки гексаном)
В протонном спектре ЯМР глоберина-А имеются сигналы: (5) 0.83, 0.96, 1.20, 1.35, 1.45, 1.57, 2.49, 2.71, 3.13, 3.26, 3.58,
з.71, 3.85, 4.15, 4.40, 4.67, 6.55, 7.63 м.д. В 13С ЯМР спектре имеются сигналы: 12.50, 14.08, 16.40, 21.35, 26.45, 29.26, 31.56, 37.90, 39.68, 43.70, 53.79, 6.00, 61.19, 63.20, 67.00, 70.39, 71.77, 72.58, 72.99, 77.80, 93.22, 95.80, 104.14, 128.76, 131.45, 131.93, 134.00, 166.67, 172.17, 174.82, 196.20, 201.7 м.д.
Для первичной идентификации антибиотиков имеет большое значение спектр их активности. Как показали результаты проведенных исследований, выделенные нами соединения были неактивны в отношении Г+ и Г- бактерий
и, напротив, активны в отношении дрожжей и грибов (табл. 1), в т.ч. в отношении фитопатогенных грибов (табл. 2).
0
Таблица 1. Спектр действия хризомала-В и глоберина-А в отношении некоторых видов _патогенных грибов и бактерий_
Тест-культуры
Антибиотик (мкг/мл)
Хризомал Глоберин В А
Escherichia coli <100 <100
Staphylococcus aureus <100 <100
Bacillus mycoides 25.0 25.0
Candida albicans 0.40 0.20
Saccharomyces cerevisiae 0.60 0.40
Cryptococcus neoformans 0.05 0.025
Trichophyton gypseum 0.20 0.04
Microsporus gypseum 0.80 1.80
Aspergillus niger 25 0.196
Penicillium granulatum 50 0.009
Actinomyces globisporus <100 <50
Таблица 2. Активность хризомала-В и глоберина-А в отношении фитопатогенных грибов - возбудителей болезней растений
Тест-культуры
Биологическая активность (диаметр зоны задержки роста)*
Хризомал-В Глоберин-А
Alternaria solani 25.0 38.0
Verticillium dahliae - 17.0
Botrytis cinerea 25.0 -
Colletotrichum
cadeniarum 18.0 -
*Активность дана в 0.1% растворе DMSO.
Как уже упоминалось, образцы полифункциональных метаболитных биопрепаратов на основе штаммов S. chrysomallus Р-21 (хризомал) и globis-porus Л-242 (глоберин) обладают противовирусной, фунгицидной и фиторегуляторной активностью, обусловленной синтезом ряда биологически активных соединений (Новикова и др., 2002; Новикова, Шенин, 2005). Было показано, что в состав мета-болитных комплексов хризомала входят три, в состав глоберина - два биологически активных компонента. Из мицелия chrysomallus R-21 экстракцией метанолом был выделен комплекс, представляющий собой смесь полипептидного и ароматического гептаенового антибиотиков, которые были разделены хромато-графическими методами. Гептаеновый антибиотик содержится в культуральной
жидкости в незначительных количествах. Поэтому основное внимание было уделено характеристике полипептидного антибиотика, названного хризомалом-А. Изучение физико-химических и биологических свойств полипептида хризомала-А позволило отнести его к группе пептидо-лактонов треонинового типа.
Дальнейшие исследования показали, что в состав метаболитных комплексов штаммов S. chrysomallus Р-21 (хризомал) и S. globisporus Л-242 (глоберин) входят гептаеновые макролиды, обозначены нами как хризомал-В и глоберин-А соответственно.
Отнесение выделенных соединений к подгруппе ароматических гептаеновых полиенов было сделано на основании анализа УФ и ЯМР-спектров и подтверждено результатами кислотного и щелочного гидролиза. Среди продуктов кислотного гидролиза хризомала-В и гло-берина-А обнаружен аминосахар мико-замин, а среди продуктов щелочного гидролиза - п-аминоацетофенон. В обоих случаях хроматографические сравнения были проведены со свидетелями.
Ароматические гептаеновые макролиды - это многочисленная и важная группа антибиотиков (Mechlinski, Schaffner, 1974; Ветлугина, Никитина, 1980; Omura, Tanaka, 1984; Шенин, Белахов, 1989). Они проявляют высокую активность в отношении дрожжей, дрожжеподобных и нитчатых грибов сапротрофных и патогенных видов, обладают противовирусной и противоопухолевой активностью. Для ряда из них установлено химическое строение (леворин, кандицидин, трихомицин и др.), некоторые нашли широкое применение в медицинской практике в качестве противогрибковых антибиотиков (леворин, кан-дицидин, трихомицин и др.) (Hansen, Thomson, 1976).
Первым антибиотиком из стрептоми-цетов, который был использован в сельском хозяйстве против возбудителей болезней из родов Pseudomonas и Xantho-monas, был стрептомицин (Петрухина, 1985). Против грибных болезней растений начали применять циклогексимид, или актидион, и гризеофульвин. В дальней-
шем наиболее активно работы в области использования антибиотиков для защиты растений проводились в Японии (Петру-хина, 1985). Основным объектом исследований были болезни риса. Первым антибиотиком для борьбы с пирикуляриозом риса стал бластицидин-S, продуцируемый S. griseochromogenes. С 1964 года против Xanthomonas oryzae применялся целлоцидин, продуцируемый S. chiba-ensis. В 1965 году был выделен антибиотик касугамицин, синтезируемый S. casugaensis. Позднее в сельском хозяйстве начали применять противогрибные антибиотики полиоксины, продуцируемые Actinomyces cacaoi. В 1972 году был зарегистрирован валидамицин, образуемый S. hydroscopicus var. limoneus, эффективный против пирикуляриоза и ри-зоктониоза риса. В частности, высокий эффект этот антибиотик показал в подавлении Pseudomonas solanacearum, вызывающего бактериальное увядание томата (Ishikawa et al, 1996). До последнего времени для защиты от бактериальных и грибных болезней используют антибиотик никкомицин.
Попытки применения антибиотиков в защите растений были продолжены в 1970-1980 гг. (Kawai et al., 1989; Ishikawa et al., 1996). Антибиотики полиоксины были успешно применены против черной пятнистости семян брюквы в полевых опытах (Tewari, Skoropad, 1979). Продемонстрирован эффект действия валида-мицина А на 25 видов фитопатогенных дейтеромицетов, в т.ч. Rhizoctonia cereals и Fusarium culmorum (Robson et al., 1988). Стрептомицин в концентрации 1 г/л был с успехом использован для обработки семян против бактериального рака томата (Pilavci, Ulucus, 1987). Антибиотики имбрицин и леворин применяли против твердой и каменной головни и корневых гнилей зерновых культур. Обработка семян увеличивала всхожесть, стимулировала рост и развитие растений (Минбаев, 1979). Испытание двух антибиотиков из группы стрептотрицинов показало их высокую активность в концентрации от 7-8 до 25-30 ед/мл против
Fusarium oxysporum in vitro (Роснев и др., 1989). Антибиотик фейерифунгин был с успехом использован в борьбе с заболеванием мятлика лугового, вызванного Magna-porthe poae (Melvin et al., 1993). В США длительное время применяли технический стрептомицин, как наиболее эффективное средство в борьбе с ржавчиной веймутовой сосны и бактериальным ожогом плодовых деревьев, а в Индии - с бактериальным раком цитрусовых (Дьякова, 1982).
Известно, что антибиотики не только подавляют развитие фитопатогенных микроорганизмов, но и нейтрализуют токсины и ферменты, синтезируемые патогенами. Являясь биологически активными веществами, они оказывают глубокое влияние на растительный организм, изменяя его иммуно-биологические свойства и повышая устойчивость к заболеваниям и урожайность. В частности, виды р. Acremonium способны к синтезу циклических полипептидных антибиотиков, обладающих также иммуномодели-рущими свойствами (Takase et al., 1996).
Некоторые антибиотики способны активизировать защитные реакции растений, в т.ч. способствуя образованию фи-тоалексинов. В частности, стрептомицин, ристомицин, полимиксин и хлорамфени-кол повышают в тканях восприимчивых сортов картофеля содержание фитоалек-сина ришитина до уровня устойчивых сортов после заражения их вирулентной расой возбудителя фитофтороза (Дьяков, 1979). Хлорамфеникол активизирует систему синтеза ришитина в растении, способствуя в ответ на заражение патогеном образованию больших количеств этого антибиотика. Ристомицин вызывает усиление потери проростками спор паразита веществ, ингибирующих накопление ри-шитина. Важно отметить, что антибиотики действуют как индукторы устойчивости в концентрациях много меньших, чем летальные для спор патогенов.
В этой связи представляло интерес выделить и провести изучение физико-химических и биологических свойств индивидуальных полиеновых и пептидных
Вестник защиты растений, 2, 2009 соединений, продуцируемых штаммами-продуцентами новых биопрепаратов хри-зомала и глоберина. Пептидные антибиотики выделяли по описанными ранее методам (Новикова и др., 2006). Гептаено-вые антибиотики выделяли из мицелия продуцента экстракцией этанолом с последующим переосаждением из растворов ДМФА эфиром и хроматографией на се-фадексе G-50. В результате были получены вещества с Е1%1см при 380 нм, равной 910 (хризомал-В) и 1010 (глоберин-А).
Известно, что большинство описанных в литературе полиенов представляют собой смеси близких по строению соединений. Для их разделения и идентификации широко используют методы ВЭЖХ (Helbor et al., 1980; Mechlinski, Schaffner, 1980; Rokatikainen, 1991; Шенин, 1992; Шенин, Химич, 1993). Нами с использованием методов ТСХ и ВЭЖХ было показано, что выделенные гептаеновые соединения также представляют собой смесь компонентов. Основные гептаено-вые компоненты в спектре ВЭЖХ хри-зомала-В - вещества с временем выхода из колонки 4.36 и 8.60 мин с молекуляр-
н-
н-J н-] н-] Et< н-1 н-В i6í
Таким образом, проведенные исследования выявили целый ряд биологически активных соединений различной химической природы (пептидов и гептаенов-олигомицинов), способных определять целевую активность штаммов-продуцентов новых полифункциональных препаратов хризомала и глоберина, в т.ч. и неспецифическую болезнеустойчивость.
ной массой 1122 и 1136 а.е.м. и глобери-на-А - с временем выхода 3.06 и 7.51 мин с молекулярной массой 1138 и 1154 а.е.м. соответственно. Молекулярная масса хризомала-В близка к молекулярной массе леворина, а молекулярная масса глоберина-А - к молекулярной массе ме-партрицина (Wright et al., 1977; Tweit et al., 1977; Golik et al., 1980). В соответствии с классификацией, предложенной для ароматических гептаеновых макро-лидов на основе метода ВЭЖХ, антибиотик хризомал-В и глоберин-А могут быть отнесены в подгруппу леворин-партрицин-трихомицина. При этом первый наиболее близок к антибиотику леворину, второй -к партрицину. Данные ТСХ в ряде систем растворителей (табл. 3) в сравнении со свидетелями позволяют сделать вывод об их отличии друг от друга, а также от леворина и партрицина. Ретроспективный анализ физико-химических свойств выделенных соединений с физико-химическими свойствами гептаенов, описанных в литературе, позволяет говорить, что хризомал-В и глоберин-А являются оригинальными веществами.
В этой связи с целью выявления индивидуальных соединений, обуславливающих антивирусную активность препаратов, была проведена серия модельных опытов на растениях томата и дурмана обыкновенного с использованием в качестве инфекционного агента ВТМ.
Как известно, действие индукторов устойчивости in vivo на вирус происхо-
Таблица 3. Хроматографическая подвижность ЩР) хризомала-В и глоберина-А
_в сравнении с леворином и партрицином_
_Системы растворителей_
ВиОН - пиридин - вода (3:2:1) 1С13 - МеОН (3:1) 1С13 - МеОН - вода (2:2:1) н.ф. еОН - аммиак - вода (20:1:4) ВиОН - уксусная к-та - вода (4:1:1) ВиОН - ЕЮН - вода (1:1:1) ВиОН - пиридин - вода (6:4:5) ОН - вода (7:3)
ВиОН - ЕЮН - ацетон - NH3 (2:3:1:3) ВиОН-уксусная к-та-вода-диоксан
2:2:1)__
*Отношение расстояния от старта до пятна к расстоянию о пятна до финиша.
Хризомал-В Глоберин-А Леворин Партрицин
0.65, 0.85 0.60, 0.90 0.68, 0.70 0.61, 0.82
0.00, 0.11 0.05 0.00 0.00
0.57, 0.85 0.83 0.60 0.57
0.55, 0.68, 0.80 0.55, 0.70 0.55, 0.68 0.50, 0.75
0.46 0.46 0.45 0.30
0.61 0.55 0.55 0.47
0.32 0.50 0.40 0.30
0.71 0.87 0.53 0.70
0.70 0.65 0.65 0.40
0.40, 0.55, 0.55, 0.65, 0.55, 0.65,
0.85 0.80 0.80 0.20, 0.55
дит через метаболизм растения - хозяина (Тарчевский, 1993,2001,2002; Тютерев, 2002). Включение биологически активного вещества в жизненно важные процессы растения нередко приводит к угнетению последнего. Токсическое действие может выражаться в снижении всхожести семян, в задержке роста и развития растения, уменьшении общей вегетативной массы и урожайности. В связи с этим наши исследования включали определение фитотоксичности испытываемых биологически активных веществ штаммов-продуцентов. В опыте оценивали влияние метаболитных комплексов и индивидуальных веществ на культуре томата, учитывая изменение биометрических показателей - высоты растений и количества листьев.
При изучении фитотоксичности и фи-торегуляторной активности компонентов метаболитных комплексов штаммов globisporus Л-242 и chrysomallus Р-21 было оценено влияние диметилсульфок-сида фМ^О) на растения томата в связи с тем, что при проведении модельных опытов для повышения растворимости изучаемых соединений был использован 0.1% раствор DMSO.
Известно, что диметилсульфоксид растворяет очень многие органические и неорганические соединения. Как растворитель ДМЗО превосходит даже воду, вследствие чего он получил титул "сверхрастворитель", обладает высокой проникаемостью через биологические мембраны и нетоксичен, в связи с чем широко применяется специалистами, работающими в области теории растворов, а также в биологических и медицинских исследованиях.
Анализ данных таблицы 4 позволяет судить, что опрыскивание 0.1% водным раствором DMSO не вызывает фитотоксичности, существенно не влияет на количество листьев и лишь незначительно замедляет рост растений томата. В связи с этим в дальнейшем при изучении биологической активности мы использовали суспензии компонентов метаболитных комплексов в 0.1% водном растворе DMSO для повышения растворимости активных соединений. Результаты изучения биологической активности образцов метаболитных
Вестник защиты растений, 2, 2009 биопрепаратов на основе штаммов S. сhrysomaПus Р-21 и S. globisporus Л-242 приведены в таблицах 4 и 5.
Таблица 4. Влияние образцов биопрепаратов на основе метаболитов штаммов 5. сЬтузотаНиэ Р-21 и 5. дЪЫвротив Л-242 на биометрические _показатели роста растений томата_
Варианты
Высота растений,
К-во листьев, шт.
Контроль, вода 32.0 10.8
Контроль, DMSO_288_10.3
5. с^увотаипв Р-21 (суммарный метаболит-ный комплекс, выделенный из биомассы)
36.6
11.4
5. с^увошаЕив Р-21 (гептаеновый комплекс)
341 П3
5. дЪЪшротз Л-242 (фракция, содержащая непо-лиеновые соединения типа полиэфиров)_
328 Ю
5. д1оЫзрогиз Л-242 (суммарный метаболит-ный комплекс после обработки гексаном)
288 ТОб
НСР
05
3.2
1.1
Полученные результаты демонстрируют существенный стимулирующий эффект суммарного метаболитного комплекса, выделенного из биомассы штамма 5. chrysomallus Р-21 и его компонентов: опрыскивание растений достоверно увеличивало как высоту растений томата, так и количество листьев. Фракция, выделенная из биомассы штамма 5. дЪ-bisporus Л-242 и содержащая неполиено-вые соединения, стимулировала рост растений и не влияла на количество листьев. Признаков фитотоксичности ни в одном из вариантов опыта отмечено не было.
При изучении антивирусной активности компонентов метаболитных комплексов штаммов 5. globisporus Л-242 и 5. chrysomallus Р-21 на первом этапе исследований было оценено влияние DMSO на интенсивность проявления вирусной инфекции томата.
Полученные данные (табл. 5) свидетельствуют о существенном стимулирующем влиянии DMSO на вирусную инфекцию. При использовании в качестве контроля растений томата, обработан-
см
Вестник защиты растений, 2, 2009 ных суспензией вируса в 0.1% водном растворе DMSO, наблюдалось достоверное увеличение количества некрозов на листьях (концентрация вируса) по сравнению с растениями, обработанными водной суспензией вируса без DMSO. Видимо, обнаруженный эффект связан с повышением проницаемости клеточных стенок для вирусных частиц под действием DMSO. Интенсивность развития вироза (средний балл поражения листьев томата ВТМо) при использовании DMSO
в качестве эмульгатора была сопоставима с аналогичным показателем при использовании водной суспензии вируса. В связи с эффектом стимуляции развития вирусной инфекции под действием DMSO, антивирусную активность фракций метаболитных комплексов штаммов S. globisporus Л-242 и chrysomallus Р-21 сравнивали с двумя контролями, в качестве которых использовали растения, обработанные водой и 0.1% водным раствором DMSO.
Таблица 5. Влияние образцов биопрепаратов на основе метаболитов штаммов S. chrysomaПus Р-21 и S. globisporus Л-242 на концентрацию вируса ВМТо и развитие болезни на томате
Концентрация Биологическая Средний балл по-
Варианты вируса (кол- эффективность, % (в сравнении с
во некрозов ражения
на листе) контролем DMSO)
Контроль (водная суспензия ВТМо) 3.4 - 3.1
Контроль (суспензия ВТМо в 0.1% DMSO) 8.1 - 2.9
& chrysomallus Р-21 (суммарный метаболитный ком-
плекс, выделенный из биомассы, в 0.1% DMSO) 1.7 79.0 2.6
& chrysomallus Р-21 (гептаеновый комплекс в 0.1%
DMSO) 2.9 64.2 2.2
& globisporus Л-242 (фракция, содержащая неполи-
еновый компонент типа олигомицина, в 0.1% DMSO) 2.2 72.8 2.4
S. globisporus Л-242 (метаболитный комплекс по-
сле обработки гексаном в 0.1% DMSO) 3.7 54.3 2.3
Анализ полученных результатов показал, что, по сравнению с контролем DMSO, во всех вариантах опыта отмечено достоверное уменьшение количества некрозов на листьях томата, особенно существенное при обработке суммарным мета-болитным комплексом, выделенным из биомассы chrysomallus Р-21, а также гексановой фракцией, выделенной из биомассы штамма globisporus Л-242 и содержащей неполиеновые соединения (79% и 72.8% соответственно).
В остальных вариантах опыта биологическая активность колебалась в пределах 54.3-64.2%. По сравнению с контрольными растениями, обработанными водой, визуальный терапевтический эффект, выраженный в увеличении срока развития и уменьшении диаметра некрозов, показал суммарный метаболитный комплекс, выделенный из биомассы сИту-somallus Р-21. Статистический анализ,
проведенный с помощью программы Sigmastat, выявил существенное ингиби-рование системного развития вирусной инфекции: средний балл поражения растений томата достоверно уменьшался во всех вариантах опыта.
Для выявления влияния метаболитных комплексов и их компонентов на развитие реакции сверхчувствительности были использованы растения дурмана обыкновенного. Полученные данные представлены в таблице 6.
Как и на растениях томата, высокой биологической активностью в отношении ВТМ обладал суммарный метаболитный комплекс биопрепарата хризомал. Уменьшение числа некрозов на листьях составило 35-83.3%.
Эффективно подавляли развитие вируса пептидные компоненты комплекса -в этом варианте опыта биологическая эффективность составляла 50-65%. Напротив, гептаеновый комплекс штамма
chrysomallus Р-21, показавший высокую ингибирующую активность в отношении ВТМ на специфическом растении хозяине
Вестник защиты растений, 2, 2009 -томате, вызвал резкое усиление реакции сверхчувствительности на дурмане обыкновенном.
Таблица 6. Влияние образцов биопрепаратов на основе метаболитов штаммов
S. chrysomallus P-21 и S. globisporus Л-242 на концентрацию вируса ВМТо _на дурмане обыкновенном Datura stramonium L._
Варианты
Концентрация вируса (кол-во некрозов, _шт/лист)
Биологическая эффективность, %
(в сравнении с контролем DMSO)
1 наст. 2 наст. 1 наст. 2 наст.
лист лист лист лист
Контроль (суспензия ВТМо в 0.1% DMSO) 10.0 3.0 0 0
S. сЬгуБошаНиз Р-21 (суммарный метаболитный ком-
плекс, выделенный из биомассы, в 0.1% DMSO) 6.5 0.5 35.0 83.3
& сЬгуБошаНиБ Р-21 (пептидный комплекс в 0.1% DMSO) 3.5 1.5 65.0 50.0
& сЬгуБошаНиБ Р-21 (гептаеновый комплекс в 0.1% DMSO) 49.0 4.0 - -
S. сЬгуБошаИиБ Р-21 (фракция, содержащая неполиено-
вые соединения типа олигомицина, в 0.1% DMSO) 10.5 12.0 - -
S. сЬгуБошаИиБ Р-21 (остаток после обработки гексаном
в 0.1% DMSO) 24.0 13.0 - -
& §1оЬкрогш Л-242 (гептаеновый комплекс в 0.1% DMSO) 15.0 2.5 - -
В этом варианте опыта количество некрозов на листьях увеличилось в 4.9 раза. Возможно, подобные различия связаны с особенностями метаболизма модельных растений и спецификой парази-то-хозяинных отношений в процессе патогенеза ВТМ на специфическом и неспецифическом растении-хозяине, что требует дополнительных исследований.
Использование микробов-антагонистов и биопрепаратов на их основе в качестве индукторов устойчивости растений по отношению к болезням - относительно новое направление в защите растений.
Элиситоры устойчивости разделяются на биогенные, которые могут быть выделены из тканей растений, экзогенные, синтезируемые патогенами в процессе жизнедеятельности, и абиогенные, такие как соли тяжелых металлов, ультрафиолетовое облучение или фунгициды. Под действием элиситоров происходит фено-типическая коррекция растений, связанная с повышением уровня экспрессии защитных генов (Озерецковская, Васюко-ва, 2002). Это явление имеет признаки сходства с горизонтальной полигенной устойчивостью, но она обусловлена генетическими особенностями растения. Как
правило, общий ответ растения на начальные этапы патогенеза - синтез белковых ингибиторов ряда ферментов (хи-тиназ, глюканаз и протеаз), вызванный транскрипционной активацией соответствующих генов и коррелирующий с экспрессией этих генов в растении (Валуева и др., 2001).
Охарактеризовано множество природных и синтетических элиситоров - белков (в т.ч. гликопротеидов), олигосахаридов (продуктов неполного гидролиза полисахаридов клеточных стенок растения - хозяина и патогена), полиеновых жирных кислот и их оксигенированных производных, цереброзидов, продуктов гидролиза кутина и т.д. К вторичным элиситорам, образующимся в клетках растений при действии биогенных и абиогенных стрессоров, относят фитогормоны этилен, абс-цизовую, жасмоновую, салициловую кислоты, а также полипептид системин и некоторые другие соединения (Тарчев-ский, 2001).
В последние годы опубликованы результаты ряда исследований, посвященных изучению индукции болезнеустойчивости растений под действием микробов-антагонистов и механизмов этого процес-
Вестник защиты растений, 2, 2009 са. В ходе изучения антагонистической активности штамма Bacillus subtilis В56 по отношению к возбудителю бактериоза риса Xanthomonas oryzae pv.oryzae выделен белок 36 кД, определяющий активность культуры (Hong, Wei-Liang, 1999). В системе интегрированной защиты пшеницы немецкие ученые предложили применять в качестве активатора устойчивости биопрепарат бион на основе флуоресцирующих псевдомонад (Haim, 1996). Он особенно эффективен против мучнистой росы при использовании в период кущения растений и не позднее выхода в трубку. Антибиотик трихотецин существенно влияет на процесс патогенеза у растений пшеницы, пораженных стеблевой ржавчиной, увеличивая биосинтез белка, активность окислительных ферментов, фотосинтетическую активность, концентрацию фенолов. Эти явления свидетельствуют о существенной активации механизмов устойчивости растений к возбудителю заболевания (Юрина и др., 1989). Грибам-антагонистам, как элисито-рам иммунных реакций, посвящен подробный обзор Гиллеспи с соавторами (Gillespie et al., 2000).
В цикле работ академика И.А.Тарчев-ского "Сигнальные системы клеток растений" обобщена обширная информация о механизмах рецепции, умножения и передачи элиситорных сигналов в генетический аппарат клетки с помощью семи видов сигнальных систем: циклоаденилат-ной, митоген - активируемой протеинки-назной (МАПК), фосфатидатной, кальциевой, липоксигеназной, супероксидсин-тазной и NO-синтазной (Тарчевский, 1993,2001,2002; Тарчевский, Чернов, 2000). По крайней мере в шести случаях белковый рецептор элиситора "вмонтирован" в плазмалемму и воспринимает сигнал экстраклеточным N-участком. При этом происходит изменение конформации белка, в т.ч. его цитоплазматического С-участка, что приводит к активации связанного с ним G-белка и передаче импульса возбуждения на первый фермент и последующие интермедиаты сигнальной цепи. Обязательными участниками сигнальных цепей являются различные
протеинкиназы. Некоторые из них способны осуществлять фосфорилирование белковых факторов регуляции транскрипции (локализованых в цитоплазме и после фосфорилирования передвигающихся в ядро) и с их помощью действовать на промоторные участки "защитных" генов, индуцируя их экспрессию. В результате происходит накопление соответствующих м-РНК и патоген (элиситор) - индуцированных белков, от которых зависит защитная реакция растений. Де-фосфорилирование белков и, вследствие этого, прекращение деятельности сигнальной системы осуществляется с помощью различных протеинфосфатаз.
Имеется мнение, что некоторые эли-ситоры могут действовать непосредственно на липидную составляющую мембраны, вызывая ее модификацию, что приводит к изменению конформации ре-цепторного белка плазмалеммы и включению сигнальных систем. Доказано также, что восприятие элиситорного сигнала рецепторами приводит к быстрому изменению проницаемости ионных каналов плазмалеммы. Более того, считается, например, что элиситор-индуцируемое изменение концентрации ионов в цитоплазме может играть роль интермедиатов в сигнальной системе, индуцируя в конечном итоге синтез элиситор-зависимых белков (Дьяков, Багирова, 2001; Тарчевский, 2001,2002; Тютерев, 2002). Не исключается существование сигнальных систем, у которых рецептор находится в цитоплазме. В этой связи чрезвычайно важны данные, что антагонистическая активность споровых бактерий, в т.ч. штаммов Bacillus subtilis, при совместном культивировании с эрвиниями связана с нарушением функций клеточных мембран и нарушением транспорта ионов калия (Шарга и др., 1991).
Так как микроорганизмы и растение-хозяин могут одновременно синтезировать элиситоры разных типов, то вполне возможно включение и параллельное функционирование всех сигнальных систем клеток, но соотношение их активностей будет изменяться в зависимости от видовой принадлежности патогенов, мик-
робов-антагонистов и растения-хозяина, а также других условий.
К числу стрессовых фитогормонов в последнее время относят сравнительно небольшой полипептид, состоящий из 18 аминокислотных остатков и названный системином. Он признан первым идентифицированным фитогормоном полипептидной природы. Системин является продуктом частичной деградации (посттрансляционной модификации) более крупного предшественника - просистеми-на, состоящего из 200 аминокислот. Эли-ситоры, патогены и механическое повреждение растений вызывают интенсивную экспрессию системина.
Одной из защитных реакций растений является синтез белковых ингибиторов эндополиглюканаз и ингибиторов протеаз. Это относительно небольшие белки, подавляющие активность соответствующих экскреторных ферментов патогенов -грибов и бактерий. Показано, что у фасоли ген белкового ингибитора полигалак-туроназы активировался под влинием элиситоров - олигалактуронидов, или глюканов, или при механическом повреждении растений. Возможно, что элиси-тор-индуцируемые субтилин-подобные эндопротеазы растений тоже могут ограничивать питание патогенов, гидролизи-руя образуемые ими ферменты (кутина-зы, эндоглюканазы и протеиназы) (Дьяков, Багирова, 2001; Тарчевский, 2002).
Ряд патоген-(элиситор)-индуцируемых белков катализируют образование низкомолекулярных растительных антибиотиков - фенилпропаноидных или терпено-идных фитоалексинов. Фенилпропаноид-ные фитоалексины насчитывают большое количество соединений, объединенных первыми этапами и отличающихся последними этапами синтеза. Насчитывается более 20 ферментов, принимающих участие в их образовании. Наиболее простыми 6, 7 и 9-углеродными продуктами превращения фенилаланина являются бензойная, салициловая, кумаровая, гид-роксикумаровая, кофейная, оксиметил-кофейная (феруловая) кислоты. Из фе-руловой кислоты путем гидроксилирова-ния и метилирования образуются 5-
Вестник защиты растений, 2, 2009 гидрокси-ферулат и синаповая кислота. Большинство из этих соединений обладает антибиотическими свойствами, а салициловая кислота, как уже упоминалось, играет роль одного из главных системных сигналов.
Важны в защите растений от грибов и бактерий более сложные продукты фе-нилпропаноидного метаболизма, содержащие 2, 3, 4 и 5 гетероциклов. Фунги-цидные и бактерицидные свойства этих соединений усиливаются в результате модификационных реакций гидроксили-рования, метилирования, гликозилирова-ния, пренилирования и сульфатации, отражающих специфические особенности метаболизма различных видов растений. Образование и накопление различных фитоалексинов происходит благодаря индукции патогенами и элиситорами экспрессии генов, кодирующих ферменты фенилпропаноидного метаболизма.
Целый ряд патоген-(элиситор)-инду-цируемых белков катализируют реакции укрепления клеточных стенок растений вследствие индукции целого ряда генов, которые кодируют ферменты, катализирующие образование ковалентных связей между белками клеточных стенок и полисахаридами. К числу таких ферментов относятся, например, пероксидазы, про-теиндисульфид изомераза, катализирующая образование дисульфидных связей. В формировании более жесткой белковой структуры принимают участие не все белки клеточных стенок, а два полипептида 35 и 100 кДа (Тарчевский, 2001, 2002).
Укрепление клеточных стенок происходит также путем повышения интенсивности образования каллозы в результате элиситор-индуцированной экспрессии каллозосинтазы, а также лигнина за счет индуцированного синтеза ферментов фе-нилпропаноидного обмена, обеспечивающих образование мономерных предшественников лигнина.
Многие патоген-(элиситор)-индуциру-емые белки вызывают самоубийство (апоптоз) инфицированных и соседних клеток, обеспечивая сохранение целого организма (Дьяков, Багирова, 2001). Из-
Вестник защиты растений, 2, 2009 вестны гены, экспрессия которых приводит к апоптозу клеток у животных и растений, чего не происходит в случае их подавления различными ингибиторами.
Другая группа патоген-(элиситор)-индуцируемых белков может действовать непосредственно на структуры и функции патогенов, прекращая или сдерживая их развитие, в частности, вызывая деградацию клеточной стенки патогена. Одними из первых антипатогенных белков прямого действия обнаружены кислые и щелочные хитиназы и Р-1,3-эндоглюкана-зы, способные гидролизовать главные компоненты клеточных стенок белков, тем самым замедляя или прекращая рост гиф и развитие инфекции. В настоящее время опубликовано много работ, посвященных этим ферментам, их изоморфам, первичной структуре, промоторным участкам генов и особенностям регуляции их экспрессии, в т.ч. при действии не только патогенов и элиситоров, но и различных стрессовых гормонов, а также механического повреждения тканей (Wu et al., 1997).
Описана способность ряда патоген-(элиситор)-индуцируемых белков нарушать функционирование клеточных мембран патогенов. Под влиянием инфицирования и некоторых других неблагоприятных факторов в растениях быстро образуются модификаторы свойств клеточных мембран патогенных грибов и бактерий -относительно небольших (от 2 до 9 кДа) полипептидов, подразделяемых на целый ряд семейств: тионины, дефенсины, ли-пид-переносящие белки, хевеины, ноти-ны, снейкины и др. (Chang et al., 1995).
Следует отметить, что список бактерицидных и фунгицидных полипептидов продолжает увеличиваться. Все они имеют сходный план строения - несколько дисульфидных мостиков, гидрофобное ядро, одну протяженную а-спираль и три или четыре антипараллельно расположенных Р-полос. Например, у одного из тионинов - у-1-пуротионина насчитывается 4 дисульфидных мостика, а- спираль, включающая участок полипептида от 16 до 28 аминокислоты, три Р-полосы, вклю-
чающие 1-6, 31-34 и 39-47 остатки аминокислот. У вискотоксина дисульфидные мостики соединяют 3 и 40, 4 и 32, 16 и 26 остатки цистеина, а у у-тионина из сорго - 3 и 47, 14 и 34, 20 и 41, 24 и 43 остатки аминокислот.
При выяснении причин ингибирующе-го действия на грибы тионинов и дефен-синов обнаружено, что они вызывают изменение потенциала клеточной мембраны грибов (Shah et al., 1999), усиливают поглощение Са+2, выход К+, подщелачива-ние среды, ингибируют работу натриевых каналов. Считается, что тионины могут подавлять рост грибов, непосредственно и неспецифически действуя на клеточные мембраны, а дефенсины - связываясь с расположенными в них специфическими рецепторами.
Рибосомо-инактивирующие белки
(РИБ) относятся к широко распространенным защитным антибиотическим стрессовым белкам, синтез большинства из которых начинается после воздействия на растения биогенных и абиогенных стрессоров (Sharma, Lonneborg, 1996). Некоторые из РИБ синтезируются конститутивно, например, в семенах и плодах многих растений, где вместе с другими белками (хитиназами, Р-1,3-глюкана-зами, ингибиторами протеиназ) обеспечивают защиту от грибов, бактерий и вирусов. РИБ привлекли к себе особое внимание в последние годы, так как было показано, что они обладают противоопухолевой активностью, что косвенно свидетельствует об их способности ингибиро-вать развитие вирусных инфекций.
Определение первичной структуры многих РИБ показало, что они обладают более или менее выраженной гомологией и могут быть разделены на два типа: од-ноцепочечные (РИБ I) и двухцепочечные (РИБ II). Некоторые из них гликозилиро-ваны. Молекулярные массы большинства РИБ находятся в пределах 28-32 кДа. Защита от фитопатогенных грибов и бактерий обеспечивается ингибирующим действием РИБ на процесс трансляции в рибосомах, а именно блокированием фак-
тора элонгации. РИБ вызывают расщеп-пление N-связи между рибозой и адени-ном, причем в специфическом нуклеотиде А-4324, который находится в петле 28S в рибосомальной РНК, входящей в состав 60S субъединицы рибосомы. Это нарушает динамическую гибкость структуры рибосом, которая необходима для синтеза очередной пептидной связи (Di Maro et al., 1999).
Многие факты свидетельствуют и о суперспираль-зависимой эндонуклеазной, РНКазной, ДНКазной активностях РИБ. Обнаружен новый фермент - сайт-специфиче-ская рРНК-лиаза, способная расщеплять молекулу РНК на 3'-участке пуринового сайта и работающая в комплексе с N-гликозидазой, обеспечивая не только "точечное" изменение, но и последующее разрушение РНК фитопатогена. У одного из РИБ - камфорина - обнаружена супероксид-дисмутазная активность (Nico-las et al., 1998).
Обнаружена связь РИБ с другими стресс-индуцируемыми белками. Например, N-концевой участок одного из РИБ отличался от аналогичного участка хити-назы лишь одной аминокислотой.
Многочисленные данные, полученные в последние годы, свидетельствуют, что функционирование всех этих элиситор-индуцируемых белков может существенно ограничить распространение инфекции по растению. Действие разных групп элиситор-индуцируемых белков вызывает деградацию клеточной стенки фитопа-тогенных грибов и бактерий, дезорганизует функционирование их клеточной мембраны, изменяя ее проницаемость для ионов, подавляют работу белок-синтезирующего аппарата, блокируя синтез белков на рибосомах грибов и бактерий или действуя на вирусную РНК (Тарчевский, 1993; Тарчевский, Чернов, 2000).
В настоящее время выявлена противовирусная активность для ряда РНК- и ДНК-содержащих вирусов ряда биологически активных соединений природного происхождения, в частности полиеновых антибиотиков. Антивирусный эффект по-
Вестник защиты растений, 2, 2009 казан практически на всех видах поли-енов и их водорастворимых производных.
Наиболее подробно были изучены группы карбонил-сопряженных гептае-нов. В опытах in vitro показана достаточно высокая их активность в отношении вирусов гриппа А и В, практически идентичная активности ремантадина. Все изученные гептаены выгодно отличались от ремантадина способностью ингибировать репродукцию вируса гриппа В в опытах in vitro и in ovo. Гептаены обладали высокой вирулицидной активностью, резко подавляя репродукцию, инфекционные и гемагглютинационные титры. Показано, что полиеновые антибиотики в отличие от ремантадина и рибамида обладают иным механизмом действия (Шнейдер, 1979а, 1979б; Штильбанс и др., 1980; Шнейдер и др., 1983,1984).
При изучении производных полиено-вых антибиотиков (микогептин, амфоте-рицин В, нистатин и др.) в отношении РНК-содержащих ретровирусов саркомы Рауса показан практический интерес к использованию их в медицинской практике.
Полиеновые антибиотики являются мембранотропными агентами, взаимодействующими со стериновыми компонентами клеточной фракции эукариотов. Основываясь на подробном изучении молеку-лярно-биологического механизма поли-енов, М.А.Шнейдер (1979), а также совместно с Н.П.Чижовым (1986) сформулировал гипотезу противовирусного действия полиеновых макролидов. Согласно этой гипотезе, полиены вызывают переориентацию липидного матрикса поверхностной оболочки вириона или видоспе-цифических рецепторов цитоплазматиче-ской мембраны клеток, что приводит к инактивации оболоченных (липидсодер-жащих) вирусов или препятствует проникновению вируса в чувствительные клетки. Эта гипотеза нашла экспериментальное подтверждение на молекулярном и субклеточном уровне (Шнейдер и др., 1982).
Следовательно, в механизме противовирусного действия полиенов существуют две точки приложения:
- взаимодействие антибиотика с липи-дами цитоплазматической мембраны клеток, что приводит к изменению проницаемости мембран и обусловливает противовирусную активность;
- взаимодействие полиенов с липидными оболочками вириона, проявляющееся в ви-рулицидном действии антибиотика.
Полиеновые макролиды действуют лишь на оболоченные вирусы (миксо-, покс-, ретро-, бунья- и ареновирусы), болезни Ньюкса, вирусы саркомы Рауса. Полиены могут не только воздействовать непосредственно на вирус и пораженную им клетку, но и включать механизм опосредованного действия. Некоторые полиены обладают интерфероногенной активностью и иммуноадъювантными свойствами, при этом стимулирующее действие на продукцию интерферона увеличивает-
ся в 10-100 раз.
Таким образом, анализ многочисленных литературных данных и полученных нами экспериментальных результатов свидетельствует, что элиситоры микробного происхождения могут активно участвовать в формировании защитных реакций растения и обеспечивать существенный вклад в общую антагонистическую активность штаммов-продуцентов биопрепаратов. Вполне вероятно, что эти соединения обладают не только прямым антибиотическим действием на клетки патогенов, но и способны индуцировать устойчивость растений. Особую роль в этих процессах играют биологически активные соединения пептидной природы, роль которых в формировании индуцированной болезнеустойчивости трудно переоценить.
Выводы
Результаты проведенных исследований и анализ литературных источников позволяют сделать вывод о том, что выделенные и охарактеризованные нами соединения пептидной и полиеновой природы, входящие в состав метаболит-ного комплекса штамма сНгузотаИив Р-21 и обладающие выраженной фунги-цидной активностью, в значительной степени препятствуют развитию вирусной инфекции томата, повышая болезне-
устойчивость растительного организма в отношении ВТМ.
Данные о влиянии комплексов гептае-новых антибиотиков штаммов Б. сНгузотаИив Р-21 и Б. дЪЫзрогиэ Л-242, в значительной степени обусловливающих фунгицидную активность биопрепаратов на их основе на развитие вирусной инфекции ВТМ, имеют противоречивый характер и нуждаются в дальнейшем уточнении.
Литература
Бобырь А.Д. Антивирусные свойства различных дрожжей // Вирусные болезни с.-х. растений и меры борьбы с ними. Киев, 1976, с. 97-120.
Валуева Т.А., Ревина Т.А., Гвоздева Е.Л., Герасимова Н.Г., Ильинская Л.И., Озерецковская О.Л. Влияние хито-зана на болезнеустойчивость растений // Прикл. биохимия и микробиол, 2001, 37, 5, с. 601-606.
Ветлугина Л.А., Никитина Е.Т. Противогрибковые полиеновые антибиотики // Алма-Ата, Наука, 1980, 248 с.
Глинка Е.М., Проценко М.А., Буланцева Е.А., Саль-кова Е.Г. Действие белкового ингибитора полигалактуро-нидазы из тканей яблони на фермент, выделяемый фито-патогенными грибами // Прикл. биохимия и микробиол., 2001,37, 5, с. 607-611.
Дьяков Ю.Т. Защитные реакции растений // Микология и фитопатология, 1979, 13, 1, с. 14-16.
Дьяков Ю.Т., Багирова С.Ф. Что общего в иммунитете растений и животных? // Природа, 2001, 11, с. 10-15.
Дьякова Г.А. Антибиотики в защите растений // Итоги
науки и техн. ВИНИТИ. Защита растений, 1982, 1, с. 121165.
Минбаев P.M. Антибиотики против некоторых болезней зерновых культур // Вест. АН Каз ССР, 1979, 38 с.
Новикова И.И. Биоценотическое значение микробов-антагонистов в фитосанитарной оптимизации агроэкоси-стем // Теоретические основы разработки биологических средств защиты растений, новые отселектированные формы полезных организмов, технологии изготовления биологических средств защиты растений и их применения, СПб-Пушкин, 2005а, с. 303-332.
Новикова И.И. Биологическое обоснование использования полифункциональных препаратов на основе микробов-антагонистов в защите растений от болезней // Карантин и защита растений, 20056, 2, с. 5-9.
Новикова И.И., Бойкова И.В. Штамм актиномицета Streptomyces chrysomallus Р-21 для получения биопрепарата полифункционального действия // Патент РФ №2226214 от 02.05.2004.
Новикова И.И., Бойкова И.В., Павлюшин В.А., Мате-восян Г.Л., Паршин В.Г. Полифункциональные микробиологические препараты для защиты растений // Инф. бюлл. ВПРС МОББ. СПб, 2002, 33, с.147-159.
Новикова И.И., Шенин Ю.Д. Компонентный состав активных комплексов и первичная идентификация действующих веществ отобранных штаммов микробов-антагонистов // Материал II Всеросс. съезда по защите растений. СПб, 2005, с. 179-182.
Новикова И.И., Шенин Ю.Д., Бойкова И.В. Биологические особенности и компонентный состав активного комплекса штамма Streptomyces chrysomallus Р-21 - антагониста фитопатогенных грибов // Вестник защиты растений, 2006, 3, с. 13-21.
Озерецковская O.JL, Васюкова Н.И. При использовании элиситоров для защиты сельскохозяйственных растений необходима осторожность // Прикл. биохимия и мик-робиол., 2002, 38, 3, с. 322-325.
Петрухина М.Т. Использование антибиотиков в борьбе с болезнями растений // Инф. бюлл. ВПС МОББ, 1985, 12, с. 11-15.
Роснев Б., Минчев Д., Петков П. Испытание in vitro антибиотиков А-159 и А-418 против Fusarium oxysporum // Гор. стоп., 1989, 45, 5, с. 20-22.
Тарчевский И.А. Катаболизм и стресс у растений. М., Наука, 1993, 80 с.
Тарчевский И.А. Метаболизм растений при стрессе. Изб. труды. Казань, Фэн, 2001, 448 с.
Тарчевский И.А. Сигнальные системы клеток растений. М., Наука, 2002, 300 с.
Тарчевский И.А., Чернов В.М. Молекулярные аспекты иммунитета // Микология и фитопатология, 2000, 34, 3, с. 1-7.
Тютерев C.JI. Научные основы индуцированной болезнеустойчивости растений. СПб, 2002, 328 с.
Шарга Б.М. Микроорганизмы - антагонисты возбудителя бактериального ожога плодовых // Защита растений, 1991, 10, с. 15.
Шенин Ю.Д. Методы хроматографии полиеновых макролидных антибиотиков // Обзорн. информ. М. НИИСЭНТИ, 1992, 10, с. 1-45.
Шенин Ю.Д., Белахов В.В. Химия полиеновых макролидных антибиотиков. М., 1989, 44 с.
Шенин Ю.Д., Крутикова Л.Ф. Характеристики нового ароматического гептаенового антибиотика флавумицин А// Антибиотики, 1976, 21, с. 407-411.
Шенин Ю.Д., Химич Г.Н. Использование ВЭЖХ для изучения компонентного состава полиеновых макролидов // Антибиотики и химиотерапия, 1993, 38, 6, с. 19-24.
Шнейдер М.А. Аспекты в области производных антибиотиков (вопросы изучения и производства антибиотиков). М, 1979, 56 с.
Шнейдер М.А. Успехи в области изучения и производства антибиотиков, 6. М., 1979, 213 с.
Шнейдер М.А., Чижов Н.П. Противовирусное действие антибиотиков // Вопросы вирусологии, 1986, 31, 1, с. 18-31.
Шнейдер М.А., Штильбанс Е.Б., Гаврилов Г.А. Использование люминесцентного анализа для изучения особенностей вирусингибирующего действия полиеновых антибиотиков // Антибиотики, 1982, 9, с. 53-56.
Шнейдер М.А., Штильбанс Е.Б., Рачковская Л.А.,
Вестник защиты, растений, 2. 2009 Полторак В.А. Противовирусное действие карбонил-конъюгированных пентаеновых макролидов // Антибиотики, 1983, 28, 5, с. 344-349.
Шнейдер М.А., Штильбанс Е.Б., Рачковская Л.А., Ветлугина Л.А., Никитина Е.Г. Вирусингибирующие свойства карбонил-конъюгированного пентаена розео-фунгина // Антибиотики, 1984, 29, 5, с. 344-349.
Штильбанс Е.Б., Шнейдер М.А., Палей Е.И. и др // Всесоюз. научно-исслед. технологический институт антибиотиков и ферментов медицинского назначения. Отчетная науч. конф., Л., 1980, с. 69-70.
Юрина Т.П., Умнов A.M., Караваев В.А., Солнцев М.К. Влияние трихотецина на процесс патогенеза у растений пшеницы, пораженных возбудителем стеблевой ржавчины // Физиол. растений, 1989, 36, 3, с. 581-587.
Chang М.М., Horowitz D., Gulley D., Hadwiger L.A. Peptides and their role in membrane protection // Plant Mol. Biol, 1995, 18, 1, p. 105-111.
Di Маю A, Valbonesi P, Bolognesi A, Stirple F, de Luca P, Siniacalco G.G, Gaudio L, Delli B.P, Ferranti P, Malorni A, Parante A. Nucleotide A-4324 and its role in peptide synthesis // Planta, 1990, 212, 1, p. 125-131.
Dutcher Y. D, Walter D.R, Wintersteiner O. Nystatin III. Mycosamine: Preparation and determination of structure // J. Org. Chem, 1963, 28, p. 995-998.
Gillespie J, Bailey A, Cobb B, Vilcinskas A. Fungi as elisitors immune responses // Arch. Insect. Biochem.and Physiol, 2000, 44, 2, p. 49-68.
Golik J, Lielinski J, Borowski E. The structure of mepartricin A and mepartricin В // J. Antibiotics, 33, 1980, p. 904-907.
Hansen S.H, Thomson M. Comparison of candicidin, levorin and trichomycin by means of High Performance Liquid Chromatography // J. Chromatography, 1976, 123, p. 205-211.
Haim B.D. Die Production von Weizen kalkulierbar machen // Lohnunternehmen Land- und Forstwirt, 1996, 51, 4, p. 3-54.
Helbor P, Thomson M, Hansen S.H. Improved highperformance liquid chromatography method for the comparison of heptaene macrolide antibiotics // J. Chromatography, 1980, 189, p. 249-284.
Hong R, Wei-Liang C. Investigation of Bacillus subtilis antagonistic activity against Xanthomonas oryzae pv.oryzae II J. Zhejiang Univ. Agr. And Life Sci, 1999, 25, 6, p. 573-577.
Ishikawa R, Fujimori K, Matsuura K. Antibacterial activity of validamycin A against Pseudomonas solanacearum and its efficacy against tjmato bacterial wilt // Ann. of phytopathol. soc. of Japan, 1996, 62, 5, p. 478-482.
Jutsum A.R. Commercial application of biocontrol: status and prospects // Biological control of Pests, Pathogens and Weeds: Development and Prospects // Wood and Way. (Eds) London, The Royal Society, 1998, p. 247-373.
Kawai S, Kawabata G, Kobayashi A, Kawazu K. Inhibitory effect of oxalomycin on crown gall formation // Agr. And Biol. Chem, 1989, 53, 4, p. 127-1133.
Mechlinski W, Schaffner C.P. Separation of polyene antifungal antibiotics by high speed liquid chromatography // J. Chromatogr, 1974, 99, p. 19-633.
Mechlinski W, Schaffner C.P. Characterization of aromatic heptaene macrolide antibiotics by high-performance liquid chromatography // J. Antibiot, 1980, 33, p. 91-599.
Melvin В.Р., Nair M.G., Vargas J.M., Detwáler R. Controlling annual bluegrass (Poa annua L.) summer patch disease with faeriefungin// HortScience, 1993,28,3, p. 96-203.
Nicolas E., Beggs J.M., Haltwanger B.M., Tarashi T.F. Superoxid-dismutase activity of ribosome inactivating peptide // J. Biol. Chem., 1998, 273, 27, p. 522-531.
Tewari J.P., Skoropad W.P. The effect of polyoxins В and D on Alternaría brassicae and the blackspot of rapeseed // Can. J. Plant. Sci, 1979, 59, 1, p. 6.
Omura S., Tanaka H. In macrolide antibiotics : chemistry, biology and practice // N.Y., 1984, p. 51-404.
Pilavci O., Ulucus I. Studies on possibilities of using troleandomycin as a seedling treatment chemical against tomato bacterial cancer (Corinebacterium michiganense pv. michiganensis Smith. Jensen) // ВНИИТЭИагропром, 1987, 16, 2, с. 67-70.
Rokatikainen О. High-performance liquid chromatography of heptaene polyenes: assay of heptaene produced by Streptomyces griseoviridis // J. Chromatography, 1991, 588, p. 56-360.
Robson G., Kuhn P., Trinci A. Effect of validamycin A on the morphology, growth and sporulation of Rhizoctonia
cereals, Fusarium culmorum and other fungi // J. Gen. Microbiol., 1988, 134, 12, p. 3187-3194.
Shah J., Kashroo P., Klessig D.F. The changes in membrane potential as a cause of defensines and thionines // Plant Cell, 1999, 11, 2, p. 91-206.
Sharma P., Lonneborg A. Ribosome-inactivating peptides as antistressed factors // Plant Mol. Biol., 1996, 31, p. 707712.
Takase S., Tsurumi Y., Tanaka H., Okuhara M., Kino T., Goto T. Production of cyclosporine A or/and C with a strain of Nectria sp // BHHHTH, P)K, 12-04E2.1im, 1996.
Tweit R.C., Rinehart K.L., Pandy R.C. The chemical Characterization of the antifungal and antiprotozoal antibiotic partricin // ASM Scientific Meeting. Oct. 1977, 12, p. 2-35.
Westley G.W. Polyether antibiotics: carboxylic acid ionophores // Adv. Appl. Microbiol, 1977, 22, p. 177-223.
Wright J.J, Greeves D, Mallaus A.K, Picker D.H. Structural elucidation of heptaen macrolide antibiotics 67-121 A and 67-121-C // JCS Chem. Comm., 1977, p. 710-712.
Wu H, Echt C.S, Popp M.P, Davis J.M. Role of enzymes as antipathogenic factors // Plant Mol. Biol, 1997, 33, 6, p. 979-987.
BIOLOGICAL FEATURES OF PEPTIDES AND HEPTAENE AROMATIC MACROLIDES ISOLATED FROM STREPTOMYCES CHRYSOMALLUS R-21 AND 5. GLOBISPORUS L-242 -STRAINS-PRODUCERS OF MULTIFUNCTIONAL BIOPREPARATIONS CHRYSOMAL AND GLOBERIN FOR PLANT PROTECTION AGAINST DISEASES OF VARIOUS AETIOLOGY
I.I.Novikova, Yu.D.Shenin, A.E.Tsyplenkov, T.S.Fominykh, P.V.Suika, I.V.Boikova Some strains of streptomycetes with the highest antagonistic activity against phy-topathogenic fungi and viruses have been selected among more than 1500 strains of bacteria including actinomycetes. In addition, they provide a high stimulating effect on plant growth and development. Laboratory samples of biopreparations have shown the high biological activity in vegetative and field tests. According to the research results, application of biopreparation with complex activity enables both to protect and to increase the yield of agricultural crops and also to obtain ecologically safe products. Antiviral peptide and polyene substances isolated from S. chrysomallus P-21 and S. glo-bisporus L-242 strain biomasses were identified and characterized.
