CC BY
22Вестник защиты растений, ,3, 2006 13
УДК 632.939:576.852.182
БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ И КОМПОНЕНТНЫЙ СОСТАВ АКТИВНОГО КОМПЛЕКСА ШТАММА STREPTOMYCES CHRYSOMALLUS Р-21 - АНТАГОНИСТА ФИТОПАТОГЕННЫХ ГРИБОВ
И.И.Новикова, И.В.Бойкова, Ю.Д.Шенин
Всероссийский НИИ защиты растений, Санкт-Петербург
Из мицелия штамма Streptomyces chrysomaПus Р-21 - продуцента полифункционального биопрепарата хризомал, обладающего фунгицидным, фиторегуляторным и антивирусным действием, выделены вещества, представляющие смесь полипептидного и ароматического гептае-нового антибиотиков. Изучены физико-химические и биологические свойства полипептида -хризомала. Хризомал отнесен к группе пептидолактонов треонинового типа. Показана оригинальность его химического строения.
Создание экологически безопасных технологий получения сельскохозяйственной продукции связано с разработкой биологических систем защиты растений, включающих в качестве одного из элементов использование разнообразных микроорганизмов и метаболитов.
На основе штаммов микроорганизмов возможно создание двух типов биопрепаратов. Биопрепараты на основе живых культур микробов предназначены для интродукции в экосистемы с целью длительного регулирования численности популяций вредных насекомых и фитопа-тогенов. Насыщение микробиоты почвы микроорганизмами с комплексной биологической активностью, обладающими высоким потенциалом размножения и конкурентоспособностью, синтезирующих разнообразные биологически активные вещества, такие как антибиотики, ферменты или гормоноподобные вещества, повышает фунгистазис почвы и обеспечивает длительную регуляцию численности популяций фитопатогенов. Биопрепараты на основе метаболитных комплексов микроорганизмов предназначены для подавления численности быстро размножающихся популяций фитопато-генов. Комплексы БАВ, эффективно подавляющие размножение вредных объектов и обладающие фиторегуляторной активностью, положительно влияют на рост и развитие, активизируют обмен веществ, повышают продуктивность растений, в ряде случаев их использование увеличивает содержание витаминов и белков и снижает концентрацию вредных
соединений, в частности нитратов.
Хорошо известно, что по ряду показателей, таким как отсутствие фитоток-сичности, возможность совместного использования с энтомофагами, низкая токсичность и быстрый распад в аэробных условиях, высокая специфичность и эффективность в отношении целевых вредоносных объектов в широком интервале гидротермических условий, биопрепараты на основе микроорганизмов весьма перспективны для включения в современные фитосанитарные технологии. В лаборатории микробиологической защиты растений ВИЗР разработаны методы оценки биологической активности микроорганизмов в модельных и вегетационных опытах в отношении широкого круга фитопатогенов, что позволило создать модель ступенчатого скрининга культур, перспективных для создания новых биопрепаратов.
Было протестировано около 2000 культур бактерий, в основном актиномицетов р. Streptomyces, выделенных из почвенных образцов, собранных в различных почвенно-климатических зонах: Западной Сибири, Ростовской и Волгоградской областях, Крыму, Молдавии, Казахстане, Коми, Болгарии, Вьетнаме, Индии, Египте, Китае. В результате скрининга было отобрано более 100 высокоактивных штаммов, перспективных для создания новых биопрепаратов для защиты растений. На основе наиболее активных штаммов разработаны технологии получения и применения ряда новых биопрепаратов. Одним из наиболее перспективных явля-
ется хризомал - биопрепарат на основе метаболитного комплекса штамма Streptomyces chrysomallus P-21.
В нашу задачу входило изучение биологических особенностей и структуры активного комплекса штамма S. chryso-
Методика
Для определения антагонистической и антибиотической активности штаммов микроорганизмов использовали стандартные микробиологические методы лунок и блоков. В состав тест-культур входили представители грибов рр. Fusarium Lk: Fr., Verticillium Nees, Whetzelinia (Lib.) dBy, Phoma Sp., Colletotrichum Sacc., Bipolaris Sacc., Septoria Fr., Alternaría Nees, Ascochyta Lib, Pythium и бактерий рр. Pseudomonas Migula 1894, Clavibacter Davis, Gillaspie, Vidaver, Harris 1984, Xanthomnas и Erwinia Winslow, Broadhurst, Buchanan, Krumwiede Roders and Smith.
Выращивание культур стрептомице-тов в глубинных условиях проводили на посевной среде №5 при t=28°C в течение 5 суток в качалочных колбах. Состав среды №5 (г/л воды): соевая мука - 10, мел - 3, глюкоза - 10, NaCl - 5, pH (до стерилизации) - 7.2, вода водопроводная - 1 л.
Образцы биопрепарата получали в виде высушенных метанольных экстрактов биомассы, культуральной жидкости и нативного раствора.
Спектр 1Н и 13С ЯМР записывали на приборе "Brucker AC-200" (Германия) в дейтерированной воде в режиме полной и неполной развязки. Химические сдвиги в спектрах определены относительно внутреннего стандарта тетраметилсилана (ТМС) и выражены в миллионных долях. УФ-спектры получали на приборе 210 UV Shimadzu (Япония) в метаноле. Масс-спектры записывали на приборе МДС-650 (Россия), оснащенном дополнительным источником ионов, в котором анализируемое вещество подвергается воздействию быстрых ионов цезия. Плотность тока ионов цезия до 1 мк А/мм2, энергия ионов цезия до 10 кэВ. Анализируемое вещество вносилось в жидкую матрицу -глицерин на подложке из нержавеющей
та11ш Р-21 - антагониста фитопатогенных грибов, выделение и изучение физико-химических и биологических свойств основного активного компонента хризомала и его идентификация с описанными в литературе полипептидными антибиотиками.
исследований
стали.
Высокоэффективную жидкостную хроматографию проводили на приборе "Милихром-2" (Россия) (колонка, упакованная сепароном С18, подвижная фаза -ацетонитрил-аммоний ацетатный буфер рН 5.5 (37.5:62.5), УФ-детектор - 350 нм, скорость элюции 0.5 мл/мин). Оптическое вращение измеряли на автоматическом спектрополяриметре А1-ЭПО (Россия), ИК-спектры записывали на спектрометре JR-20 (Германия) в КВг. Аминокислотный состав изучали с использованием жидкостного микроколоночного хроматографа ХЖ-1311 (Россия) (колонка 300 х 0.5 мм, упакованная Nucleosil-5C18), в режиме линейно-ступенчатого градиента ацетонитрила в 0.01 М формиатном буфере с рН 3.53 при скорости элюирова-ния 5 мкл/мин. Детектирование флуори-метрическое при длине возбуждения 254 нм и области флуоресценции 500±100 нм. Аминокислоты детектировали в виде дан-зил-производных. Время удерживания определяли в сравнении со стандартами.
Хроматографию в тонком слое сорбента проводили на пластинках '^ПиМ ЦУ-254" (Чехия). Системы растворителей указаны по тексту.
Специфическую фунгицидную активность лабораторных образцов препарата определяли с помощью тест-культуры АНетата solani в чашках Петри методом лунок, инкубация при 25°С в течение 3-5 суток.
Антимикробный спектр действия определяли методом серийных разведений (двукратное разведение в жидкой питательной среде). Выделение активных веществ проводили следующим образом: 140 г высушенного мицелия экстрагировали при тщательном перемешивании 1.3 л метанола при комнатной темпера-
Вестник защиты растений, ,3, 2006 туре. Экстракцию повторяли 1 л метанола. Объединенные экстракты упаривали до образования желтого маслянистого осадка (0.3 г). Последний дважды промывали гексаном (по 50 мл), этил-ацетатом (50 мл) и метанолом (10 мл) и высушивали в вакууме. Получали порошок серого цвета (0.2 г), который растворяли при слабом нагревании в метаноле (20 мл) и к раствору медленно добавляли равный объем этилацетата. Смесь выдерживали в холодильнике несколько часов, осадок отделяли, промывали холодным этилацетатом и высушивали в вакууме.
Результаты
К настоящему времени изучены куль-турально-морфологические и физиолого-химические особенности штамма-продуцента препарата, подобраны и оптимизированы условия его культивирования, выделен активный комплекс, разработана научно-техническая документация на препарат. Технология получения препарата включает глубинное культивирование штамма, выделение метаболитного комплекса экстракцией органическими растворителями и сушку экстракта. Оценка биологической активности лабораторных образцов хризомала in vitro показала, что он эффективен в отношении возбудителей ряда опасных грибных болезней сельскохозяйственных культур: фузариоза колоса пшеницы, мучнистой росы огурца, крыжовника и черной смородины, фитофтороза томата и некоторых других (табл. 1).
Наряду с этим, как показали вегетационные и полевые испытания, проведенные совместно с кафедрой ботаники Ростовского Государственного университета, биопрепарат активен в отношении ряда вирусных болезней растений: ВТМ (вирус табачной мозаики), ВОМ (вирус огуречной мозаики), ВМК (вирус мозаики костра). По данным Санкт-Петербургского аграрного университета, обработка биопрепаратом существенно повышает урожайность растений, улучшает биохимический состав плодов, увеличивая содержание сухих веществ, аскорбиновой
Операцию переосаждения повторяли. В результате получали 0.15 г кристаллического, желтоватого продукта. Последний растворяли в метаноле (10 мл) и раствор фильтровали через слой сефа-декса LH-20. Из первой фракции (10 мл) после удаления растворителей в вакууме получали 0.1 г кристаллического хризо-мала белого цвета с температурой плавления 208-215°С.
При дальнейшем пропускании метанола через колонку выходила желтая фракция. После удаления метанола в вакууме досуха было получено 0.04 г ароматического гептаена.
исследований
кислоты, белка, а также снижая содержание нитратов.
Как показали проведенные исследования, полифункциональный характер действия штамма S. chryzomallus Р-21 на растительный организм связан с составом его активного комплекса. Из мицелия штамма S. chrysomallus R-21 экстракцией метанолом был выделен биологически активный комплекс, представляющий собой смесь полипептидного антибиотика и ароматического гептаена, которые были разделены хроматографией на LН-20. Гептаеновый антибиотик находится в культуральной жидкости в незначительных количествах, поэтому основное внимание было уделено характеристике полипептидного антибиотика.
Выделенное вещество (хризомал) представляет собой бесцветные иглы с температурой плавления 208-215°С. Хризомал растворим в воде, метаноле, диметилсульфоксиде, нерастворим в ацетоне, этилацетате, эфире, гексане. Дает положительные реакции с FeClз, КМПО4, биуретовую реакцию и отрицательные - с нингидрином, реактивом Миллона. Оптически активен,
^^20=+60 (С0.5, метанол). В УФ-спектре хризомала наблюдаются максимумы поглощения при 209 и 265 нм (рис. 1), имеет характерный слабо разрешенный для полипептидов ИК-спектр (рис. 3). Его 1Н и 13С ЯМР-спектры представлены на рисунках 2 и 4.
1
0,8 0,6 0,4 0,2 0
D
250 300
Длина волны, X, нм
Рис. 1. УФ-спектр хризомала в метаноле (С О.1 мг/мл), D - оптическая плотность
г
.. и,
4
. I , :.
5 4 3 2 1 т^.
Рис. 2. 1Н ЯМР-спектр хризомала в СД3ОД
80 60 40 20
Г'
4000 3500 3000 2500 2000 1500
Рис. 3. ИК-спектр хризомала в КВг (% пропускания)
1000 см-1 500
^ 20 ? 40
1
Рис. 4. 13С ЯМР-спектр хризомала в СД3ОД
Leu Val NHз А1а ^и Thг
Gly
Lys
и!.
Время выхода (мин) в сравнении со стандартом
70 60 50 40 30 20
13 11 9 7 5 3 1
Рис. 5. Хроматограмма Рис. 6. ВЭЖХ ароматического
гидролизата хризомала (10 тк1) гептаена (1) и леворина (2)
36.7
6.9
200
350
3.4
60
г 80
100
120
140
160
Хроматографическая подвижность хризомала в ряде систем растворителей приведена в таблице 1. Среди продуктов кислотного гидролиза (20 часов при 100°С с 6 н HCl) обнаружены: лизин, глицин, пролин, лейцин, треонин, глюта-миновая кислота, аланин, валин (рис.5). В масс-спектре наблюдали молекулярный ион с m/е 990 а.е.м.
Таблица 1. Хроматографическая подвижность
_хризомала*_
_Система_Rf
Хлороформ-метанол-вода, в.ф. (2:2:1) 0.77 Этилацетат-пиридин-вода (5:3:1) 0.80
Бутанол-уксусная кислота-вода (2:1:1) 0.65 Бутанол-уксусная кислота-вода (3:1:1) 0.80 Хлороформ-метанол (3:1) 0.27
Бутанол-этанол-ацетон-аммиак (2:5:1:3) 0.57 Хлороформ-метанол-уксусная к-та (90:6:2) 0.20 Этанол-бутанол-вода (4:1:1) 0.76
*Наносили на хроматографические пластины Silufol UV-254 по 10 мкл раствора с концентрацией 6 мг/мл; проявляли в УФ свете (фиолетовая флуоресценция) и в парах йода.
Хризомал практически неактивен в отношении Г+ и Г- бактерий, слабо активен в отношении грибов и дрожжей (табл. 2). Его активность в отношении фитопатогенных культур представлена в таблице 3.
Таблица 2. Антимикробный спектр хризомала, минимальная подавляющая _концентрация (мкг/мл)_
Тест-культура мкг/мл
Staphylococcus aureus >100
Streptococcus pyogenes >100
Escherichia coli 100
Pseudomonas aeruginosa 50
Proteus vulgaris 50
Candida albicans штамм 12 50
Candida albicans штамм 13 50
Candida albicans 24433 50
Candida utilis ЛИА-01 12.5
Candida tropicalis штамм 2 100
Rhodotorula штамм 10 25
Microsporium canis шт/м3 25
Trichophyton mentagrophytes
штамм 22 100
Penicilluim granulatum штамм 2 100
Aspergillus fumigatus штамм 6 50
Aspergillus awamorii infvv 14 100
Mucor sp. штамм 4 100
Хризомал был выделен из культуры S. chrysomallus R-21. Из литературы известно, что культура £. chrysomallus продуцирует актиномицины С, Д, Е, F, Х, хризомаллин и россимицин, тетралиды и пептидный антибиотик циннамицин. По своим физико-химическим и биологическим свойствам выделенный нами препарат резко отличается как от актиномицинов, так и от тетралидов.
Таблица 3. Биологическая активность хризомала (1 мг/мл) в отношении фитопатогенных грибов
TecT-Ky^BTypa Радиус*, мм
Alternaria brassicicola Wilts. 20
Fusarium graminearum Schwabe 18
Botrytis cinerea 15
Rhizoctonia solani Kuhn. 12
Whetzelinia sclerotiorum(Lib.) dBy. 20
Colletotrichum atramentarium 17
(Berk. et Br.) Taub
Verticillium dahliae Kleb. 12.5
Bipolaris sorokiniana (Sacc.) Shoem. 19
Ascochyta melonis Pot. 10
*Радиус зоны задержки роста.
Последние нерастворимы в воде, высокоактивны в отношении Г+ бактерий. Отличаются они по характерному поглощению в УФ-спектре. От циннамицина хризомал отличается аминокислотным составом.
Ретроспективное сравнение физико-химических и биологических свойств хризомала и полипептидных антибиотиков, описанных в литературе (Антибиотики, 1987), показывает, что полученный нами препарат по своим свойствам наиболее близок к пептидолактонам треони-нового типа (табл. 4).
Хризомал отличается от антибиотиков этой группы полипептидов своей растворимостью в воде и антимикробным спектром действия. Все полипептиды треони-нового типа, за исключением липопепти-на, обладают выраженной активностью в отношении Г+ бактерий. В УФ-спектре хризомала отсутствует поглощение в области 305 нм, характерное для миками-цина В, стафиломицина S и этамицина. Хризомал является правовращающим препаратом, в то время как подавляющее большинство сравниваемых препаратов являются левовращающими.
Таблица 4. Сравнительная характеристика физико-химических и биологических свойств хри-зомала и полипептидных антибиотиков, описанных в литературе
Антибиотики Продуценты Описание Т плавл., °С aid (C1, MeOH) X макс (Е1%1см) в метаноле АЕМ* Брутто-формула Биол. активность
Хризома: S.chrysomallus Белые иглы, гигроскопичен 208-215 (разл) 60-80 (разм) +60 (С0.5 МеОН) 209, 265 990 Фито- пат. грибы
Антибиотик РА- Бесцветные 207-208 -37.2 258 (204), - - Г+
114В-3: S.olivaceus иглы 305 (95)
Бревистин Аморфный порошок 190-195 +6.1 274, 283, 290 1382 C63H91O18N15 Г+
Вернамицин А: S.loidensis Основание, кристаллы 193-195 (разл) -206 210-230 (637), 270 (196) 422 (Rast) C20H25O5N2 Г+, Г-
Вернамицин В: S.loidensis Кислота, золотистые кристаллы 130-135 (разл) -72 230 (sh, 590) 585 (Rast) C30H40O8N8 Г+
Вернамицин Bß: S.loidensis Кислота, кристаллы 192-193 (разл) -44.5 (С1, ЕЮН) - 840 C43H54O10N8 -
Вернамицин By: S.loidensis - - - - 840 C44H52O10N8 -
Вернамицин Вст: S.loidensis - - - - 852 C34H50O10N8 -
Дорицин: S.loidensis - 170-190 (разл) -92 257, 360 856 C43H52O11N8 Г+
Вирджини-мицин S1-S3: S.virginiae 241-242 -34.5 (ЕЮН) 305 (log E,3.85) EtOH, 305 (sh), 355 (H2O), 305,355 (0.1н HCl), 333 (0.1н NaOH) 809 C42H47O10N7S1 C43H51O10N7S2 C44H54O11N7S3 Г+
Липопептин: - 206-208 -45.4 - 1176 C54H84O19N10 Грибы
S.violaceo- (разл)
chromogenes
Микамицин В: S.mitakaensis, S.loidensis, S.olivaceus, S.osfregriseus, S.pristinae spiralis Бесцветные пластинки 262 (разл) 160 (разм) -61.3 209 (605), 260 (220), 305 (101), 209 (602), 305 (99)-0.1н На- МеОН, 218 (410), 252 (294), 333 (126) в 0.1н NaOH 855 C43H54O10N8 Г+
Остреогрицин G Палево-желтый порошок 122-127 +78 (С1.36, ЕЮН) 215 (log E 4.53), 235 (4.18), 295 (4.06) в спиртовом ШОН 527 С26Н37О7^3 Г+
Остреогрицин Z 1185 (разм) 268 (распл) -65.8 260.5 (204), 303 (101), 262 (222), 306 (105) в ЕЮН Г+
Остреогрицин Zj - 183 (разм) 270 (распл) -68.1 (С0.01, МеОН) 260 (225), 304 (100) в ЕЮН - - Г+
Остреогрицин Z2 - 176 (разм) 218 (разл) -55 (С0.01, МеОН) 255 (210), 304 (100) в ЕЮН - - Г+
Остреогрицин Z3 - 183 (разм) 215 (распл) -57 (С0.01, МеОН) 260 (206), 303 (90) в ЕЮН - - Г+
Стафиломицин Mi: S.virginiae, S.olivaceus, S.mitakaensis, S.pristinae spiralis
Нейтральный рыжевато-коричневый порошок
165-167 (разл)
-190±2 (С0.5, EtOH) 174±2 (С0.5, МеОН)
216 (582), 270 (sh, 200)
555
C28H36O8N3 или
C28H25O7N3
Г+
Стафиломицин S: Слабая S.virginiae кислота,
красновато-
желтый
порошок
165-167 (разл) 240-242
-28 (С1, ЕЮН)
207 (590), 305 (98) в ЕЮН, 305, 355 (log Е 3.15, 3.85) в Н2О 303, 355 (3.76, 3.52) в 0.1н HCl, 333 (3.92) в 0.1н ШОН
823 C43H49010N7 Г+
Стрептограмин: S.graminofacilus
Нейтр. белый порошок_
155
-134
225,270-290 (sh), 350
501 С26HззО7Nз Г+
Этамицин:
S.griseus,
S.lavendulae
Основание,
кристалл.
вещество
168-170
(разл)
+62 (С5, СНС13) +31 (С5, ЕЮН) +7.7 (С2, МеОН)
303 (34), 350 (71) в Н2О, 303 (92), 350 (21) в 0.1н НС1,333(96) в 0.1н NаОH
878 С44H62О1oN8 Г+
*Атомная единица массы.
Правовращающими являются остре-огрицин G и этамицин. Хризомал от обоих антибиотиков отличается УФ-спектром, растворимостью в воде и антимикробным действием.
Все приведенные данные позволяют считать хризомал оригинальным полипептидным препаратом.
Как было показано выше, штамм S. chrysomallus Р-21 наряду с хризомалом продуцирует ароматический гептаен. ТСХ этого антибиотика в некоторых системах растворителей показала близость его к ароматическому гептаену - левори-ну. Однако сопоставление времени выхода полученного нами гептаена и левори-на методом ВЭЖК показало отчетливое их различие по составу компонентов и структуре (рис. 6). Работа по идентификации гептаена продолжается.
Изучению биологических особенностей микробов-антагонистов, механизмов действия на фитопатогенные микроога-низмы, выделению и идентификации активных соединений, обусловливающих их биологическую активность, посвящено немало публикаций и обзоров (Fravel, 1988; Igarashi et al., 1997). Активно изучаются антибиотики грибов-антагонистов. К.А.Тулемисова (1990) выделила ряд биологически активных соединений ан-трациклиновой природы из грибов р. Trichoderma. Из грибов р. Fusarium выделены антигрибные антибиотики, принадлежащие к циклодепсипептидам (Nihei et al., 1998). Некоторые представи-
тели рода Pénicillium одновременно с пенициллином образуют соединения, отнесенные к калбистринам (Jacson et al., 1993). Описаны антибиотики дактилфун-гины из Dactilaria parvispora (Deutero-mycetes). Способны образовывать антигрибные метаболиты и базидиомицеты. Метаболиты из Sparassis crispa идентифицированы как метил-2-окси-4-метокси-6-метилбензоат (спарассол), ме-тилселлинат и метил-диокси-метокси-метилбензоат. Активно продуцируют антибиотики бактерии. Довольно широко изучены антибиотики бацилл. В частности, показано, что Bacillus cereus образует цвиттермицин (Handlesman et al., 1996). Запатентован ряд штаммов B. subtilis, ингибирующих рост грибов (Новикова и др., 1994, 1996; Kubo, 1999). Пептидные антибиотики способны продуцировать представители псевдомонад Pseudomonas putida (Liao, 1989), P. fluorescens и P. syringae (Strobel et al., 1996).
Не менее перспективны для использования в защите от грибных болезней биопрепараты на основе метаболитов ак-тиномицетов рода Streptomyces. В сельском хозяйстве давно применялись антибиотики на основе производных стрептомицина и тетрациклина (Knosel, Cornils, 1978; Iwata et al., 1979; Keil, Civerolo, 1979; MacIntair et al., 1979). В последнее время интерес к этой группе микроорганизмов усилился. Например, антибиотик фейерифунгин с успехом использовали
для защиты от болезней мятлика однолетнего (Melvin et al., 1993). Работы многих исследователей направлены на идентификацию активных веществ и изучение механизма действия штамма микроба-антагониста на клетку патогена. В частности, из штамма Streptomyces sp. выделен антибиотик оксазоломицин, эффективно подавляющий развитие патогенов (Kawai et al., 1989).
Достаточно полно изучены антигрибные антибиотики аминогликозидной природы из штамма S. sporoglivosus (Lee Song, 1993). Особенно интересен тот
Вестник защиты растений, ,3, 2006 факт, что штамм одновременно выделяет фитогормон цитокинин. Показано, что штамм S. hydroscopicus образует вещество нуклеозидной природы, высоко эффективное против возбудителей мучнистой росы, вилта, антракноза. Многие виды стрептомицетов образуют полиеновые соединения - тетраены, гексаены и геп-таены. Е.Тохтамуров (1967) показал, что большинство из 1560 изученных им видов относились к S. albus, S. griseus и S. globisporus. Продуцирование стрептоми-цетами полиеновых антибиотиков показано и финскими исследователями.
Выводы
Из культуры S. chrysomallus Р-21 выделен комплекс биологически активных веществ, представляющий смесь полипептидного (хризомала) и ароматического гептаенового антибиотиков. Изучены фи-
зико-химические и биологические свойства полипептида - хризомала. Хризомал отнесен к группе пептидолактонов трео-нинового типа. Показана его оригинальность.
Литература
Антибиотики - полипептиды (структура, функция, биосинтез). Ред. Егоров Н.С. М., 1987, 264 с.
Зайченко А.М., Тугай Т.И., Шляховой В.В. Биосинтез (1)(4) С - макроциклических три-хотеценов. /Микробиолог. журнал, 51, 2, 1989, с.71-74.
Минбаев Р.М. Антибиотики против некоторых болезней зерновых культур. /Вест. АН Каз.ССР, 1979, с.23-38.
Новикова И.И., Иващенко В.Г., Калько Г.В., Бойкова И.В., Назаровская Л.А., Литвиненко А.И. Испытание новых биопрепаратов в борьбе с фузариозом колоса пшеницы. /Микология и фитопатология, 28, 1994, с.70-75.
Новикова И.И., Литвиненко А.И., Калько Г.В. Изучение влияния новых биопрепаратов на основе штаммов микробов-антагонистов на комплекс возбудителей корневых гнилей огурца. /Микология и фитопатология, 29, 5-6, 1996, с.46-53.
Роснев Б., Минчев Д., Петков П. Испытание in vitro антибиотиков А-159 и А-418 против Fusarium oxysporum. /Гор. стоп., 45, 5,
1989, с.20-22.
Тохтамуров Е. Полиеновые антибиотики и их использование в борьбе с болезнями растений. Автореф. канд. дисс. М., 1967, 30 с.
Тулемисова К.А. Микробиологические методы защиты растений. /Вест. АН Каз.ССР,
1990, с.29-36.
Юрина Т.П., Умнов А.М., Караваев В.А., Солнцев М.К. Влияние трихотецина на процесс патогенеза у растений пшеницы, пораженных возбудителем стеблевой ржавчины. /Физиол. раст., 36, 3, 1989, с.581-587.
Backhouse D., Stewart A. Ultrastructure of antagonism of Sclerotium cepivorum by Bacillus subtilis. /J. Phytopathol., 124. 1989, p.207-214.
Cheng X-Ch., Kihara T., Ying X, Uramoto M. A new antibiotic tautomycin. /Antibiotics, 42, 1, 1989, p.141-144.
Chormonova N.T., Nukerimova R.A., Tulemisova K.A. Effect of biopreparations on the fungal microflora changes in the sugar beet rhizospere. /Acta microbiol. hung., 35, 2, 1988, p.166-170.
Dunlop R., Simon A., Sivasithamparam K. An antibiotic from Trichoderma koningii active against soilborne plant pathogens. /J. Natur. Prod., 52, 1, 1989, p.67-74.
Fravel D.R. Role of antibiosis in the biocontrol of plant diseases. /Ann. Rew. Phytopathol., 26, Palo Alto (Calif.), 1988, p.75-91.
Gutterson N. Microbial fungicides: recent approaches to elucidating mechanisms. /Rew. biotechnol., 10, 1, 1990, p.69-91.
Handelsman J., Halverson L., Stabb E. Method of identifying Bacillus cereus having biocontrol activity. /Патент США, №5543301, 1996.
Igarashi M., Kinoshita N., Ikeda. Formamycin, a novel antifungal antibiotic produced by a strain of
Вестник защиты растений, ,3, 2006 Saccharothrix sp. /J. Antibiotics, 50, 11, 1997, p.926-931.
Iwata M., Suzuki Y., Kondo Y. An effective antibiotic active against bacterial leaf blight of rice plant. /Ann. Phytopathol. Soc. Jap., 45, 2, 1979, p.192-200.
Jackson M., Karwowski J., Humphrey P. Calbistrins, novel antifungal agents produced by Penicillium restrictum. /J. Antibiotics, 46, 1, 1993, p.34-38.
Kawai S., Kawabata J.,Kobayashi A. Inhibitory effect of oxalomycin on crown gall formation. /Agr.and Biol.Chem., 53, 4, 1989, p.1127-1133.
Keil H., Civerolo E. Effect of trunk injectins of oxytetracycline on bacterial spot disease in peach trees. /Plant Diseae. Rept., 63, 1979, p.1-5.
Knosel D., Cornils H. Development of cell numbers of Erwinia amylovora in plant tissues under influence of streptomycin treatment. /Proc.4-th. Int. Conf. Plant Pathol. Bact., 2, 1978, p.461-466.
Kubo K. Fungal inhibiting composition comprising Bacillus subtilis FERM BP-3418. /Патент США № 5667779, 1999.
Lee Song Ga. Characteristics of phytohormon cytokinin and antibiotics from Streptomyces sporoclivosus 3482. /Saengmulhak - Biology, 1, 1993, p.20-23.
Liao C. Antagonism of Pseudomonas putida strain PP22 to its potential use as a biological agent. /Plant Diseae. 73, 3, 1989, p.223-226.
Lin Long-Ze, Blasko G, Cordell J. H-NMR analysis of herbimycins and dihidro-herbimycins. /J. Natur. Prod., 51, 6, 1988, p.1161-1165.
MacIntyre J., Schneider H., Lacy G. Pear decline in
Connecticut and response of disease trees to Oxytetracycline infusion. /Phytopathology, 69, 1979, p.955-958.
Martin J. Liras P. Organization and and expression of genes involved in the biosynthesis of antibiotics and other secondary metabolites. /Ann. Rew. Microbiol., Palo Alto (Calif.), 1989, p.173-206.
Melvin B., Nair M., Vargas J. Controlling annual bluegrass (Poa annua L.) summer path disdisease with faeriefungin. /Hort. Science, 28, 3, 1993, p.196-203.
Nihei K, Itoh H, Hashimoto K. Antifungal cyclodepsipeptides, W493 A and B from Fusarium sp.: isolation and structural determination. /Biosci., Biotechnol. and Biochem., 62, 5, 1998, p.858-863.
Pietr S., Oros G. Antifungal activity of polypeptide antibiotics produced by some strains of Bacillus subtilis. /Tagunsber. Akad. Landwirtschafts-Wiss. DDR, 253, 1987, s.261-266.
Sarangamat G., Weller D., Sarkar H., Cook R. Characterization of antibiotic produced by strain of Pseudomonas fluorescens inhibitory to Gaeumannomyces gramini var. tritici and Pythium spp. /Antimicrob. Agents ad Chemother., 29, 3, 1986, p.488-495.
Shoda M., Ano T., Tsuge K. Characterization of Bacillus subtilis YBB, coproducer of lipopeptides surfactin and plipastatin B1. /J. Gen. and Appl. Microbiol., 41, 6, 1995, p.541-545.
Strobel G., Harrison L., Teplow D. Peptides from Pseudomonas syringae possessing broad-spectrum antibiotic activity. /Патент США №5576298, 1996.
BIOLOGICAL FEATURES AND COMPONENTAL STRUCTURE OF ACTIVE COMPLEX OF STREPTOMYCES CHRYSOMALLUS P-21 STRAIN - ANTAGONIST OF PHYTOPATHOGENIC FUNGI I.I.Novikova, I.V.Boikova, Yu.D.Shenin During the course of screening program for new strain-producers of antifungal and antibacterial antibiotics using different test organisms, streptomycete strains were found to produce new original antibiotics - peptides. A new biopreparation Chryzomal for plant protection was prepared on the base of S.chrysomallus R-21 strains. The Chryzomal showed high efficacy against phytopathogenic fungi and viruses and for growth promotion activity. This paper discusses its structure peculiarity and biological properties. Active fungicidal complex and major components have been isolated from mycelium culture by extraction with organic solvent, Selica gel column chromatography and TLC. According to the analysis of IR and NMR-spectra and comparing its physicochemical and biological properties with these of polypeptides described in literature, the Chryzomal has been classified as belonging to the antibiotic peptide lactone type threonine, original substances.
