CC BY
75
ЭПИДЕМИОЛОГИЯ
IVh
МЕДИЦИНСКИЙ
АЛЬМАНАХ
УДК 579.83:616.37-022-036.12
БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ЛАКТОБАКТЕРИЙ,
ВЫДЕЛЕННЫХ ОТ БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКИМ ПАНКРЕАТИТОМ
Э.С. Горовиц, Е.В. Токарева, В.А. Несчисляев, М.Г. Столбова, Я.В. Долгих,
ГОУ ВПО «Пермская государственная медицинская академия», ФГУП «НПО Микроген» МЗ РФ филиал г. Пермь
Токарева Елена Васильевна - e-mail: tokareva-ei@maii.ru
Изучены биологические свойства лактобактерий, изолированных от больных хроническим панкреатитом с дисбиозом кишечника. Установлено, что практически все культуры характеризовались достаточно выраженной антагонистической активностью в отношении тест-
штаммов эшерихий, сопоставимой с производственным штаммом. В то же время они отличались низкой адгезивностью, что возможно является причиной снижения их уровня в микробной популяции. Способность накапливать биомассу так же, как и совместимость с пробиотиком, варьировала в широком диапазоне, что свидетельствует о необходимости предварительного изучения особенностей биологических свойств различных представителей биоценоза кишечного биотопа для осуществления индивидуального подхода к терапии такого рода больных.
W Ключевые слова: хронический панкреатит, биологические свойства лактобактерий.
We studied the biological qualities of lactobacteria, isolated from chronic pancreatitis patients with the intestinal disbiosis. It was found out that almost all the cultures were characterized by a maked antagonistic activity concerning Escherichia test-strains, compared with the production strain. At the same time the cultures reveled a low adhesive capacity that seemed to be the cause of their level decrease in the microbe population. Their ability to accumulate the biomass as well as their compatibility with the probiotic demonstrated a great variety. This fact testified the necessity of the preliminary studies of biological date peculiarities in different intestinal type biotobic biocenosis representative to provide an individual approach to these patients therapy.
Key words: chronic pancreatitis, lactobacteria biological qualities.
Введение
Под дисбактериозом (дисбиозом) принято понимать негативное изменение количественного и качественного
состава микрофлоры различных биотопов организма человека. Однако, при анализе состояния микробиоты чаще всего лишь констатируется факт изменения количества тех или иных представителей облигатной и транзиторной микрофлоры. В то же время количественные нарушения нормофлоры могут сопровождаться и изменением её биологических свойств, что необходимо учитывать для повышения эффективности проводимых терапевтических мероприятий.
Известно, что патология различных органов пищеварения, в том числе и поджелудочной железы, способствует развитию дисбиотических состояний. Ранее нами было показано, что хронический панкреатит сопровождается выраженными изменениями уровня индигенной микрофлоры, её анаэробного компонента, в том числе лактобактерий [1]. Такие нарушения микробиоценоза требуют коррекции с использованием пробиотиков. Рациональный подход к бактериотерапии предполагает предварительный анализ биологических особенностей представителей нормофлоры, доминирующих в измененных популяциях лактобактерий, что способствует выбору адекватных препаратов. Длительный прием пробиотиков не должен оказывать негативного влияния на микроорганизмы, поскольку основная цель коррекции связана с восстановлением их популяции за счет увеличения численности индигенных штаммов. Этот аспект терапии особенно значим при использовании лактосодержащих препаратов, производственные культуры которых обладают высокой антагонистической активностью.
Цель настоящего исследования - изучение основных биологических свойств и характера взаимодействия с пробиотиками лактобактерий, изолированных от больных хроническим панкреатитом.
Материалы и методы
Лактобактерии выделены в процессе бактериологического обследования на дисбактериоз кишечника от 12 больных первичным и вторичным хроническим панкреатитом легкой и средней тяжести в стадии обострения. У всех больных констатировали снижение уровня лакто- (<107) и бифидобактерий (<108) на фоне расширения спектра и увеличения количества условно-патогенных бактерий.
Антагонистическую активность выделенных культур лактобактерий изучали с помощью экспресс-теста на основе ингибирования биолюминесценции индикаторной культуры штамма E. coli lum+ [2]. Адгезивные свойства исследовали по методу В.И. Брилиса и соавт. [3]. В качестве клеточной субстанции использовали нативные эритроциты человека 0 (I) - первой группы, Rh «+» положит. Адгезивную активность оценивали по среднему показателю адгезии (СПА), под которым понимали среднее количество микробов, прикрепившихся к одному эритроциту при подсчете не менее 25 эритроцитов, учитывая не более 5 эритроцитов в одном поле зрения. Здесь и в последующих исследованиях контролем служил производственный штамм Lactobacillus plantarum 8P-A3. Изучали также способность изолированных культур лактобактерий к накоплению биомассы при выращивании на элективной среде МРС-1 с последующим определением КОЕ/мл в двух суточных культурах на среде МРС-4.
Все выделенные штаммы были исследованы на чувствительность к лактобактерину в тесте отсроченного антагонизма методом перпендикулярных штрихов, посевы выполняли на среде МРС-5 [4]. Статистическую обработку проводили в использованием компьютерной программы Microsoft® Excel, 2003.
Результаты и их обсуждение
Несмотря на то, что адгезивная активность выделенных штаммов лактобактерий варьировала в различных пределах, у большинства культур она была снижена. Так, если СПА производственного штамма был 2,68+1,37, то у изученных культур максимальное значение этого показателя не превышало 2,0+1,19 (таблица 1).
ТАБЛИЦА 1. ТАБЛИЦА 2.
Результаты изучения Количество жизнеспособных
адгезивных свойств клеток в двух суточных
изолированных лактобактерий культурах лактобактерий
№ образца Цифровые значения СПА № образца КОЕ/мл
1 1,92 ± 0,86 1 3,0 х 109
2 1,80 ± 0,91 2 0,2 х 109
3 1,80 ± 0,86 3 рост отсутствует
4 1,64 ± 0,86 4 рост отсутствует
5 1,84 ± 0,85 5 4,0 х 109
6 1,68 ± 1,21 6 0,2 х 109
7 1,64 ± 0,90 7 рост отсутствует
8 1,96 ± 1,05 8 6,0 х 109
9 1,84 ± 0,80 9 0,5 х 109
10 1,52 ± 1,00 10 рост отсутствует
11 1,56 ± 1,04 11 2,0 х 109
12 2,00 ± 1,19 12 0,3 х 109
Контроль 2,68 ± 1,37 Контроль 5,3 х 109
Возможно, уменьшение адгезивной способности лактобактерий, выделенных от больных хроническим панкреатитом с дисбиотическими нарушениями, в известной мере объясняет снижение их доли в общей популяции микроорганизмов кишечного биотопа. Поскольку, как известно, именно адгезия является начальным этапом процесса колонизации пристеночной микрофлоры.
Изучаемые культуры лактобактерий обладали достаточно выраженной антагонистической активностью в отношении условно-патогенных энтеробактерий, сопоставимой с производственным штаммом (рис.).
РИС.
Динамика подавления свечения.
ЭПИДЕМИОЛОГИЯ
ЭПИДЕМИОЛОГИЯ
Nh
МЕДИЦИНСКИЙ
АЛЬМАНАХ
В тесте подавления биолюминесценции E. coli lum+ при совместной экспозиции все изолированные культуры (за исключением первой) обусловливали аналогичную динамику ингибирования свечения люминесцирующего штамма E. coli, которая характеризовалась последовательным накоплением эффекта, максимум которого (100% подавления) наблюдали к 24 часам экспозиции. Штамм № 1 в первые часы стимулировал свечение тест-культуры, а начиная с 4 часов экспозиции стал её подавлять.
ТАБЛИЦА 3.
Чувствительность клинически выделенных штаммов лактобактерий к пробиотику на основе штамма I. plantarum 8Р-А3
№ образца Зона задержки, мм
Аэробные условия
1 7,00 ± 1,82
2 23,8 ± 1,46
3 35,2 ± 1,24
4 17,0 ± 0,84
5 20,6 ± 1,57
6 0,00 ± 0,00
7 > 60
8 > 60
9 > 60
10 > 60
11 > 60
12 0,00 ± 0,00
13 (контроль, изоантагонизм лактобактерий) 17,2 ± 0,52
При изучении уровня накопления биомассы выделенных штаммов лактобактерий на элективной питательной среде было установлено, что большая часть штаммов (66,6%) обладали достаточно высокой скоростью роста, через 24-48 ч культивирования достигали концентрации 109 КОЕ/мл (таблица 2). Можно полагать, что восстановление представляемых ими популяций в ходе лечебной коррекции будет происходить быстрее, чем в остальных случаях, когда доминирующие штаммы менее активны.
В серии специальных наблюдений мы изучали чувствительность выделенных лактобактерий к лактобактерину (коммерческому препарату). Результаты исследований представлены в таблице 3.
Как свидетельствуют представленные данные, диапазон чувствительности к лактобактерину различных штаммов был чрезвычайно широк, от её полного отсутствия (штаммы № 6 и № 12) до тотального подавления роста, когда зона ингибирования подсеваемого штамма составила более 60 мм (штаммы №№ 7-11). Важно отметить, что эти данные позволяют оценить целесообразность использования лактобактерина для коррекции дисбиоза у каждого конкретного больного.
Выводы
1. Практически все выделенные от больных хроническим панкреатитом культуры лактобактерий характеризовались достаточно высокой антагонистической активностью в отношении тест-штаммов эшерихий. В то же время они отличались низкой адгезивностью, что, возможно, объясняет снижение их уровня в микробной популяции.
2. Способность накапливать биомассу так же, как и совместимость изолированных штаммов с пробиотиком варьировали в широких пределах, что свидетельствует о необходимости индивидуального подхода к терапии такого рода больных с предварительным изучением особенностей биологических свойств различных представителей биоценоза кишечного биотопа.
ЕЯ
ЛИТЕРАТУРА
1. Токарева Е.В. Характеристика микрофлоры кишечника при заболеваниях желудочно-кишечного тракта. Проблемы и перспективы современной науки: Материалы IV международной научной конф. молодых ученых-медиков. Томск. 2010. С. 262-264.
2. Патент 2187801 Россия А 61 К 35/74, G 01 N 33/15. Способ определения антагонистической активности пробиотиков. В.А. Несчисляев, Р.А. Пшеничнов, Е.Г. Арчакова и др. 2002.
3. Брилис В.И., Т.А. Брилене, Х.П. Ленцнер. Методика изучения адгезивного процесса микроорганизмов. Лабораторное дело. 1986. № 4. С. 210-212.
4. МУК 4.2.2602-10. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Система предрегистрационного доклинического изучения безопасности препаратов. Отбор, проверка и хранение производственных штаммов, используемых при производстве пробиотиков. Методические указания (утв. Роспотребнадзором 21.04.2010).
