CC BY
129
УДК 579.6
Ключевые слова: лактобациллы, нормофлора, антагонистическая активность, пробиотик, поросята
Key words: lactobacillus, normal flora, antagonistic activity, probiotic, pigs
Дармов И. В., Маракулин И. В., Погорельский И. П., Позолотина Н. В.
ВЫДЕЛЕНИЕ И СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММОВ ЛАКТОБАЦИЛЛ - ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ НОРМАЛЬНОЙ КИШЕЧНОЙ
МИКРОФЛОРЫ ПОРОСЯТ
ISOLATION AND COMPARATIVE CHARACTERISTICS OF LACTOBACILLUS STRAINS REPRESENTATIVES OF THE NORMAL INTESTINAL FLORA OF PIGS
ФГБОУ ВПО «Вятский государственный университет» Адрес: 610000, Россия, г. Киров, Московская ул., 36
Vyatka State University Address: 610000, Russia, Kirov, Moskovskaya str., 36
Дармов Илья Владимирович, д. м. н., проф., член-корр. РАЕН, зав. каф. микробиологии
Darmov Ilya V., Doctor of Medicine, Professor, Corresponding Member of the Academy of Natural Sciences, Head of the Dept. of Microbiology Маракулин Игорь Вадимович, д. м. н., проф. каф. микробиологии Marakulin Igor V., Doctor of Medicine, Professor of the Dept. of Microbiology Погорельский Иван Петрович, д. м. н., проф., член-корр. РАЕН, зав. каф. микробиологии Pogorelsky Ivan P., Doctor of Medicine, Professor, Corresponding Member of the Academy of Natural Sciences, Professor of the Dept. of Microbiology Позолотина Надежда Владимировна, аспирант / Pozolotina Nadezhda V., Postgraduate
Аннотация. В статье представлены результаты изучения биохимических, антагонистических, адгезивных свойств штаммов лактобацилл, выделенных из кишечного содержимого здоровых молочных поросят. Показана пригодность выделенных штаммов лактобацилл для создания нового пробиотического препарата для лечения и профилактики дисбактериоза у поросят в доотъемный и отъемный периоды.
Summary. The publication presents the results of the study of biochemical, antagonistic, adhesive properties of lactobacillus strains isolated from the intestinal contents of healthy weaned piglets. The suitability of the selected lactobacillus strains in creation of new probiotic preparations for the treatment and prevention of dysbiosis in piglets during pre-weaning and weaning periods is shown.
Введение
Среди болезней сельскохозяйственных животных желудочно-кишечные инфекции занимают одно из лидирующих мест.
Для лечения и профилактики кишечных инфекций у молодняка свиней используются различные антимикробные препараты. Однако при неконтролируемом использовании антибиотиков возникают лекарственно-устойчивые штаммы патогенных микроорганизмов, представляющие еще большую опасность. Возможно возникновение дис-биотических состояний, которые без соответствующего лечения также могут привести к гибели животных.
Возможной альтернативой антибиотико-терапии являются пробиотики.
Известны и экспериментально подтверждены данные о том, что для профилактики
и лечения дисбактериоза молодняка свиней лучше использовать пробиотические штаммы лактобацилл, выделенные из организма здоровых поросят [6]. Это связано с тем, что выживаемость гомопробиотических лак-тобактерий в желудочно-кишечном тракте значительно выше, чем чужеродных, так как они более адаптированы к условиям существования по спектру вырабатываемых ферментов и структуре адгезивных рецепторов, обеспечивающих их длительную персистен-цию в кишечнике. Поэтому использование биопрепаратов, основу которых составляют гомопробиотические лактобактерии, является эффективным для лечения и профилактики кишечных инфекций и дисбиозов [4].
В настоящее время перечень отечественных ветеринарных пробиотических препаратов ограничен, импортные биопрепараты
сельскохозяйственного назначения имеют высокую стоимость, а наиболее часто применяемые в ветеринарии пробиотики обладают невысокой эффективностью, так как обычно содержат чужеродные пробиотические микроорганизмы, выделенные от людей, из кисломолочных продуктов или из окружающей среды.
В связи с этим актуальным является поиск новых гомопробиотических штаммов лактобацилл, обладающих высокой антагонистической и адгезивной активностями и перспективных для создания эффективных биопрепаратов для лечения и профилактики дисбактериозов у поросят.
Материалы и методы
В экспериментах использовали 5 изолятов микроорганизмов, выделенных при высеве на питательную среду MRS [3] из кишечного содержимого здоровых поросят-отъемышей. Посевы инкубировали в анаэростате при температуре (37±1) °С.
Ферментативную активность исследуемых культур лактобацилл оценивали с использованием коммерческого набора реагентов фирмы HiCarbo. Инкубирование инокулирован-ных стрипов биохимической тест-системы осуществляли при температуре (37±1) °С в течение 3 суток. В качестве контроля использовали штамм Lactobacillus plantarum из коллекции ФГБОУ ВПО «ВятГУ».
Исследование способности культур выделенных изолятов расти в микроаэрофильных условиях проводили в газовой смеси следующего состава: С02 - 20 %, N2 - 75 %, O2 -5 %. Для этого агаровые культуры штаммов лактобацилл высевали в концентрации 103-104 кл/мл на чашки с плотной питательной средой MRS. Посевы инкубировали при температурах (15±1) °С, (37±1) °С и (45±1) °С.
Оценку влияния исходной концентрации водородных ионов в питательной среде на способность лактобацилл к накоплению биомассы осуществляли в жидких и на плотных питательных средах MRS. Для этого суспензии суточных агаровых культур в концентрации (4-4,5) • 1010 кл/мл в объеме 0,1 мл вносили во флаконы с жидкой питательной средой MRS и на плотную питательную сре-
ду MRS с рН 5,0; 6,3; 8,0. По окончании инкубации культуру с поверхности питательного агара смывали физиологическим раствором хлористого натрия. Концентрацию микробов в полученной суспензии и в питательном бульоне определяли спектрофотометрическим методом.
Оценку адгезивных свойств лактобакте-рий осуществляли фотоколориметрическим экспресс-методом [3] и методом В. И. Бри-лиса [1]. Субстратом для адгезии лактобацилл служили эритроциты человека 0 (I) Rh+ группы крови и эритроциты свиньи. Лакто-бациллы выращивали в течение 24 часов на плотной питательной среде MRS при температуре (37±1) °С. Выросшие культуры отмывали в физиологическом растворе хлорида натрия и готовили суспензии с оптической плотностью, равной 1,0. В пробирки вносили по 1 мл взвеси трижды отмытых эритроцитов с концентрацией 1012 кл/л и 2,5 мл суспензии исследуемых культур лактобакте-рий. Для приготовления суспензии микроорганизмов и эритроцитов использовали фосфатно-буферный раствор (рН 7,2-7,3). Контролем служили пробы, содержащие 2,5 мл суспензии микробных клеток и 1 мл фосфатно-буферного раствора (контрольная проба № 1); 1 мл суспензии эритроцитов и 2,5 мл фосфатно-буферного раствора (контрольная проба № 2). Опытные и контрольные пробы инкубировали при температуре (37±1) °С в течение 30 минут. Для осаждения эритроцитов пробы центрифугировали при 1000 об./мин. в течение 2 минут, затем отбирали надосадочную жидкость в объеме 2 мл и измеряли ее оптическую плотность. В каждой серии опытов выполняли по пять независимых определений.
Использовали следующие критерии оценки выраженности адгезивных свойств у лак-тобактерий в отношении человеческих и свиных эритроцитов: при показателе адгезии более 40 % - высокий уровень адгезивной активности, при показателе адгезии от 15 до 40 % - средний уровень адгезивной активности, при показателе адгезии от 5 до 15 % -низкий уровень адгезивной активности, при показателе адгезии менее 5 % степень адгезии бактерий считалась нулевой.
При определении адгезивных свойств лактобактерий по методу В. И. Брилиса [1] использовали приготовленную на фосфат-но-буферном растворе взвесь эритроцитов с концентрацией 108 кл/мл. На предметное стекло наносили 0,02-0,03 мл буферного раствора, в котором суспендировали равный объем взвеси эритроцитов и суспензии лак-тобактерий.
Предметное стекло с эритроцитами и лак-тобациллами помещали во влажную камеру (эксикатор) на 30 мин. при температуре (37±1) °С, затем препарат высушивали при этой же температуре, фиксировали в пламени горелки и окрашивали фуксином Пфейф-фера в течение 2 минут.
Оценку адгезивных свойств исследуемых культур лактобактерий проводили под световым микроскопом путем определения среднего показателя адгезии, который равен среднему количеству лактобацилл, прикрепившихся к одному эритроциту.
Критерии оценки адгезивных свойств микроорганизмов по методу В. И. Брилиса были следующие: высокая степень адгезии -4,01 и более бактерий, средняя степень адгезии - от 2,01 до 4,0 бактерий, низкая степень адгезии - от 1,01 до 2,0 бактерий, нулевая степень адгезии - 0-1,0 бактерия на поверхности одного эритроцита.
Оценку антагонистической активности штаммов осуществляли в условиях in vitro с помощью двухслойной методики по Фри-дерику. В качестве тест-штаммов был использован набор культур разных видов эн-теробактерий, выделенных из кишечного содержимого поросят-отъемышей, отстающих в росте. Культуры лактобактерий выращивали на плотной питательной среде MRS в течение 24 часов при температуре (37±1) °С в микроаэрофильных условиях. В качестве контроля использовали культуру штамма E. coli С 600, который является универсальным индикаторным штаммом и используется для оценки антагонистических свойств разных видов микроорганизмов.
Для выявления способности к кисло-тообразованию флаконы с 25 мл жидкой питательной среды MRS засевали культурами лактобацилл и инкубировали при
температуре (37±1) °С в течение 48 часов. По окончании инкубации определяли кислотообразующую активность лактобактерий титрометрическим методом Тернера. Каждую пробу культуральной жидкости объемом 10,0 см3 титровали 0,1 М раствором NaOH. При этом показатель pH раствора NaOH контролировали потенциометрически, значение его должно составлять (8,5±0,1) ед.
Результаты исследований
Для исследований были отобраны 5 изоля-тов молочнокислых бактерий, обозначенные №№ 13, 40, 41, 44 и 48. Все они представляют собой неподвижные грамположитель-ные палочки. Отдельные бактерии изолятов №№ 40, 41 и 44 анилиновые красители воспринимают неоднородно, поэтому обнаруживаются метахроматическая зернистость и биполярные тельца. При выращивании на плотных питательных средах на вторые сутки культивирования при температуре (37±1) °С в микроаэрофильных условиях исследуемые изоляты бацилл на плотной питательной среде MRS формируют колонии различной формы. Бактерии изолята № 13 формируют колонии диаметром 1-2 мм, непрозрачные, белого цвета, блестящие, круглые по форме с выпуклой бугристой поверхностью. Край колонии неровный. Колонии изолятов №№ 40, 41 и 44 непрозрачные, круглые, грязно-белого цвета. Поверхность колоний гладкая, матовая, края четкие и ровные. Большинство колоний выпуклые, некоторые имеют утолщения по краям в виде валика. Диаметр колоний 2-3 мм. Бактерии изолята № 48 формируют колонии диаметром 2-4 мм, непрозрачные, бежевого цвета. Форма колонии круглая, края четкие, но неровные. Поверхность колонии гладкая, матовая. Центр колонии конусовидный, плавно переходит в уплощенную периферическую часть. Все выделенные изоляты по отношению к кислороду являются микроаэ-рофилами. Спор и капсул не образуют, жгутиков не имеют.
Данные по ферментативной активности выделенных нами культур лактобацилл, оцениваемой с помощью коммерческой биохимической тест-системы HiCarbo, представлены в таблице 1.
Таблица 1.
Ферментативная активность изолятов молочнокислых бактерий
Наименование субстрата Способность изолята № ... ферментировать субстрат
L. plantarum (контроль) 13 40 41 44 48
Лактоза + - + + + -
Ксилоза ± - + - - -
Мальтоза + - + + + +
Фруктоза ± + + + + -
Декстроза + + + + - -
Галактоза + - + + - +
Раффиноза - - + + - -
Трегалоза - ± + + + -
Мелибиоза - - + + + +
Сахароза - - + + + +
L-арабиноза + - + - - -
Манноза + + + + + -
Инулин + + + + - -
Глюконат натрия + - - - - -
Глицерол - - - - - -
Салицин + - - - - -
Дульцит - - - - - -
Инозитол - - + - - -
Сорбитол - - + - - -
Маннитол - - + - - -
Адонитол - - + - - -
Арабитол - - + - - -
Эритрит - - + - - -
а-метил-Э-глюкоза + - + + - -
Рамноза + - - - - -
Целлобиоза + - - - - -
Мелецитоза ± - - - - -
Метил-Э-маннозид - - - - - -
Ксилитол - - - - - -
Орто-нитропенил-Р-галактозид (OPNG) - - - + - -
Эскулин + + - - - -
Э-арабиноза - - - - - -
Цитрат - - - - - -
Малонат - - - - - -
Сорбоза - - - - - -
Примечание: «+» - бактерии ферментируют субстрат; «-» - бактерии не ферментируют субстрат; «±» - способность ферментировать субстрат в течение срока наблюдения (3 суток) вариабельна.
Одним из показателей, который используется при видовой идентификации лактобацилл, является их способность расти при температурах (15±1) °С и (45±1) °С.
Результаты исследования способности выделенных культур лактобацилл расти на плотной питательной среде MRS в микро-аэрофильных условиях при разных темпе-
ратурах инкубирования представлены в таблице 2.
Как видно из представленных в таблице 2 данных, изоляты №№ 40, 41, 44, 48 после 48 часов инкубирования характеризуются отсутствием роста при температуре (15±1) °С и наличием роста при температуре (45±1) °С. Контрольный штамм и изо-лят № 13 формируют нежный рост на вторые сутки инкубирования при температуре (15±1) °С. При температуре (45±1) °С бактерии изолята № 13 образовывали колонии на вторые сутки выращивания, а контрольного штамма - только на четвертые сутки.
По совокупности результатов изучения культурально-морфологических, тинкториаль-ных, биохимических и генетических свойств была определена видовая принадлежность изо-лятов микроорганизмов: № 13 - Lactobacillus
paracasei (далее - L. paracasei 13), №№ 40, 41 и 44 - Lactobacillus salivarius (далее -L. salivarius 40, L. salivarius 41 и L. salivarius 44), и № 48 - Lactobacillus reuteri (далее L. reuteri 48).
В таблице 3 представлены результаты исследования способности выделенных штаммов лактобацилл к накоплению биомассы при различных показателях кислотности среды.
На следующем этапе исследований были изучены факторы специфической активности лактобацилл: способность к адгезии, антагонистическая активность в отношении разных видов энтеробактерий и уровень кис-лотообразования при выращивании в жидкой питательной среде.
Адгезивные свойства лактобактерий в отношении эритроцитов человека и свиньи
Таблица 2.
Способность изолятов лактобацилл к росту на плотной питательной среде MRS при температурах (15±1) °С и (45±1) °С
Время культивирования, ч Наличие роста изолята номер ... при температуре ...
L. plantarum (контроль) 13 40 41 44 48
Температура культивирования, °С
15 45 15 45 15 45 15 45 15 45 15 45
24 - - - - - + - + - + - +
48 + - + + - + - + - + - +
72 + - + + - + - + + + - +
96 + + + + - + - + + + - +
120 + + + + - + - + + + - +
144 + + + + - + - + + + - +
Примечание: «+» - наличие роста, «-» - отсутствие роста.
Таблица 3.
Способность штаммов лактобацилл к накоплению биомассы при различных значениях pH жидкой питательной среды MRS (n = 3, x±I95)
Штамм Оптическая плотность суспензии лактобактерий (0D540) при рН среды выращивания ..., ед.
5,0 6,3 8,0
L. paracasei 13 0,71±0,07 0,96 ± 0,05 0,93 ± 0,06
L. salivarius 40 1,11±0,09 1,13±0,05 1,12±0,08
L. salivarius 41 1,13 ± 0,06 1,16 ± 0,06 1,14 ± 0,07
L. salivarius 44 1,08 ± 0,08 1,04 ± 0,09 1,07 ± 0,08
L. reuteri 48 0,91 ± 0,05 0,85 ± 0,05 0,84 ± 0,07
L. plantarum (контроль) 0,93 ± 0,06 1,08 ± 0,05 1,21 ± 0,07
оценивали по формуле:
, , Дк 1 + Дк2 Доп
ПА =--100 %
Д
к1
где ПА - показатель адгезии, Дк1 - оптическая плотность надосадочной жидкости в 1-й контрольной пробе, Дк2 - оптическая плотность надосадочной жидкости во 2-й контрольной пробе, Доп - оптическая плотность надосадочной жидкости в опытной пробе. Средние значения полученных результатов представлены в таблице 4.
В таблице 5 представлены результаты исследований адгезивных свойств изучаемых штаммов по методу В. И. Брилиса.
Результаты исследования антагонистической активности лактобацилл в отношении разных видов энтеробактерий представлены в таблице 6.
Известно, что антагонистические свойства лактобацилл в значительной мере обусловлены кислотообразующей активностью. В связи с этим представлялось целесообраз-
ным изучить это свойство у лактобактерий исследуемых штаммов по методике Тернера (табл. 7).
Расчеты производили по формуле:
Т0 = а • К • 100,
где а - объем 0,1 М раствора №ОН, пошедший на титрование, мл; К - поправка к титру №ОН; Т0 - градус Тернера, условная величина, выраженная в количестве щелочи, использованной при титровании 1,0 мл исследуемой суспензии.
Обсуждение результатов
Для видовой идентификации лактобак-терий были изучены морфологические и биохимические характеристики. Известно, что лактобациллы характеризуются вариабельностью свойств, которые могут быть закодированы на плазмидах. Поэтому для более точной идентификации был использован генетический метод, который позволяет дифференцировать фенотипически похожие
Таблица 4.
Адгезивные свойства лактобацилл в отношении эритроцитов человека и эритроцитов свиньи, определенные с помощью фотоколориметрического метода (п = 3, х±195)
Штамм Показатель адгезии в отношении эритроцитов ..., процент
человека свиньи
L. paracasei 13 56,48±7,63 50,79±3,44
L. 40 2,13±0,35 34,62±16,71
L 41 6,01±0,87 22,96±2,42
L. •а1^апш 44 45,80±5,21 23,02±3,44
L. геШеп 48 20,67±1,53 15,71±4,89
L. р1аШагит (контроль) 56,42±7,54 10,06±1,03
Таблица 5.
Адгезивные свойства лактобактерий в отношении эритроцитов человека и эритроцитов свиньи, определенные по методу В. И. Брилиса (п = 3, х±195)
Штамм Показатель адгезии в отношении эритроцитов ...
человека свиньи
L. paracasei 13 4,70±0,64 5,41 ± 1,31
L. •а1^апш 40 1,69 ± 0,45 2,91 ± 1,12
L. •а1^апш 41 1,77±0,44 2,14 ± 0,32
L. •а1^апш 44 3,54±0,53 2,25 ± 0,51
L. геШеп 48 2,07±0,71 1,85 ± 0,30
L. р1аШагит (контроль) 5,10±1,20 0,84 ± 0,21
Таблица 6.
Антагонистическая активность лактобацилл в отношении разных видов энтеробактерий (n = 3, x±I)
Вид энтеро-бактерий Величина зоны задержки роста энтеробактерий разных видов культурой исследуемого штамма лактобацилл ..., мм
L. plantarum (контроль) L. paracasei 13 L. salivarius 40 L. salivarius 41 L. salivarius 44 L. reuteri 48
Escherichia coli 15,3±2,6 42,3±5,2 44,3±6,1 28,7±5,4 29,7±5,2 24,1±7,7
Serratia odorifera 42,7±6,3 70,3±8,6 33,7±5,9 34,3±6,8 35,3±4,2 28,7±6,8
Proteus mirabilis 31,5±9,1 81,3±12,8 54,3±7,7 48,5±9,0 33,1±7,1 33,8±5,9
Salmonella pilorum 41,1±5,8 75,7±7,7 33,5±9,1 30,5±5,7 31,5±8,5 26,5±7,5
Proteus vulgaris 42,3±9,5 88,1±8,2 35,4±9,8 61,8±8,6 58,4±7,9 49,5±5,3
Pseudomonas aeruginosa 32,5±6,7 40,1±5,5 41,8±8,2 33,4±7,1 35,3±8,5 32,7±6,9
E. coli C600 (контроль) 38,2±14,1 49,5±11,8 25,5±12,1 30,7±4,8 34,7±17,1 36,1±13,5
Таблица 7.
Характеристика кислотообразующих свойств штаммов лактобацилл (n = 3, x±I)
Штамм Показатель предельного кислотообразования, градус Тернера
L. paracasei 13 340,8±6,3
L. salivarius 40 382,7±5,2
L. salivarius 41 327,8±7,8
L. salivarius 44 338,4±7,7
L. reuteri 48 240,6±4,8
L. plantarum (контроль) 185,6±8,7
виды. Результаты видовой идентификации данных штаммов лактобацилл были подтверждены в лаборатории Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ГосНИИГенетики (г. Москва) путем изучения последовательностей генов 16S рРНК методом ПЦР.
Известно, что от содержания водородных ионов в питательной среде, на которой выращивают лактобактерии разных видов, существенно зависит выход их биомассы. Анализ представленных в таблице 3 результатов показал, что по оптической плотности бактериальные суспензии L. salivarius 40, L. salivarius 41, L. salivarius 44, и L. ^Швп 48, выращенные в питательных средах с разны-
ми значениями рН, достоверно не отличались друг от друга; для культур L. paracasei 13 и контрольного штамма L. plantarum оптимальными для роста являются питательные среды со значением рН 6,3 и 8,0.
Адгезивная активность лактобактерий является одним из важных критериев при оценке перспективности использования штаммов в составе пробиотических препаратов, поскольку она непосредственно влияет на длительность персистенции лактобактерий в кишечнике. Анализ данных адгезивных свойств лактобацилл в отношении эритроцитов человека и эритроцитов свиньи, определенных с помощью фотоколориметрического метода, представленный в таблице 4,
свидетельствует о том, что бактерии штамма L. р1аШагит обладают высокой адгезивной активностью в отношении эритроцитов человека и низкой - в отношении эритроцитов свиньи. Бактерии штаммов L. salivarius 40 и L. salivarius 41 имеют низкую адгезивную активность в отношении эритроцитов человека и средний уровень показателя адгезии к эритроцитам свиньи. Бактерии штамма L. paracasei 13 проявляют выраженную адгезивную активность как по отношению эритроцитам человека, так и по отношению к эритроцитам свиньи.
Результаты исследований адгезивных свойств изучаемых штаммов по методу В. И. Брилиса, представленные в таблице 5, полностью согласуются с данными, полученными при определении адгезивных свойств лактобактерий фотоколориметрическим способом.
Одним из важных критериев при оценке перспективности использования штаммов микроорганизмов для создания на их основе нового пробиотика является способность бактерий подавлять рост и размножение условно патогенных энтеробактерий. Тест-штаммы энтеропатогенных бактерий были выделены из кишечного содержимого молочных поросят, отстающих в росте, в одном из свиноводческих комплексов Кировской области; были изучены биологические свойства изолятов, проведена их идентификация по комплексу культурально-морфологических, тинктори-альных и биохимических характеристик.
Анализ данных антагонистической активности, представленных в таблице 6, свидетельствуют о том, что все исследуемые штаммы лактобацилл обладают выраженной антагонистической активностью в отношении условно патогенных видов энтеробак-терий. Наиболее значимые показатели были получены в отношении L. paracasei 13.
Как свидетельствуют данные по изучению уровня кислотообразования, представленные в таблице 7, наибольшей величиной предельного кислотообразования обладали бактерии штамма L. salivarius 40, наименьшей - лактобациллы контрольного штамма.
Все остальные штаммы обладали высоким уровнем кислотообразующей активности.
Заключение
Из кишечника здоровых молочных поросят выделено пять культур лактоба-цилл, которые были идентифицированы как L. paracasei 13, L. salivarius 40, L. salivarius 41, L. salivarius 44, L. reuteri 48. Полученные штаммы обладают высоким уровнем кислотообразования, на 20 - 45% превышающим уровень кислотообразования референс-штамма L. plantarum. По уровню антагонистической активности в отношении разных видов энтеробактерий выделенные штаммы превосходят контрольный на 5 - 40%, а по показателям адгезивной активности - на 150-500%. Полученные данные позволяют рекомендовать исследованные го-мопробиотические штаммы лактобацилл для создания новых эффективных ветеринарных биопрепаратов для лечения и профилактики дисбактериозов у поросят.
Список литературы
1. Брилис, В. И. Методика изучения адгезивного процесса микроорганизмов [Текст] / В. И. Брилис, Т. А. Брилис, Х. П. Ленцнер, А. А. Ленцнер // Лабораторное дело. - 1986. - № 4. - С. 210-212.
2. Иванов, В. П. Совершенствование методов диагностики дисбактериоза толстого кишечника: информационное письмо [Текст] / В. П. Иванов,
A. Г. Бойцов, А. Д. Коваленко и др. - СПб. : Центр Госсанэпиднадзора, 2002. - С. 31.
3. Оборин, В. А. Бактериофиксирующая активность эритроцитов в отношении вакцинных штаммов возбудителей чумы, сибирской язвы, туляремии, бруцеллеза и обоснование ее роли в патогенезе данных заболеваний [Текст] : дис. ... д-ра мед. наук: 14.03.03 /
B. А. Оборин. - Саратов, 2011. - 261 с. : ил.
4. Чичерин, И. Ю. Микроорганизмы пробиотиков и индигенной микрофлоры человека и животных. Характер взаимодействия при совместном культивировании на плотной питательной среде [Текст] / И. Ю. Чичерин, И. П. Погорельский, И. А. Лундов-ских, Е. А. Бессолицына, И. В. Дармов, М. Р. Шабали-на // Кишечная микрофлора. - 2013. - № 2. - С. 54-60.
5. Шейко, И. П. Свиноводство / И. П. Шейко [Текст]. - Мн. : Новое знание, 2005. - 384 с. : ил.
6. Lactobacillus Brevis strain [Текст] : пат. № 60397654 США, № 2004/01266871; заявл. 22.07.2003 опубл. 08.04.2008. - 10 с.
