CC BY
93
12. Kikuchi K., Onishi A., Kashiwazaki N., Iwamoto M., Noguchi J., Kaneko H., Akita T., Nagai T. Successful piglet productionafter transfer of blastocysts produced by a modified in vitro system //Biol.Reprod. - 2002. - V. 66. - P. 1033-1041.
13. Yoshioka K., Suzuki C., Onishi A. Defined system for in vitro production of porcine embryos using a single basic medium // J.Reprod. Dev. - 2008. - V. 54, № 3. - P. 208-213.
14. Karja N.W., Wongsrikeao P., Murakami M., Agung B., Fahrudin M., Nagai T., Otoi T. Effect of oxygen tension on the development and quality of porcine in vitro fertilized embryos // Theriogenology. - 2004. - V. 62. - P. 1585-1595.
15. Machaty Z., Day B.N., Prather R.S. Development of early porcine embryos in vitro and in vivo // Biol Reprod. - 1998. -V. 59. - P. 451-455.
16. Ock S.A., Kim J.G., Shi L.Y., Jin H.F., Mohana Kumar B., Choe S.Y., Rho G.J. Comparison of development and quality of porcine embryos cultured in different oxygen concentrations// Reprod Fertil Dev. - 2005. - 17. P. 223.
17. Сингина Г.Н., Лопухов А.В, Зиновьева Н.А. Влияние условий искусственной активации на развитие эмбрионов свиней in vitro //Достижения науки и техники АПК. - 2011. - № 10. - С. 53-54.
EFFECTS OF CULTURE CONDITIONS ON PIG EMBRYO DEVELOPMENT IN VITRO
G.N. Singina, S.G. Ermakova, A.V. Lopukhov, N.A. Zinoieva, L.V. Getmantseva
Summary. The technology of oocyte extracorporal maturation and pig embryo culture is widely claimed in the field of research of early development mechanisms as well as in works on embryo transplantation, cloning and producing of transgenic animals. However, optimal conditions for generation of these cells are not fully determined. In the present work, effects of oxygen concentrations in the gas atmosphere and of multiplicity of the culture medium replacement on the pig embryo development in vitro were investigated. For this aim, matured and artificially activated oocytes were incubated using the gas atmosphere with a high (5% СО2 and 20 % О2) and low (5% СО2 and 5 % О2) oxygen concentration. The embryo medium replacement was conducted once (on the third day of culture) or doubly (on the second and fourth days) in both cases. The greatest yield of blastocysts (25.4 %) was observed in the case of incubation of artificially activated oocytes in the presence of 5 % СО2 and 20 % О2 under the condition of double replacement of the culture medium. At the same time culture of pig partenogenic embryos in the gas atmosphere containing a lower concentration of oxygen was less efficient (21.3 % of blastocysts). The single replacement of the embryo medium exerted a negative influence on the oocyte development to the blastocyst stage. Meanwhile, the negative effect was more expressed in the group incubated in the presence of
5 % СО2 and 20 % О2, in which the proportion of blastocysts decreased by 12.7 % (p < 0.001). Thus, the gas atmosphere with the high content of oxygen is more favorable for in vitro culture of pig partenogenic embryos under the condition of double replacement of the embryo medium.
Key words: pig embryos, in vitro culture, oxygen.
УДК 636.92
БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ КРОЛИКОВ, ТРАНСГЕННЫХ ПО ГЕНАМ КЛАСТЕРА ГИСТОСОВМЕСТИМОСТИ RCA*
Н.А. ВОЛКОВА, доктор биологических наук, зав. лабораторией
Н.А.ЗИНОВЬЕВА, академик РАСХН, директор
А.В. ДОЦЕВ, кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник
Л.А. ВОЛКОВА, кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник,
ВИЖ Россельхозакадемии Е.А. РУСАКОВА, аспирант,
Оренбургский ГУ Л.К. ЭРНСТ], академик РАСХН Г. БРЕМ, доктор ветеринарных наук, академик РАСХН (иностранный член)
Ветеринарно-медицинский университет E-mail: natavolkova@inbox.ru
Резюме. При ксенотрансплантации наиболее перспективным для подавления реакции комплемента представляется получение трансгенных животных с интеграцией и экспрессией в органах и тканях одновременно нескольких генов - ингибиторов. Исследования проводили с целью изучения характера экспрессии экзогенных генов у трансгенных животных этого типа. Объект исследований - кролики, трансгенные по генам кластера комплекса гистосовметимости RCA. Инкубация клеток, выделенных
из различных органов и тканей трансгенных кроликов, с сывороткой человека показала устойчивость таких клеток-мишеней к лизису, по сравнению с контролем. Цитотоксическое действие сыворотки человека было установлено только в отношении клеток сердца: лизис клеток наблюдали в 2 из 14 проведенных опытов. Устойчивость клеток трансгенного происхождения к сыворотке крови человека была установлена также в экспериментах in vitro на первичных культурах клеток сердца, почек, кишечника, щитовидной и поджелудочной желез. При использовании сыворотки человека в концентрации 10 % цитотоксическое действие на клетки трансгенного происхождения не проявлялось, в то время как при культивировании клетокв среде, содержащей 50% сыворотки человека, часть из них погибало. При этом культуры клеток, полученные от трансгенных кроликов, были более устойчивы клизису: количество клеток в культурах трансгенного происхождения оказалось на 16...21,8 % выше, чем в контроле, что свидетельствует
об их повышенной устойчивости к цитотоксическому действию сыворотки крови человека.
Ключевые слова: ксенотрансплантация, трансгенез, кролики, экспрессия трансгена.
Ксенотрансплантацию рассматривают как одно из альтернативных решений проблемы нехватки внутренних органов для больных, нуждающихся в пересадке донорских органов и тканей. В качестве перспективных для трансплантологии рассматриваются гены, контролирующие
* Работа выполнена при финансовой поддержке Минобрнауки РФ, шифр проекта 2012-1.4-12-000-2021-009. В проведении исследований было использовано оборудование ЦКП «Биоресурсы и биоинженерия сельскохозяйственных животных» ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии.
Таблица 1. Цитотоксическое и агглютинирующее действие иммуноглобу линов сыворотки крови человека на лимфоциты кролика
Наименование № опыта Лиме Ъоциты кролика
гомозигота гетерозигота Є I § роль
цито- лиз* аг- глюти- нация цито- лиз аг- глюти- нация цито- лиз аг- гллю- тина- ция
Пул сывороток человека- 1 0 4 0 4 0 4
ка без HLA-антител, инак- 2 0 4 0 4 0 4
тивированных при 560С, 3 0 4 0 4 0 4
30 мин.
Сыворотка человека, 4 2 4 3 4 2 4
АВ (IV) (потенциальные 5 1 4 4 4 2 4
реципиенты почки, п=10) 6 3 4 4 4 4 4
7 3 4 4 4 4 4
8 2 4 4 4 3 4
9 2 4 4 4 3 4
10 4 4 4 4 4 4
11 1 4 2 4 1 4
12 4 4 4 4 4 4
13 4 4 4 4 2 4
*цитолиз: 0 - отсутствие, 1 - 1...20 %, 2 - 21...50 %, 3 - 51...80 %, 4 - 81...100 % лизи-рованных клеток; агглютинация: 4 - отсутствие единичных неагглютинированных клеток в поле зрения.
комплемент-активирующую систему, так как именно она вызывает, после реакции антител, необратимые изменения и уничтожение эндотелиальных клеток. Наиболее важные компоненты комплемент-активирующего каскада - мембранные кофакторные протеины (MCP, CD46), протектин (CD59) и фактор, усиливающий распад (DAF, CD55). При этом наиболее перспективным для подавления реакции комплемента представляется получение трансгенных животных с интеграцией и экспрессией в органах и тканях одновременно нескольких генов-ингибиторов. Однако стандартные плазмидные, космидные или фаговые векторы в большинстве случаев невозможно использовать для этой цели вследствие их ограниченной емкости. Как альтернативу можно рассматривать так называемые искусственные хромосомы, обладающие повышенной клонирующей способностью. Наиболее широкое применение для получения трансгенных животных нашли векторные системы на основе искусственных хромосом дрожжей -YAC [1.. .4], способные к стабильному сохранению геномных фрагментов ДНК длиной более 1 млн п.о. [5].
Цель нашей работы - изучение характера экспрессии экзогенных генов у трансгенных кроликов с интегрированными генами MCP и DAF.
Условия, материалы и методы. Объектом исследований служили кролики, трансгенные по генам кластера RCA. Работу проводили с использованием гомо- и гетерозиготных особей.
В качестве косвенного метода оценки экспрессии трансгена определяли устойчивость клеток ряда органов и тканей кроликов к лизису сывороткой крови человека, обусловленную экспрессией генов-ингибиторов комплемента крови человека.
Цитотоксическое действие сыворотки крови чело-
века на клетки органов трансгенных животных изучали in vitro на лимфоцитах и первичных культурах сердца, почек, кишечника, щитовидной и поджелудочной желез.
Кроме того, культуры клеток этих органов инкубировали в средах с присутствием сыворотки крови человека в концентрации 10 и 50 %.
Для оценки влияния трансгенеза проводили гистологические исследования органов, с которыми связывают активность RCA (печень, почки, селезенка и сердце), как в организме хозяина, так и в случае его трансгенной природы.
Отбор образцов тканей выполняли при убое животных. Образцы фиксировали в 10 %-ном растворе формалина в течение 24 ч., осуществляли их проводку через спирты возрастающей концентрации и заливали в парафин по общепринятой методике [6]. Гистологические срезы толщиной 4...5 мкм готовили на ротационном микротоме. Окрашивали гематоксилин-эозином.
Микроскопию гистологических препаратов проводили с помощью микроскопа «Nikon» (объектив х40, окуляры х10, х16) с использованием компьютерной программы Image Scope.
Показатели, полученные в результате исследований, обрабатывали биометрическими методами для малых выборок [7].
Результаты и обсуждение. Инкубация лимфоцитов периферической крови трансгенных кроликов с сывороткой человека в присутствии аллогенного (человеческого) и ксеногенного (кроличьего) комплемента показала, что сыворотка человека в обоих случаях полностью агглютинировала лимфоциты кролика. При Таблица 2. Цитотоксическое действие иммуноглобулинов сыворотки крови человека в присутствии комплемента человека на культивируемые клетки тканей трансгенного и нетрансгенного происхождения*
К ультура клеток
№ опыта сердце почка кишечник
Наименование транс- генные не- транс- генные транс- генные не- транс- генные транс- ген- ные не- транс- генные
Сыворотка человека 1 0 0 0 0 0 3
без HLA-антител, инак- 2 0 0 0 0 0 4
тивированных при 560С, 30 мин 3 0 0 0 3 0 1
Сыворотка человека, 4 1 1 0 3 0 1
АВ (IV) (потенциаль- 5 3 4 0 0 0 0
ные реципиенты почки, 6 0 1 0 0 0 0
п=14) 7 0 0 0 0 0 0
8 0 0 0 0 0 0
9 0 1 0 0 0 0
10 0 0 0 0 0 0
11 0 0 0 0 0 0
12 0 4 0 0 0 0
13 0 1 0 0 0 0
14 0 4 0 0 0 0
15 0 4 0 0 0 4
16 0 4 0 0 0 0
17 0 4 0 0 0 0
* 0 - отсутствие цитолиза, 1 рованных клеток.
1...20 %, 2 - 21...50 %, 3 - 51...80 %, 4 - 81...100 % лизи-
этом их лизис различался по силе проявления. У гетерозиготных животных, по сравнению с гомозиготами, он был более выраженным (табл. 1).
Вместе с тем, сильно выраженного лизирующего действия иммуноглобулинов сыворотки крови человека на культивируемые клетки трансгенного происхождения в присутствии аллогенного (человеческого) комплемента не выявлено. Ее цитотоксическое действие было установлено только в отношении клеток сердца. В этом случае лизис наблюдали в 2 из 14 проведенных опытов (табл. 2).
Цитотоксическое действие сыворотки крови кролика установлено только в отношении трансгенных клеток сердца. Во всех 6 проведенных опытах наблюдался лизис клеток от 1...20 до 81...100 %.
Через 2 ч. культивирования клеток разных органов трансгенных и контрольных животных в среде, содержащей 10 % сыворотки человека, заметных цитотоксиче-ских изменений не наблюдалось. При этом несколько изменился рисунок монослоя: нарушились межклеточные контакты и округлились отдельные клетки, появились «окна», а в среде наблюдались «плавающие» и подвергшиеся лизису клетки. Наиболее значительные различия между культурами разного происхождения наблюдались на 6 сут. культивирования. Монослой трансгенной культуры имел вид сети, сформированной группами клеток, поверх этих тяжей и в промежутках между ними располагались делящиеся и распластывающиеся клетки. В контрольной культуре наблюдались только тяжи из клеток и клональное размножение на их поверхности отдельных клеток, которые впоследствие дегенерировали.
При культивировании клеток в среде, содержащей 50 % сыворотки человека, наблюдалось более губительное цитотоксическое действие. Наряду с упомянутыми изменениями монослоя, клетки, полученные от нетрас-генных животных, уже через 2 ч. после добавления сыворотки темнели из-за уплотнения цитоплазмы и органелл, однако у части клеток видимые изменения отсутствовали и они оставались прикрепленными к пластику. При этом клетки практически не размножались. Различия в зависимости от трансгенности культуры более четко проявлялись через несколько суток культивирования. Клетки уменьшались в размерах, вытягивались и темнели. Часть живых клеток откреплялась от субстрата и в таком состоянии продолжала находиться в течение всего эксперимента. Трансгенные культуры оказались более устойчивыми к воздействию человеческой сыворотки. На 3.4 сут. культивирования наблюдалось повышение про-
лиферации клеток. В частности, число клеток в культурах поджелудочной и щитовидной желез трансгенного происхождения было выше, чем в контроле, соответственно на 21,8 и 16 %. Это, на наш взгляд, свидетельствует о более высокой адаптационной способности клеток, полученных от трансгенных животных, к цитотоксическому действию сыворотки крови человека.
Сравнительный анализ гистоструктуры печени, почек, селезенки и сердца трансгенных кроликов и их аналогов не выявил каких-либо значительных изменений в общей архитектонике этих органов.
Анализ их морфометрических показателей также не выявил существенных различий между экспериментальными группами (табл. 3), что свидетельствует об отсутствии патологического действия трансгена на гистоструктуру внутренних органов.
Таблица 3. Морфометрические показатели внутренних органов трансгенных и контрольных кроликов, М±т
Группа
Показатель транс- нетранс-
генные генные
Печень
Толщина балок, и 14,1±0,1 14,7±0,1
Площадь ядра клеток, и2 41,3±0,6 40,9±0,7
Площадь цитоплазмы, и2 232±11 235±10
Ядерно-цитоплазматическое от-
ношение 0,19 0,18
Селезенка
Диаметр лимфатических узел-
ков, и 334±22 320±25
Число узелков на 10 см2 среза, п 1,2±0,01 1,3±0,01
Почки
Диаметр почечных клубочков, и 75±4 73±2
Число клубочков на 10 см2 среза,
п 1,7±0,03 1,8±0,02
Сердце
Площадь поперечного сечения
миоцитов, и2 181±20 188±99
Выводы. Эксперименты в условиях in vitro показали повышенную устойчивость лимфоцитов крови и культур клеток сердца, почек, кишечника, щитовидной и поджелудочной желез трансгенных кроликов к ци-тотоксическому действию сыворотки крови человека, что свидетельствует об экспрессии интегрированных генов в организме трансгенных кроликов. При этом не установлено негативного действия экспрессии трансгена на гистоструктуру внутренних органов.
Литература.
1. Fujivara Y., Takahashi R.I., Miwa M. et al. Analysis of control elements for position-independent expression of human alpha-lactalbumin YAC// Mol. Reprod. - 1999. - Dev 54. - P.17-23.
2. Brem G., Besenfelder U., Aigner B. et al. YAC transgenesis in farm animals: rescue of albinism in rabbits // Mol. Reprod. -1996. - Dev. 44. - P.56-62.
3. Roue D., Duverger N., Lin S.D. et al. Apolipoprotein(a) yeast artificial chromosome transgenic rabbits. Lipoprotein(a) assembly with human and rabbit apolipoprotein B // J. Biol. Chem. - 1998. - V.273. - P.1247-1251.
4. Yannoutsos N, Langford GA, Cozzi E et al. Production of pigs transgenic for human regulators of complement activation // Transplant. Proc. - 1995. - V.27. - P.324-325.
5. Burke D.T., Carle G.F., Olson M.V. Cloning of large segments of exogenous DANN into yeast by means of artificial chromosome vectors // Science. - 1987. - V. 236. - P.806-812.
6. Ромейс, Б. Микроскопическая техника. Пер. с нем. В.Я. Александрова, З.И. Кроковой. - М.: Изд.-во иностр. лит.-ры, 1953. - 718с.
7. Меркурьева Е. К. Биометрия в селекции и генетике с.- х. животных. - М.: Колос, 1970. - 424 с.
BIOLOGICAL CHARACTERISTICS OF TRANSGENIC RABBITS WITH RCA GENE CLUSTER N.A. Volkova, N.A. Zinovieva, A.V. Dotsev, L.A. Volkova, E.A. Rusakova, |L.K. Ernst] , G. Brem
Summary. Transgenic animals with the integration and expression of several genes - inhibitors in their organs and tissues appear to be the most advanced method in xenotransplantation for suppressing the complement system. In this regard the study of the exogenous genes expression nature in transgenic animals of this type has been carried out. Transgenic rabbits with the RCA gene cluster were our test objects. Transgene expression was evaluated by cell resistance of several organs and tissues of transgenic rabbits to the lysis of human serum. Incubation of cells from different organs and tissues from transgenic rabbits with human serum showed the stability of these target cells to the lysis compared to
the control. Cytotoxic effect of human serum was found only for the cells of the heart: cell lysis was observed in 2 of 14 experiments. Transgenic cells’ resistance to the human serum was established in vitro in primary cell cultures of the heart, kidney, intestine, thyroid and pancreas. The human serum at the concentration of 10% have not affected transgenic cells, while the concentration of 50% killed a part of transgenic cells during cultivation. Cell cultures derived from transgenic rabbits were more resistant to lysis: the number of cells in cultures of transgenic origin was 16-21.8% higher compared to the control, indicating the increased stability of the transgenic cells to the cytotoxic effects of human serum. Key words: xenotransplantation, transgenesis, rabbits, transgene expression.
УДК 636.2.082.2
К МЕТОДИКЕ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ СЕЛЕКЦИОННОГЕНЕТИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ПЕРСИСТЕНТНОСТИ
ЛАКТАЦИИ КОРОВ
A.А. СЕРМЯГИН, кандидат сельскохозяйственных наук, старший научный сотрудник
B.И. СЕЛЬЦОВ, кандидат сельскохозяйственных наук, зав. лабораторией
ВИЖ Россельхозакадемии
E-mail: alex_sermyagin85@mail.ru
Резюме. Исследования проведены с целью определения взаимосвязи между показателем персистентности лактации и признаками, характеризующими молочную продуктивность и воспроизводительные качества коров симментальской породы. Для поиска наилучшего способа оценки персистентности удоя изучены семь вариантов известных формул с различной структурой расчёта показателя персистентности. В анализе использовали данные 7214 контрольных доек 762 первотёлок, являющихся дочерями 24 быков-производителей. Учтены такие показатели удоя как месячный, максимальный суточный, за 100, 200и305дн. первой лактации, время наступления пика лактации, сервис- и межотельный периоды. Наследуемость контрольных суточных удоев по месяцам лактации составляла 0,094. ..0,283. У персистентности удоя по показателям PSD200, PSD305 и PYV305 коэффициент наследуемости был выше (h2=0,092.0,1334), чему продолжительности сервис- и межотельного периодов, но ниже признака молочной продуктивности. Величина падения суточных удоев после достижения пика лактации в зависимости отпоказа-теля персистентности свидетельствовала о целесообразности оценки лактационной кривой по индексам PSD305 и PW305. Коэффициенты полноценности и постоянства лактации, рассчитанные по индексам P3.t, PTo mx200 и PTo max305 имели меньшее селекционное значение: из-за невысокой генетической изменчивости. Наилучшим сочетанием продуктивных и воспроизводительных качеств обладали животные, оцененные по таким показателям
персистентности удоя как PSD200, PSD305 и PrV305'
Ключевые слова: лактация, персистентность, наследуемость, удой, корова.
Персистентность - важный показатель, характеризующий лактационную деятельность коров, величина которого указывает на способность животного как можно дольше поддерживать молочную продуктивность на высоком уровне после достижения пика лактации [1]. В европейских странах этот признак включен в селекционный индекс племенной ценности крупного рогатого скота, куда также входят показатели здоровья и воспроизводства.
В работах зарубежных исследователей изучению генетической составляющей персистентности лактации придается особенное значение. Посредством нивелирования паратипических факторов (стадо, год и сезон отела, день контроля и др.) представляется возможным принимать более точные решения по использованию показателя перси-
стентности в стратегиях селекции молочного скота. Расчет племенной ценности быков-производителей по показателю персистентности дочерей повышает эффективность оценки и генетический тренд по этому признаку [2, 3].
Исследования, проведенные рядом авторов, указывают на невысокий коэффициент наследуемости персистентности лактации: И2=0,07...0,18 [4, 5]. Однако, по сравнению с воспроизводительными качествами и частотой заболеваний, наследование этого показателя выше, что позволяет с большей эффективностью использовать его в селекции скота.
С экономической точки зрения персистентность удоя, по мнению [6], имеет важное значение в управлении лактационной деятельностью коров. Автор указывает, что взаимосвязь между этим признаком и удоем за 305 дн. лактации должна быть невысокой, так как значительная положительная зависимость отрицательно влияет на расход кормов (рентабельность) и признаки здоровья, в том числе воспроизводства.
Таким образом, использование в селекции молочного скота показателя персистентности лактации имеет определенные перспективы в плане улучшения функциональных признаков животных при условии оптимизации параметров воспроизводства и молочной продуктивности. Поиск и изучение новых методов расчета показателя персистентности должны быть направлены на повышение результативности отбора по основным признакам лактационной деятельности молочного скота.
Цель наших исследований - усовершенствовать оценку лактационной деятельности коров с учётом показателей персистентности, молочной продуктивности и воспроизводительных качеств животных.
Условия, материалы и методы. Исследования проводили по базе данных суточных контрольных доек коров симментальской породы стада племенного завода Орловской области. Она включала показатели продуктивности и воспроизводства по 762 коровам-первотёлкам 2000-2007 гг. рождения - дочерей 24 быков-производителей. Число контрольных доек по всем животным составляло 7214 записей.
В целях поиска объективных результатов, отражающих взаимосвязи персистентности с хозяйственнополезными признаками и отвечающих задачам селекции молочного скота, мы использовали ряд формул.
Первая из них предложена J. Бо1кпег и Ш. РивИв [7] в модификации N. Оепд1ег и др. и по структуре расчета
