CC BY
27
УДК 636.5:591.463.1
РЕЗУЛЬТАТИВНОСТЬ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ТРАНСФОРМАЦИИ КЛЕТОК ГОНАД КУР N Г1ГО В ЗАВИСИМОСТИ ОТ СТАДИИ ВВЕДЕНИЯ ЛЕНТИВИРУСНЫХ ВЕКТОРОВ
Л.А. ВОЛКОВА, кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник (e-mail: [email protected]) Э.Р. МЕННИБАЕВА, младший научный сотрудник Е.К. ТОМГОРОВА, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник
А.Н. ВЕТОХ, младший научный сотрудник Н.А. ВОЛКОВА, доктор биологических наук, руководитель лаборатории
Н.А. ЗИНОВЬЕВА, доктор биологических наук, директор
Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства им. академика Л.К. Эрнста, пос. Дубровицы, 60, Подольский р-н, Московская обл., 142132, Российская Федерация
Резюме. Генетическая модификация сельскохозяйственной птицы с использованием лентивирусных векторов - один из результативных методов получения трансгенных особей с заданными свойствами. Ввиду физиологических особенностей птицы введение генных конструкций в клетки-мишени возможно только на стадии многоклеточного эмбриона, что обусловливает получение трансгенных особей-мозаиков. Цель исследований - определение оптимального периода введения лентивирусных векторов для трансформации клеток гонад кур in vivo. Работу проводили на базе вивария ВИЖ им. Л.К. Эрнста в 2016 г. Трансгенная птица была получена на основе кросса Шейвер Браун (n=40) с использованием лентивирусного вектора pWCAG, содержащего репортерный ген eGFP (зелёный флюоресцирующий белок), под контролем конститутивного промотора CAG. Вирусный препарат вводили в эмбрионы кур на 24 и 60 ч инкубации. Наличие экспрессии eGFP в органах и тканях трансгенных особей в зависимости от метода введения генной конструкции определяли методами иммуногистохимии и флуоресцентной микроскопии. Высокий процент трансформации органов наблюдали при введении лентивирусного вектора в эмбрионы кур на 24 ч инкубации - 51,2±6,3 %, что на 6-8 % выше величины аналогичного показателя при введении вирусного препарата на 60 ч инкубации. Вместе с тем, процент трансформации репродуктивных органов был в 1,9 раз выше при введении лентивирусного вектора в дорсальную аорту на 60 ч инкубации, что, возможно, связано с миграцией в этот возрастной период из крови в гонады примордиальных зародышевых клеток, служащих предшественниками половых клеток. Оптимальный срок введения лентивирусных векторов в эмбрионы кур in vivo с целью получения трансгенного потомства - 60 ч инкубации эмбрионов.
Ключевые слова: трансгенез, куры, лентивирусные вектора, экспрессия, рекомбинантные белки.
Для цитирования: Результативность генетической трансформации клеток гонад кур in vivo в зависимости от стадии введения лентивирусных векторов / Л.А. Волкова, Э.Р. Меннибаева, Е.К. Томгорова, А.Н. Ветох, Н.А. Волкова, Н.А. Зиновьева //Достижения науки и техники АПК. 2016. Т. 30. №11. С. 107-109.
Генетическая модификация с использованием лентивирусных векторов - один из результативных методов получения трансгенной сельскохозяйственной птицы с заданными свойствами. Векторные системы на основе лентивирусов представляют собой эффективный инструмент для введения и экспрессии генов в эмбриональных и соматических клетках животных и птицы. Они обладают рядом преимуществ, по сравнению с использованием других систем доставки генов: стабильная интеграция в геном клетки-хозяина; относительно небольшие размеры генома, что позволяет проводить манипуляции in vitro; способность к инфици-
рованию гибридными вирионами практически любого вида и типа клеток позвоночных [1, 2]. Учитывая особенности воспроизводства сельскохозяйственной птицы, в частности, развитие эмбрионов вне организма самки, использование таких систем доставки для трансгенеза представляется более предпочтительным, чем применение других методов введения рекомбинантной ДНК, в том числе в виде микроинъекций.
На сегодняшний день достигнуты значительные успехи в области трансгенеза сельскохозяйственной птицы [3]. С использованием различных методических подходов получены трансгенные куры с интегрированными бактериальными генами LacZ, GFP, р-лактамазы, а также генами человека - а2Ь-интерферона, р-интерферона, гранулоцитарного колониестимулирующего фактора, гормона роста и ряда других [4-11].
Вместе с тем, из-за физиологических особенностей птицы введение генных конструкций в клетки-мишени возможно только на стадии многоклеточного эмбриона, так как в снесенном яйце он состоит из более чем 60000 клеток, что обусловливает получение трансгенных особей-мозаиков. В этой связи представляет интерес изучение результативности трансформации отдельных органов и тканей, в частности, репродуктивных органов для оценки возможности получения трансгенного потомства.
Цель наших исследований - изучение результативности трансформации клеток органов и тканей трансгенных кур в зависимости от стадии введения лентивирусных векторов в эмбрионы кур in vivo.
Условия, материалы и методы. Работу проводили на базе вивария ВИЖ им. Л.К. Эрнста в 2016 г. Объектом исследований служили трансгенные куры, полученные на основе кросса Шейвер Браун с использованием летивирусного вектора pWCAG, содержащего репортерный ген eGFP зелёного флюоресцирующего белка под конститутивным промотором CAG. В качестве источника рекомбинантной ДНК использовали вирусный препарат, который вводили в эмбрионы кур через окно, вырезанное в скорлупе: непосредственно в эмбрион на 24 ч инкубации (n=20) или в дорсальную аорту эмбрионов на 60 ч инкубации (n=20). После этого окно заклеивали парафином. Экспрессию рекомби-нантного белка в органах и тканях трансгенных кур изучали методом иммуногистохимии и флуоресцентной микроскопии. При проведении иммуногистохимии для выявления специфического трансгенного продукта в клетках органов и тканей птицы использовали первые
Таблица. Топография генетической трансформации кур в зависимости от метода введения генной конструкции в эмбрион
Группа Число особей, n Доля трансформированных органов, %
наибольшая наименьшая в среднем по группе, M±m
на 24 ч инкубации
Самки 10 22 89 51,2±6,3
Самцы 10 25 88 51,1±6,0
на 60 ч инкубации
Самки 10 20 70 43,3±5,4
Самцы 10 10 70 45,0±6,2
Рис. 1. Экспрессия рекомбинантного белка в органах и тканях трансгенных кур (флуоресцентная микроскопия) при введении вирусного препарата на 60-й час инкубации: 1 - печень, 2 - сердце, 3 - селезенка, 4 - мышечная ткань, 5 - кишечник, 6 - желудок, 7 - яйцевод, 8 -семенник; увеличение х400 (2, 4, 5, 6, 8), х160 (1, 3, 7).
антитела, специфичные к выявляемому антигену. Флуоресцентную микроскопию на наличие специфического зелёного свечения, которое даёт eGFP, выполняли на криостатных срезах с использованием микроскопа Nikon Eclipse Ni-U (Япония).
Статистическую обработку результатов проводили с использованием программы MS Excel.
Результаты и обсуждение. При введении вирусного препарата в эмбрионы кур на 24 ч инкубации эффективность трансформации клеток органов и тканей полученных трансгенных особей варьировала от 22 до 89 % и составила в среднем по группе 51,2±6,3 % (см. табл.), что было на 6-8 % выше, чем при введении генной конструкции на 60 ч инкубации. Следуетот-метить, что лимиты величин этого показателя в обеих группах были практически одинаковыми. Достоверных различий в эффективности трансформации органов у трансгенных особей разного пола (самки, самцы) не установлено.
Экспрессию репортер-ного белка выявили во всех исследуемых органах. При этом результаты иммуноги-стохимии и флуоресцентной микроскопии совпадали. У большинства трансгенных особей было установлено наличие eGFP в клетках печени, сердца, кишечника, селезенки, мышечной ткани, яйцевода, а также в репродуктивных органах (рис. 1).
Наибольшая трансформация клеток органов была достигнута при введении вирусного препарата на 24 ч инкубации эмбрионов - до 70 %. Во втором из изучаемых вариантов величина этого показателя была на 10-20 % ниже. Однако результативность трансформации репродуктивных органов при введении вирусного препарата в эмбрионы в последнем случае была в 1,9 раз выше (рис. 2).
Это можно объяснить тем, что в указанный период эмбриогенеза (60 ч инкубации) примордиальные зародышевые клетки, служащие предшественниками половых клеток, начинают мигрировать из крови в гонады. В связи с чем введение вирусного препарата в дорсальную аорту позволяет целенаправленно воздействовать на примордиальные зародышевые клетки, повышая эффективность трансформации такого типа клеток. Учитывая это, в качестве оптимального срока введения лентивирусных векторов в эмбрионы кур in vivo с целью получения трансгенного
Рис. 2. Эффективность трансформации органов и тканей опытных кур в зависимости от периода введения вирусного препарата (ВП) в эмбрионы кур: ось Х - внутренний орган, ось Y - доля трансформированных клеток, %; ВП - вирусный препарат: о - печень; ill - сердце; = - кишечник, желудок; □ - мышечная ткань; s: - селезенка; □ - яйцевод; ■ - репродуктивные органы.
потомства с трансформированными половыми клетками можно рассматривать 60 ч инкубации эмбрионов.
Вместе с тем, следует отметить более высокую интенсивность окрашивания и свечения рекомбинант-ного белка в клетках трансформированных органов и
тканей трансгенных особей, обусловленных большим процентом трансформированных клеток (участков трансформации) при введении лентивирусного вектора в эмбрионы на 24 ч инкубации. Это может быть предпочтительным в случае получения трансгенных кур-биореакторов, продуцирующих рекомбинантные белки в клетках яйцевода.
Выводы. Наибольший процент трансформации органов наблюдали при введении лентивирусного вектора в эмбрионы кур на 24 ч инкубации - 51,2±6,3 %, что на 6-8 % выше, чем в варианте с его введением на 60 ч инкубации. В первом случае отмечены высокая интенсивность окрашивания и свечения рекомбинантного белка в клетках трансформированных органов и тканей трансгенных особей. Однако процент трансформации репродуктивных органов был выше при введении лентивирусного вектора в дорсальную аорту на 60 ч инкубации. Экспрессия рекомбинантного белка eGFP была выявлена во всех исследованных органах. В связи с этим, 60 ч инкубации - оптимальный период введения лентивирусных векторов в эмбрионы кур in vivo с целью получения более высокой результативности генетической трансформации клеток гонад.
Литература.
1. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector/ L. Naldini, U. Blomer, P. Gallay, D. Ory, R. Mulligan // Science. 1996. V. 272. Pp.263-267.
2. Production and purification of lentiviral vectors / G.Tiscornia, O. Singer, I.M. Verma // Nat Protoc. 2006. V. 1(1). Pp.241-245.
3. Applications of avian transgenesis / B.B. Scott, T.A. Velho, S. Sim, C. Lois // ILAR J. 2010. V. 51 (4). Pp.353-361.
4. Трансгенные сельскохозяйственные животные: современное состояние исследований и перспективы / Н.А. Зиновьева, Н.А. Волкова, В.А. Багиров, Г. Брем// Экологическая генетика. 2015. Т. 13. № 2. С. 58-76.
5. Chicken oviduct-specific expression of transgene by a hybrid ovalbumin enhancer and the Tet expression system / D. Kodama, D. Nishimiya, K. Nishijima, Y. Okino, Y. Inayoshi, Y. Kojima, K.-I. Ono, M. Motono, K. Miyake, Y. Kawabe etal.//JBiosciBioeng. 2012. V. 113 (2). Pp. 146-153.
6. Development of transgenic chickens expressing bacterial betagalactosidase / P.E. Mozdziak, S. Borwornpinyo, D.W. McCoy, J.N. Petitte//Dev. Dyn. V. 2003. V. 226. Pp. 439-445.
7. Oviduct-specific expression of two therapeutic proteins in transgenic hens / S.G. Lillico, M.J. Sherman, C.D. McGrew, C.D. Robertson, J. Smith, C. Haslam, P. Barnard, P.A. Radcliffe, K.A. Mitrophanous, E.A. Elliot et al. // PNAS. 2007. V. 104 (6). Pp. 1771-1776.
8. Production of biofunctional recombinant human interleukin 1 receptor antagonist (rhIL1RN) from transgenic quail egg white / S.C. Kwon, J.W. Choi, H.J. Jang, S.S. Shin, S.K. Lee, T.S. Park, I.Y. Choi, G.S. Lee, G. Song, J.Y. Han // Biology of Reproduction. 2010. V. 82. Pp. 1057-1064.
9. Oviduct-specific enhanced green fluorescent protein expression in transgenic chickens / S.J. Byun, S.W. Kim, K.W. Kim, J.S. Kim, I.-S. Hwang, H.K. Chung, I.S. Kan, I.-S. Jeon, W.-K. Chang, S.-B. Park, J.G. Yoo//Biosci. Biotechnol. Biochem. 2011. V. 75 (4). Pp. 646-649.
10. Ubiquitous GFP expression in transgenic chickens using a lentivira vector/ S.C. Chapman, A. Lawson, W.C. Macarthur, R.J. Wiese, R.H. Loechel, M. Burgos-Trinidad, J.K. Wakefield, R. Ramabhadran, T.J. Mauch, G.C. Schoenwolf //Development. 2005. V. 132. Pp. 935-940.
11. Scott B.B., Lois C. Generation of tissue-specific transgenic birds with lentiviral vectors// PNAS. 2005. V. 102(45). Pp.16443-16447.
EFFICIENCY OF IN VIVO GENETIC TRANSFORMATION OF CHICKEN GONADS DEPENDING ON THE
STAGE OF INTRODUCTION OF LENTIVIRAL VECTORS
L.A. Volkova, E.R. Mennibaeva, E.K. Tomgorova, A.N. Vetokh, N.A. Volkova, N.A. Zinovieva
L.K. Ernst All-Russian Research Institute of Animal Husbandry, pos. Dubrovitsy, 60, Podol'skii r-n, Moskovskaya obl., 142132, Russian Federation
Summary. Genetic modification of poultry by using lentiviral vectors is one of the most effective methods for producing transgenic animals with the desired properties. Considering physiological characteristics of birds, gene constructs can be introduced into target cells only at the multicellular embryo stage that causes the production of mosaic transgenic individuals. The aim of our study was to determine the optimal stage for the introduction of lentiviral vectors for transformation of chicken gonads in vivo. Studies were carried out on the basis of vivarium of the L.K. Ernst All-Russian Research Institute of Animal Husbandry in 2016. The transgenic poultry were obtained on the basis of Shaver Brown cross (n = 40) by using lentiviral vector pWCAG that contains the reporter gene eGFP (Green fluorescent protein) under control of a constitutive promoter CAG. The viral preparation was injected into chicken embryos at the 24th and 60th hours of incubation. The expression of eGFP in organs and tissues of transgenic chicken was determined by immunohistochemistry and fluorescence microscopy depending on the method of introducing the gene construct. A high percentage of the transformation of organs was observed with the injection of lentiviral vector into the chicken embryos at the 24th hour of incubation - (51.2 ± 6.3) %, which was on 6-8 % higher comparing to the introduction of the virus preparation at the 60th hour of incubation. However, the percentage of the transformation of reproductive organs was 1.9 times higher at the introduction of lentiviral vector in the dorsal aorta at the 60th hour of incubation. It may be due to the migration of primordial germ cells, which are precursors of germ cells, from blood in gonads at this stage. Thus, the 60th hour of incubation of embryos is the optimal period for introduction of lentiviral vectors into the chicken embryos in vivo to produce transgenic progeny. Keywords: transgenesis, chickens, lentiviral vectors, expression, recombinant proteins.
Author Details: L.A. Volkova, Cand. Sc. (Biol.), leading research fellow (e-mail: [email protected]); E.R. Mennibaeva, junior research fellow; E.K. Tomgorova, Cand. Sc. (Biol.), senior research fellow; A.N. Vetokh, junior research fellow; N.A. Volkova, D. Sc. (Biol.), head of laboratory; N.A. Zinovieva, D. Sc. (Biol.), director.
For citation: Volkova L.A., Mennibaeva E.R., Tomgorova E.K., Vetokh A.N., Volkova N.A., Zinovieva N.A. Efficiency of in Vivo Genetic Transformation of Chicken Gonads Depending on the Stage of Introduction of Lentiviral Vectors. Dostizheniya nauki i tekhniki APK. 2016. V. 30. No.11. Pp. 107-109 (in Russ.)
