CC BY
28
e
Биологическая стоимость устойчивости Helicobacter pylori к рифампицину
К. Т. МОМЫНАЛИЕВ1, В. В. ЧЕЛЫШЕВА, Т. А. АКОПИАН, О. В. СЕЛЕЗНЕВА, В. М. ГОВОРУН
Научно-исследовательский институт физико-химической медицины Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию РФ, Москва
Biological Cost of Helicobacter pylori Rifampicin Resistance
K. T. MOMYNALIEV, V. V. CHELYSHEVA, T. A. AKOPIAN, O. V. SELEZNEVA, V. M. GOVORUN Research Institute of Physico-Chemical Medicine, Moscow
Для определения биологической стоимости устойчивости И.ру1ог1 к рифампицину (РИФ) оценивали частоту возникновения мутантов рифампициноустойчивых (РИФр) клонов микроорганизма при адаптации к офлоксацину и метронвдазолу. Было показано, что мутации в гроВ гене, обеспечивающие устойчивость Н.ру1оп к РИФ, имеют биологическую стоимость, которые, однако, скомпенсированы дополнительными мутациями в геноме микроорганизма. Сравнение частоты возникновения мутантов в присутствии метронидазола показало, что в результате приобретённой устойчивости к РИФ меняются адаптационные возможности РИФр клонов Н.ру1оп к метронвдазолу. Так, для одного из РИФр клонов было показано существенное увеличение частоты мутирования (>700 раз), а также широкий спектр мутаций, обеспечивающих устойчивость к метронидазолу по сравнению с исходным штаммом Н.ру1оп 26695. Описанные явления могут говорить, с одной стороны, о том, что адаптация к РИФ меняет свойства клетки таким образом, что повышает её способность мутировать, с другой — направленная селекция выявляет гипермутабельные клетки в бактериальной популяции, которые, по-видимому, всегда присутствуют в популяции.
Ключевые слова: Helicobacter pylori, устойчивость к рифампицину, направленная селекция, офлоксацин, метронидазол.
The frequence of mutations in the rifampicin resistant (RIFr) clones of microorganisms after adaption to ofloxacin and metronidazole was investigated to estimate the biological cost of H.pylori rifampicin (RIF) resistance. Mutations in rpoB gene responsible for RIF resistance of H.pylori were shown to have biological cost and be compensated by additional mutations in the microorganism genome. Comparison of the mutation frequency in the presence of metroniazole demonstrated that the acquired resistance to RIF resulted in changing of the adaptative capacity of the RIFr clones of H.pylori to metronidazole. Thus, a significant increase of the mutation frequency (> 700 times) in one of the RIFr clones and a broad spectrum of the mutations responsible for resistance to metronidazole vs. the H.pylori initial strain 26695 were observed. The findings could be evident of the fact that the adaptation to RIF changed the properties of the cell on one hand in such a way that its mutation capacity increased and that the target selection on the other hand revealed hypermutable cells, likely usual for the bacterial population.
Key words: Helicobacter pylori, rifampicin resistance, target selection, ofloxacin, metronidazole.
Введение
Давление антибиотиков приводит к включению в бактериальной клетке механизмов, обеспечивающих приобретение ею устойчивости к этим веществам [1, 2]. Существует прямая корреляция между развитием антибиотикорезистентности у бактерий и схемой применения препаратов: их дозировкой, частотой использования, а также спектром используемых антибиотиков [3]. И наоборот, ограничение их использования приводит к снижению устойчивости у бактерий [4]. Устойчивость может приобретаться в результате гори© Коллектив авторов, 2009
Адрес для корреспонденции: 119992 Москва, М. Пироговская, 1а. НИИ физико-химической медицины
зонтального переноса детерминант резистентности, а также возникновения точечных мутаций в генах-мишенях антибиотиков [5, 6]. Как правило, мишенями для действия антибиотиков становятся гены, кодирующие в бактериальной клетке процессы транскрипции и трансляции.
С эволюционной точки зрения существующие в живой природе структуры биологических молекул являются наиболее оптимальными, прошедшими через строгий селективный отбор и функционирующими в клетке с максимальной эффективностью. Вероятно, направленное изменение (мутация) структуры молекулы под действием селективной среды должно привести к снижению эффективности её работы, которая может
е
Таблица 1. Праймеры, использованные для определения нуклеотидной последовательности генов H.pylori
Ген Пpaймеp Нуклеотидная последовательность 5'—3' Длина ПЦР-пpодуктa, п.н.
rpoB (кластер I + II) ipoB1 TTT GAT TCG CTC ATG CCC CAT 330
rpoB2 CAC AAC CTT TTT ATA AGG GGC
rpoB (V149) !poB149f GAT CCC TTT GAT GAC AGA ACGC 530
rpoB149r TCC CTA CCA TAA CAG GCT CAG C
rpoB (R701) !poB2f GCC CCT TAT AAA AAG GTT GTG б40
rpoB701r GCG CAC ATT TTT CCC TAA CG
rdxA ERD-1 GTT AGG GAT TTT ATT GTA TG 427
BRD-3 ACG CCA AGC ATT TGA GCA AA
rdxA ERD-2 AAA GTT AGA GTG ATC CCC TC 351
BRD-4 TAA TTT AGG TTT GAT TAT AG
rdxA EFR-1 TCT CAA GCG GAA AAA TCC GG 445
BFR-3 AAT TTT TGA TGA TTT GAG CG
rdxA EFR-2 ATT ATG ACA CTA ATT CTA GG 388
BFR-4 CTA ACG CCA AGC TTT TTA TG
изменить функционирование всей метаболической группы, участником которой является изменённая молекула. Другими словами, биологическая стоимость резистентности всегда выражается в потенциальном ограничении функциональных возможностей клетки, которая in vitro, например, выражается в замедленном росте резистентного (мутантного) штамма по сравнению с диким в неселективных условиях. Однако в некоторых работах показано, что мутации, обуславливающие резистентность бактерии к антибиотику, могут иметь низкую или вообще не иметь биологической стоимости. Скорость роста таких мутантных штаммов сравнима со скоростью роста дикого штамма [7, 8], т. е. часто в условиях in vitro изменения в метаболизме бактериальной клетки трудно выявить, если они не влияют на рост бактерий, поэтому существующие на сегодняшний день подходы для измерения биологической стоимости антибиотикорезистентности бактерий, например методом прямой конкуренции дикого и мутантного штаммов, не всегда адекватны [9—11]. В связи с этим необходим поиск новых приёмов, которые позволят выявить свойства и/или способности резистентных бактерий по отношению к клеткам дикого типа.
В настоящей работе мы попытались оценить биологическую стоимость устойчивости Helicobacter pylori к рифампицину (РИФ), используя новый подход: оценку его резистентности в процессе адаптации к другим антибиотикам — офлоксацину (ОФЛ) и метронвдазолу (МТЗ).
Рифампицин — антибиотик, который ингибирует РНК-полимеразу прокариотов на этапе инициации транскрипции. Генетическая резистентность H.pylori к РИФ обусловлена точечными мутациями в rpoB гене, в результате которых фермент сохраняет свои свойства, но теряет способность связываться с антибиотиком [12]. ОФЛ относится к фторхинолонам первого поколения, устойчивость бактерий к нему обусловлена мутациями в gyrA гене, который кодирует А субъеди-
ницу ДНК гиразы [13]. Устойчивость к МТЗ обусловлена мутациями в rdxA (HP0954) и frxA (НР0б42) генах, кодирующих нитроредуктазы, которые участвуют в конверсии метронидазола из неактивного предшественника в бактерицидный и мутагенный гидроксиламин [14, 15].
Maтеpиaл и методы
Шmaммы u ux кульmuвuрoвaнue. Штамм H.pylori 2бб95 был любезно предоставлен проф. М. Ахтманом (Институт инфекционной биологии Макс-Планка, Берлин). H.pylori культивировали на плотной питательной среде, содержащей Колумбийский агар (BioMerieux, Франция), 10% инактивированной лошадиной сыворотки (PAA Lab., Австрия), 5% дрожжевого диализата (НИИ Эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи РАМН) и селективную смесь антибиотиков «Dent» (Oxoid, Англия). Жидкую культуру H.pylori выращивали в питательной среде, содержащей 3,7% Brain heart infusion (BioMerieux, Франция), 10% инактивированной фетальной бычьей сыворотки (HyClone, США) и 5% дрожжевого диализата, в тех же условиях. Чашки и пробирки с жидкой культурой инкубировали при 37°С в атмосфере 5% CO2 в течение 48—72 ч.
IIoAy4eHue aHmu6uommope3ucmeHmHbix ^touoe H.pylori. Устойчивые к антибиотикам клоны получали, высевая клетки H.pylori 2бб95 на плотные селективные среды, содержащие 20 мкг/мл рифампицина (Sigma, США), 1 мкг/мл офлоксацина или 8 мкг/мл метронидазола (Sigma, США). Мутантные колонии появлялись на 4—5-е сутки.
Отобранные резистентные колонии пересевали на свежую чашку и далее культивировали под прессом соответствующего антибиотика.
Tрaнcфoрмaцuя H.pylori. Клетки H.pylori 2бб95 трансформировали ПЦР-фрагментами (330 п. н.), полученными с ДНК рифампициноустойчивых штаммов R1 и R2 с помощью праймеров rpoB1 и rpoB2 (табл. 1) как описано в [1б]. Для этого бактерии, выросшие на плотной питательной среде в течение 24 ч, переносили на свежую чашку в виде тонкого слоя и продолжали инкубировать в тех же условиях в течение 5 ч. Затем к тонкому слою добавляли 0,25 мкг ПЦР-продукта, ресуспен-дированного в 20 мкл Трис-ЭДТА буфера. После 20-часовой инкубации бактерии ресуспендировали в 120 мкл фосфатного буфера, пересевали их на чашки с селективной средой, содержащей 20 мкг/мл рифампицина, и инкубировали в обычных условиях. Колонии трансформантов отбирали на 5-й день.
Onpedeaeuue cmpocmupocma ^abmypbi H.pylori. Для определения скорости роста H.pylori 2бб95, рифампициноустойчивых штаммов R1 и R2 и трансформированных клонов T1 и T2 20 мл исходных культур в концентрации10б клеток/мл инку-
e
Таблица 2. Частота возникновения мутантов при адаптации штаммов H.pyloriк антибиотикам
Антибиотик Штамм Н.ру1оп Частота возникновения мутантов
Рифампицин 26695 1,6х10-8
Офлоксацин 26695 1,7х10-8
Офлоксацин R:R1 7,1х10-9
Офлоксацин R:R2 1,5х10-8
Офлоксацин R:T1 5,0х10-10
Офлоксацин R:T2 4,1х10-8
Метронидазол 26695 5,0х10-9
Метронидазол R:R1 5,1х10-9
Метронидазол R:R2 3,5х10-6
Метронцдазол R:T1 1,5х10-8
Метронцдазол R:T2 5,0х10-8
бировали при 37°С в атмосфере 5% CO2 в течение 4 суток в жидкой среде. Через каждые 12 ч отбирали аликвоты по 1 мл для измерения оптической плотности (ODgoo). Скорость роста H.pylori клонов оценивали по результатам трёх независимых экспериментов.
Определение частоты возникновения мутантов. Частоту возникновения устойчивых мутантов для штаммов H.pylori 26695, R1, R2, T1 и T2 определяли как описано в [17]. Штаммы культивировали в жидкой среде до середины логарифмической фазы, после чего культуру разбавляли средой до концентрации 106 клеток/мл (определяли по OD600) и разделяли на 20 аликвот по 1,5 мл, которые культивировали параллельно в течение 48 ч. Выросшую культуру H.pylori концентрировали центрифугированием при 10000 g в течение 2 мин и высевали на селективные чашки, содержащие соответствующие антибиотики. Одновременно оценивали плотность клеток в нескольких культурах в каждой параллели (т. е. для каждого штамма H.pylori). Общее количество живых клеток в культуре определяли посевом нескольких разведений суспензии на неселективную плотную среду. Подсчитывали количество выросших колоний на 4-е сутки. Частоту возникновения резистентных мутантов определяли как соотношение числа антибиотикоустойчивых колоний, выросших на селективных чашках с соответствующим антибиотиком, к общему числу живых клеток в культуре.
Выделение ДНК и ПЦР-анализ мутаций в rpoB, rdxA и frxA генах. Для выделения ДНК штаммы H.pylori культивировали на плотной питательной среде (мутантные резистентные клоны — под прессом соответствующего антибиотика) в течение 72 ч, затем клетки смывали с чашек 1 мл 0,9% раствора NaCl и центрифугировали при 10000 g в течение 5 мин. Полученный осадок промывали несколько раз 0,9% раствором NaCl и затем выделяли геномную ДНК с помощью набора Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega, США) согласно рекомендациям производителя. Для определения мутаций в rpoB (в трёх участках гена), rdxA и frxA генах использовали олиго-нуклеотидные праймеры, указанные в табл. 1. Амплификацию ДНК проводили в следующих условиях: 94°C — 10 с, 55°C — 10 с, 72°C — 30 с, количество циклов 30.
Анализ нуклеотидной последовательности ПЦР-продук-тов проводили с помощью автоматического секвенатора ABI Prism 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) с использованием ABI Prism BigDye Terminator v3.0 Ready Reaction Cycle Sequencing Kit согласно протоколам производителя.
Результаты и обсуждение
Устойчивость бактерий к рифампицину обусловлена мутациями в rpoB гене, кодирующем в-субъединицу ДНК-зависимой РНК-полимеразы. Мутации локализуются в трёх участках: V149, cluster и R701 rpoB гена [18]. Частота возникновения устойчивых мутантов при адаптации H.pylori
26695 к рифампицину составила 1,6х10-8. Для работы были отобраны два РИФ-устойчивых клона H.pylori — Я1 и Я2. Анализ нуклеотидной последовательности фрагментов их rpoB генов показал наличие точечных мутаций 01588Д и С1618Т, приводящих к заменам в РНК-полимеразе: Б530М и И540У для Я1 и Я2 клонов соответственно.
Исходный штамм H.pylori 26695 трансформировали ПЦР-фрагментом длиной 330 п. н., полученным с помощью праймеров гроВ1 и гроВ2 с ДНК рифампициноустойчивых штаммов Я1 и Я2. В результате трансформации были получены РИФ-устойчивые клоны Т1 и Т2, несущие только соответствующие мутации в rpoB гене.
Для выявления биологической стоимости мутаций, обеспечивших устойчивость к РИФ, мы оценивали скорости роста мутантных штаммов по сравнению с исходным штаммом 26695. Было выявлено, что скорости роста Я1 и Я2 в результате адаптации к РИФ практически не меняются. В отличие от них, снижение скорости роста Т1 и Т2 клонов по отношению к H.pylori 26695 было статистически достоверным. На основании этих результатов можно высказать предположение, что устойчивость H.pylori к рифампицину, приобретённая в ходе адаптации микроорганизма к антибиотику, и устойчивость к рифампицину, полученная в результате трансформации, имеют различную биологическую стоимость. Вполне вероятно, что в случае Я1 и Я2 она компенсирована дополнительными мутациями в геноме H.pylori.
Далее мы попытались определить, с какой частотой возникают резистентные мутанты при адаптации к офлоксацину (1 мкг/мл) и метрони-дазолу (8 мкг/мл) разных штаммов H.pylori: исходного 26695 и РИФР клонов Я1, Я2, Т1 и Т2 (табл. 2). Обнаружили, что частота возникновения мутантов штамма 26695 при адаптации к офлоксацину (1,7х10-8) сравнима с таковой при адаптации к рифампицину (1,6х 10-8). Возможно, это связано с тем, что устойчивость к данным антибиотикам обеспечивается точечными мутациями в генах-мишенях. Частота возникновения ОФЛР мутантов для рифампициноустойчивых клонов незначительно отличалась от таковой для
е
Таблица 3. Мутации, обнаруженные в гс1хА. и ЬхА. генах метронидазолоустойчивых клонов Н.ру/оп 26695, М и 132
Штамм Клон Нуклеотидные мутации в г^А Замена а/к в RdxA Нуклеотидные мутации в /ГхА Замена а/к в БгхА
26695 WM1 1Дел (ТТАТТАА) 018, стоп кодон
WM2 Дел (ТТАТТАА) 018, стоп кодон
WM3 Дел (ТТАТТАА) 018, стоп кодон
WM4 Дел (ТТАТТАА) 018, стоп кодон
WM5 Дел (ТТАТТАА) 018, стоп кодон
WM6 Дел (ТТАТТАА) 018, стоп кодон
WM7 0103Т Е34, стоп кодон
WM8 0223Т Е75, стоп кодон
WM9 Дел (ТТАТТАА) 018, стоп кодон
Я:Я1 ЯШ1 С415А О139К 089Т W30L
ЯШ2 С415А О139К
ЯШ3 С415А О139К
ЯШ4 С415А О139К
ЯШ5 С415А О139К 0226Т 076, стоп кодон
ЯШ6 С415А О139К
ЯШ7 С304Т О102, стоп кодон
ЯШ8 С415А О139К 0226Т, 0493Т 076, стоп кодон
ЯШ9 С415А О139К С485А Р162О
ЯШ10 285Инс ТТ У55, стоп кодон С146Т, 0529Т W59L, Е176, стоп кодон
ЯШ11 С415А О139К
ЯШ12 С415А О139К 089Т, С128А W30L, 43 , стоп кодон
Я:Я2 R2M1 0463Т 0155, стоп кодон
R2M3 С463Т 0155, стоп кодон
R2M1 192ИнсА 8107, стоп кодон
R2M2 200ИнсС 8107, стоп кодон
R2M4 143ИнсАА M56, стоп кодон 0218А 0730
R2M6 372 ДелА Я132, стоп кодон С485А P162L
R2M7 66ИнсТ 023, стоп кодон
R2M8 С242Т 886Ь
R2M9 200ИнсС 8107, стоп кодон 0241Т У81Б
Примечание. 1 - делеция ТТДТТДД в начале гена с 34-го по 41-й нуклеотид. 2 - инсерция динуклеотида ТТ в 85-й позиции.
штамма 26695, исключение составил только трансформированный клон Т1, для которого эта величина оказалась существенно меньше по сравнению с исходным штаммом Н^уОп 26695.
Частота возникновения мутантов в присутствии метронидазола для Я2 штамма оказалась значительно выше, чем для других штаммов: в 700 раз выше по сравнению с Я1, в 230 раз выше, чем для Т1, и в 70 раз — чем для Т2 штамма. Причем большое количество колоний (более 500) было обнаружено в 15 независимых культурах Я2, в то время как для Я1 и Т1 мутанты были обнаружены только в двух культурах, а для Т2 — в 5, т. е. резкий скачок в частоте возникновения резистентных мутантов для Я2 можно считать статистически достоверным. Таким образом, частоты возникновения мутантов для исходного штамма 26695 и полученных из него Я1, Я2, Т1 и Т2 клонов при селекции разными антибиотиками значительно отличаются, что вероятно является отражением различных вариантов адаптации Н.руЬп штаммов к ОФЛ и МТЗ.
Известно, что при адаптации Н.руЬп к метро-нидазолу возможны два варианта развития устойчивости: первый характеризуется высокой частотой возникновения резистентных мутантов (10-4)
и связан с мутациями только в одном гене (гйхА), второй характеризуется частотой возникновения мутантов 10-8 и вызван мутациями в двух генах (гйхА и/гхА) [19, 20]. Можно предположить, что низкая частота возникновения МТЗР мутантов для исходного штамма 26695, а также Я1, Т1 и Т2 клонов обусловлена одновременными мутациями в двух генах — гйхА и /гхА, тогда как высокая частота для Я2 клона связана только с мутациями в гйхА гене. В связи с этим нами были определены нуклеотидные последовательности гйхА и /гхА генов для МТЗ-устойчивых клонов, полученных при адаптации к метронидазолу штаммов 26695, Я1 и Я2. Было отобрано по 9—12 МТЗР клонов.
В результате проведённого анализа (табл. 3) во всех исследованных МТЗР клонах Н.руОп 26695 были обнаружены мутации только в гйхА, причем 7 мутаций из 9 являются делецией фрагмента длиной в 8 п. н. на 5' конце гена (34-41). В двух других клонах обнаружены пошепее-мута-ции, приводящие к образованию стоп-кодонов. В /гхА гене мутаций обнаружено не было. В МТЗР клонах Я1 штамма были найдены мутации как в гйхА, так и в /гхА гене, причем 10 из 12 клонов характеризовались только т188еше-мутацией С415А (О^К) в гйхА, а 6 клонов — дополнитель-
е
ными мутациями в frxA. Спектр мутаций, обнаруженных в rdxA гене в MTЗP клонах R2 штамма, отличался большим разнообразием и представлен в основном инсерциями/делециями нуклеотидов. Кроме того, в трёх MTЗP клонах R2 штамма были обнаружены мутации в frxA гене.
Tаким образом, устойчивость к MTЗ для штамма 26695 обусловлена только мутациями в rdxA гене, а R1 и R2 клоны характеризуются смешанным типом адаптации к метронидазолу — мутации обнаружены как в rdxA, так и в frxA генах, следовательно высокая частота возникновения мутантов для R2 клона при селекции MTЗ, вероятно, обусловлена дополнительными мутациями в генах, кодирующих белки, участвующие в метаболизме метронидазола в клетке, например в ribF (riboflavin kinase/FMN adenylyltransferase), mdaB (quinone reductase), ompll и fur (ferric uptake regulation protein) генах [21].
Интересно, что MTЗ-устойчивые клоны, полученные от R1 и R2, имеют совершенно другие наборы мутаций в rdxA по сравнению с клонами, полученными от 26695 (см. табл. 3). Кроме того, мутации в генах rdxA и frxA оказались более схожи между MTЗP клонами, полученными из одного штамма, чем из разных, что, возможно, говорит о сходном механизме их (мутаций) возникновения. Вполне вероятно, что совпадение мутаций в rdxA в большинстве MTЗP клонов 26695 (У из 9), с одной стороны, может являться неслучайным — как результат реализации ограниченного количества программ адаптации к метронидазолу, так и результатом селекции, при которой выживают только строго определённые генотипы MTЗP клонов 26695. Ограниченную программу адаптации демонстрирует и R1 штамм (мутации в 10 клонах из 12 одинаковы), однако при этом меняется сам спектр мутаций устойчивости к метронидазолу. Напротив, в штамме R2 были обнаружены разнообразные мутации в rdxA гене (мутации одинаковы только в 2 клонах из 9), однако причина такого разнообразия не понятна.
За приобретённую устойчивость к антибиотику бактерии часто расплачиваются ценой метаболизма, которая может выражаться в снижении скорости роста. В этом случае оценить in vitro биологическую стоимость антибиотикорезистент-ности возможно общепринятыми микробиологическими методами: измеряя скорость роста культуры или в прямой конкуренции дикого и мутантного штамма. При наличии компенсаторных мутаций, способствующих поддержанию нормального функционирования клеток, скорость роста мутантного резистентного штамма может не меняться, поэтому оценить биологическую стоимость устойчивости к антибиотику традиционными методами в этом случае становится невозможным.
Мы предполагаем, что биологическая стоимость резистентности всегда выражается в потенциальном ограничении функциональных возможностей клетки, однако для её оценки необходим поиск новых условий, которые позволят выявить новые свойства и/или способности резистентных бактерий по отношению к клеткам дикого типа. Доказательством данного тезиса является проведённое нами исследование. Так, применяя стандартный подход, мы не обнаружили существенной разницы в скорости роста двух рифампициноустойчивых штаммов Я1 и И2 по сравнению с исходным 26695, что должно свидетельствовать об отсутствии биологической стоимости их резистентности к рифампицину. Однако скорость роста Т1 и Т2, искусственно полученных при трансформации 26695 и содержащих гарантированно только мутации в гроВ гене, 01588Д и С1618Т соответственно, достоверно снижается по сравнению с исходным штаммом 26605 и говорит о том, что мутации в гроВ гене, обеспечивающие устойчивость штаммов Я1 и Я2 к рифампицину, все же имеют биологическую стоимость. Возможно, они скомпенсированы дополнительными мутациями, вероятно появившимися при адаптации Н.руїогї к рифампицину.
Кроме того, сравнение частот возникновения мутантов в присутствии метронидазола показали, что в результате приобретённой устойчивости к рифампицину бактерии получают новые свойства, не связанные со скоростью роста, при этом меняются их адаптационные возможности к другому антибиотику, в нашем случае — к метронидазолу.
Так, для Я2 штамма было показано существенное увеличение частоты мутирования, а также широкий спектр мутаций, обеспечивающих устойчивость к метронидазолу. Последнее наблюдали и для штамма Я1. Однако частоты возникновения устойчивых мутантов в присутствии ОФЛ и МТЗ для трансформированных клонов Т1 и Т2, несущих мутации только в гроВ гене, существенно не отличаются от таковых для исходного штамма 26695, т. е. повышенная частота возникновения мутантов Я2 клона при адаптации его к метронидазолу, а также широкий спектр мутаций в гйхА и /гхА генах Я1 и Я2 клонов не являются следствиями мутаций в гроВ гене.
Описанные явления могут говорить, с одной стороны, о том, что адаптация к РИФ меняет свойства клетки таким образом, что повышает её способность мутировать, с другой стороны, что направленный отбор РИФ-устойчивых штаммов лишь выявляет клоны, появившиеся в результате размножения клеток с повышенной мутабельно-стью, которые, по-видимому, всегда присутствуют в популяции. На наш взгляд, все это позволяет по-новому взглянуть на оценку биологической стоимости антибиотикорезистентности у бакте-
е
рий как на процесс, который обусловлен не только мутациями в гене-мишене, а, возможно, и дополнительными мутациями в геноме. Поиск этих детерминант, обеспечивающих не только при-
ЛИТЕРАТУРА
1. Guillemot D. Antibiotic use in humans and bacterial resistance. Curr Opin Microbiol 1999; 2: 494—498.
2. Wichelhaus T.A., Boddinghaus B., Besier S. et al. Biological cost of rifampin resistance from the perspective of Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother 2002; 46: 3381—3385.
3. Austin D. J., Kristinsson K. G., Anderson R. M. The relationship between the volume of antimicrobial consumption in human communities and the frequency of resistance. Proc Natl Acad Sci USA. 1999; 9б: 1152—115б.
4. Seppala H., Klaukka T., Vuopio-Varkila J. et al. The effect of changes in the consumption of macrolide antibiotics on erythromycin resistance in group A streptococci in Finland. New Engl J Med 199У; 331: 441—446.
5. Hawkey P. M. Molecular epidemiology of clinically significant antibiotic resistance genes. Br J Pharmacol 2008; 153: 40б—413.
6. Stefani S., Agodi A. Molecular epidemiology of antibiotic resistance. Int J Antimicrob Agents 2000; 13: 143—153.
У. O'Sullivan D. M., McHugh T. D., Gillespie S. H. Analysis of rpoB and
pncA mutations in the published literature: an insight into the role of oxidative stress in Mycobacterium tuberculosis evolution? J Antimicrob Chemother 2005. 55: бУ4—бУ9.
8. O'Neill A. J., Huovinen T., Fishwick C. W., Chopra I. Molecular genetic and structural modelling studies of Staphylococcus aureus RNA polymerase and the fitness of rifampin resistance genotypes in relation to clinical prevalence. Antimicrob Agents Chemother 2006; 50: 298—309.
9. Pfister P., Corti N., Hobbie S. et al. 23S rRNA base pair 205У-2611 determines ketolide susceptibility and fitness cost of the macrolide resistance mutation 2058A — G. Proc Natl Acad Sci USA 2005; 102: 5180—5185.
10. Wolter N., Smith A. M., Farrell D. J. et al. Novel mechanism of resistance to oxazolidinones, macrolides, and chloramphenicol in ribosomal protein L4 of the pneumococcus. Antimicrob Agents Chemother 2005; 49: 3554—355У.
11. Nilsson A. I., Zorzet A., Kanth A. et al. Reducing the fitness cost of antibiotic resistance by amplification of initiator tRNA genes. Proc Natl Acad
Sci USA 2006; 103: 69У6—6981.
способление Н^Ьп к антибиотикам, но и в целом возможность адаптации микроорганизма к изменяющим условиям внешней среды, станет следующим шагом в нашей работе.
12.
13
Heep M., Beck D., Bayerdorffer E., Lehn N. Rifampin and rifabutin resistance mechanism in Helicobacter pylori. Antimicrob Agents Chemother 1999; 43: 1497-1499.
Moore R. A., Beckthold B., Wong S. et al. Nucleotide sequence of the gyrA gene and characterization of ciprofloxacin resistant mutants of Helicobacter pylori. Antimicrob. Agents Chemother. 1995. 39: 107—111.
14. Goodwin A., Kersulyte D., Sisson G. et al. Metronidazole resistance in Helicobacter pylori is due to null mutations in a gene (rdxA) that encodes an oxygen insensitive NADPH nitroreductase. Mol Microbiol 1998; 28: 383—393.
15. Sisson G., Jeong J.Y. , Goodwin A. et al. Metronidazole activation is mutagenic and causes DNA fragmentation in Helicobacter pylori and in Escherichia coli containing a cloned H.pylori rdxA (nitroreductase) gene. J Bacteriol 2000; 182: 5091—5096.
16. Ge Z., Taylor D. E. Rapid polymerase chain reaction screening of Helicobacter pylori chromosomal point mutations. Helicobacter 1997; 2: 127—131.
17. Ge Wang, Trevor J. M. Wilson, Qin Jiang, Diane E. Taylor. Spontaneous mutations that confer antibiotic resistance in Helicobacter pylori. Antimicrob Agents Chemother 2001; 45: 727—733.
18. Campbell E. A., Korzheva N., Mustaev A. et al. Structural mechanism for rifampicin inhibition of bacterial RNA polymerase. Cell 2001; 104: 901—912.
19. Jeong J. Y., Mukhopadhyay A. K., Akada J. K. et al. Roles of FrxA and RdxA nitroreductases of Helicobacter pylori in susceptibility and resistance to metronidazole. J Bacteriol 2001; 183: 5155—5162.
20. Jeong J. Y., Mukhopadhyay A.K., Dailidiene D. et al. Sequential inactivation of rdxA (HP0954) and frxA (HP0642) nitroreductase genes cause moderate and high-level metronidazole resistance in Helicobacter pylori. J Bacteriol 2000; 182: 5082—5090.
21. Albert T. J., Dailidiene D., Dailide G. et al. Mutation discovery in bacterial genomes: metronidazole resistance in Helicobacter pylori. Nature Methods 2005; 2: 951—953.
-Q-
