CC BY
18
ISSN pr. 2412-608Х, ISSN on. 2412-6098 Масличные культуры. Вып. 4 (180), 2019
УДК 633.854.54:632.937
DOI: 10.25230/2412—608Х—2019—4—180—128—132
Биологическая эффективность лабораторных образцов
микробиопрепаратов на основе перспективных штаммов антагонистов против возбудителя фузариоза льна масличного на фоне искусственного заражения in vitro
Л.В. Маслиенко1,
доктор биологических наук
А.Х. Воронкова1,
младший научный сотрудник
Л.А. Даценко1' 2,
лаборант-исследователь, магистрант КУБГУ
Е.А. Ефимцева1, 2,
лаборант-исследователь, магистрант КУБГУ
1ФГБНУ ФНЦ ВНИИМК
350038, Россия, г. Краснодар, ул. им. Филатова, д. 17 Тел.: (861) 275-85-19 E-mail: [email protected]
2 ФГБОУ ВО «Кубанский государственный университет»
Для цитирования: Маслиенко Л.В., Воронкова АХ, Даценко Л.А., Ефимцева Е.А. Биологическая эффективность лабораторных образцов микробиопрепаратов на основе перспективных штаммов антагонистов против возбудителя фузариоза льна масличного на фоне искусственного заражения in vitro // Масличные культуры. - 2019. - Вып. 3 (179). -С. 128-132.
Ключевые слова: лен масличный, фузариоз, искусственное заражение, in vitro, Fusarium oxysporum var. orthoceras.
Представлены результаты вторичного скрининга 43 перспективных штаммов антагонистов из коллекции лаборатории биометода ВНИИМК к возбудителю фузариоза льна масличного Fusarium oxysporum Schlecht. emend. Shyd. et Hans. var. orthoceras (App. et Wn.) Bilai in vitro. Выделено 20 перспективных штаммов-продуцентов микробиопрепаратов, показавших биологическую эффективность, превышающую 70,0 %. При этом максимальная эффективность установлена у трех грибных штаммов: И-3 Basidiomycetes (94,1 %),
Pv-3 Penicillium verrucosum и T-1 Trichoderma sp. (88,2 %); четырех штаммов бактерий рода Bacillus: Б-2 B.circulans (94,1 %), Б-4 B. circulans (88,2 %), 5-3 Bacillus sp. и Б (2-1) B. licheniformis (82,4 %) и двух штаммов бактерий рода Pseudomonas: Sgc-1 и 16-2 Pseudomonas sp. (70,6 %).
UDC 633.854.54:632.937
Biological efficiency of laboratory samples of microbiopreparations basing on the promising strains-antagonists of fusariose pathogen affecting oil flax at artificial inoculation in vitro. L.V. Maslienko1, doctor of biology A.Kh. Voronkova1, junior researcher L.A. Datsenko1'2, laboratory assistant, master's degree student Е.А. Efimtseva1'2, laboratory assistant, master's degree student
1V.S. Pustovoit All-Russian Research Institute of Oil Crops
17, Filatova str., Krasnodar, 350038, Russia Те!: (861) 275-85-19 E-mail: [email protected]
2Kuban State University
Key words: oil flax, fusariose, artificial inoculation, in vitro, Fusarium oxysporum var. orthoceras.
We presented the results of the secondary screening of 43 promising strains-antagonists from the collection of the laboratory of biological methods of V.S. Pustovoit All-Russian Research Institute of Oil to a pathogen Fusarium oxysporum Schlecht. emend. Shyd. et Hans. var. orthoceras (App. et Wn.) Bilai in vitro affecting oil flax. We selected 20 promising strains-producers of microbiopreparations that had biologival efficiency exceeding 70.0%. maximal efficiency was stated for three fungal strains: I-3 Basidiomycetes (94.1%), Pv-3 Penicillium verrucosum and T-1 Trichoderma sp. (88,2 %); four bacterial strains of Bacillus genus: B-2 B. circulans (94.1%), B-4 B. circulans (88.2%), 5-3 Bacillus sp. и B (2-1) B. licheniformis (82.4%), and for two strains of Pseudomonas bacteria: Sgc-1 and 16-2 Pseudomonas sp. (70.6%).
Введение. В лаборатории биометода ВНИИМК проводятся многолетние исследования по разработке биологических мер борьбы с болезнями масличных культур. В последние годы начаты исследования по разработке микробиологических методов снижения вредоносности наиболее распространенной болезни льна масличного - фузариоза.
В основе разработанной нами концепции целенаправленного создания микробиопрепаратов для защиты сельскохозяй-
ственных культур от болезней лежит ступенчатый скрининг выделенных штаммов-антагонистов фитопатогенов, который включает первичную оценку антагонистической активности in vitro к наиболее распространенным и вредоносным возбудителям болезней методом двойных или встречных культур. Затем лабораторные образцы микробиопрепаратов, изготовленные на основе выделенных в первичном скрининге перспективных штаммов, оценивают на фоне искусственного заражения патогенами в лабораторных условиях во влажной камере и в почве [1; 2]. Так как применяемый нами метод агаровых блоков [3] для искусственного заражения возбудителями болезней подсолнечника и сои не подходит для культуры льна в связи с малыми размерами семян, мы модифицировали методы, разработанные для заражения фузариозом семян рапса и горчицы [4; 5].
В результате первичного скрининга к патогенным возбудителям фузариоза льна масличного Fusarium oxysporum var. orthoceras и Fusarium poae из 60 коллекционных штаммов антагонистов выделены 43 перспективных штамма, проявивших антагонистическую активность к обоим патогенам. Из них 15 перспективных штаммов грибов: T-1, T-2, T-3, T-4 Trichoderma sp., Tk-1 T. koningii, SM-1 Sordaria sp., Pv-3 Penicillium verrucosum, Pr-1 P. rugulosum, Pk-1 Penicillium vermiculatum, A-1 и И-3 Basidiomycetes, An-1 Aspergillus niger, Av-1 Aspergillus versicolor, Xk-1 Chaetomium olivaceum и Хк-3 Chaetomium globosum; 20 штаммов бактерий рода Bacillus: Fa 41, D 7-1, 5Б-1, K 1-2 Bacillus subtilis, 3-2, 3-3, 5-3, 11-2, 11-3, D 1-1, D 7-3, Fa 4-2, Fz 9, 01 корГ Bacillus sp., Б-2, Б-4 B. circulans, P-9 B. polymyxa, Б-12, Б-5, Б (2-1) B. licheniformis и восемь штаммов бактерий из рода Pseudomonas: Oif 2-1, 16-2, Sgc-1, 14-4, 12-2, 15-1 Pseudomonas sp., Sgrc-1 P. fluorescens и 14-3 P. chlororaphis [6].
Настоящая работа посвящена первому этапу вторичного скрининга выделенных перспективных штаммов-антагонистов к наиболее распространенному возбудителю фузариоза льна масличного Fusarium
oxysporum Schlecht. emend. Shyd. et Hans. var. orthoceras (App. et Wn.) Bilai.
Материалы и методы. На основе выделенных в первичном скрининге перспективных штаммов антагонистов изготавливали лабораторные образцы микробиопрепаратов в препаративной форме «жидкая культура» (ЖК) при глубинном культивировании штаммов на качалке, со скоростью вращения 200 об./мин., в колбах Эрленмейера объёмом 750 мл, при объемах среды 150 мл. Грибы выращивали в течение 4-х суток на среде Рудакова [7], бактерии - в течение 2-х суток, из рода Bacillus - на среде Тайло-на-3 [8], а из рода Pseudomonas - на среде Кинга В [9]. Титр определяли методом серийных разведений [10].
Семена льна масличного сорта ВНИИМК 620 обрабатывали лабораторными образцами микробиопрепаратов вручную, в круглодонных колбах, с нормами расхода препарата 3,0 л/т, рабочей жидкости -6,0 л/т и хранили в течение 3-х суток.
Патогенный изолят возбудителя фузариоза льна масличного Fusarium oxyspo-rum var. orthoceras предварительно выращивали на картофельно-сахарозном агаре (КСА) [8] в течение 15 суток при температуре 25 оС. Затем обработанные семена льна, по 20 шт. раскладывали на увлажненную стерильной водой фильтровальную бумагу, выстланную на поверхность 15-дневных колоний патогена, при этом верхнюю крышку чашки Петри выстилали стерильной фильтровальной бумагой, смоченной стерильной водой. Через 10 суток проводили учет поражения проростков льна возбудителем фуза-риоза. Повторность 3-кратная. Контроль -чистые необработанные семена с заражением патогеном. Биологическую эффективность препаратов определяли по формуле [11]:
100 ■ (а - Ь) С = ----,
а
где С - биологическая эффективность, %;
a - количество больных растений в контроле;
b - количество больных растений в варианте.
Результаты и обсуждение. В результате оценки лабораторных образцов микробиопрепаратов в препаративной форме ЖК на основе 43 штаммов антагонистов, выделенных в первичном скрининге, на фоне искусственного заражения льна масличного возбудителем фузариоза Fusarium oxysporum var. orthoceras в лабораторных условиях in vitro (в контроле поражение составило 85,9 %) выделено 20 перспективных штаммов-продуцентов, показавших биологическую эффективность, превышающую 70,0 % (табл. 1, 2, 3).
Таблица 1
Эффективность обработки семян льна масличного лабораторными образцами микробиопрепаратов на основе перспективных штаммов грибов антагонистов на фоне искусственного заражения возбудителем фузариоза Fusarium oxysporum var. orthoceras in vitro, через 10 суток
ЦЭБ, ВНИИМ [К, 2019 г.
№ п/п Вариант Титр, КОЕ/мл Биологическая эффективность, %
1 Контроль - 85,9*
2 T-1 Trichoderma sp. 2,8 x 109 88,2
3 T-2 Trichoderma sp. 3,0 x 109 76,5
4 T-4 Trichoderma sp. 3,5 x 109 76,5
5 T-3 Trichoderma sp. 3,8 x 109 64,7
6 Tk-1 Trichoderma koningii 2,9 x 109 58,8
7 Pv-3 Penicillium verrucosum 8,5 x 109 88,2
8 Pr-1 Penicillium rugulosum 6,8 x 109 52,9
9 Pk-1 Penicillium vermiculatum 8,5 x 109 41,2
10 И-3 Basidiomycetes 2,5 x 10' 94,1
11 A-1 Basidiomycetes 2,8 x 10' 64,7
12 Xk-1 Chaetomium olivaceum 6,5 x 10' 64,7
13 Хк-3 Chaetomium globosum 8,8 x 10' 76,5
14 SM-1 Sordaria sp. 7,8 x 10' 23,5
15 An-1 Aspergillus niger 4,5 x 1010 76,5
16 Av-1 Aspergillus versicolor 1,5 x 1010 0
Примечание: * - поражено возбудителем фузариоза в контроле без обработки, %
Из 15 перспективных грибов антагонистов высокую эффективность против возбудителя фузариоза показали семь штаммов: T-1 Trichoderma sp., T-2 Trichoderma sp., T-4 Trichoderma sp., Pv-3 Pénicillium verrucosum, И-3 Basidiomycetes, Хк-3 Chaetomium globosum, An-1 Aspergillus niger. При этом максимальная эффективность установлена у трех штаммов: И-3 Basidiomycetes (94,1 %), Pv-3 Penicillium verrucosum и T-1 Trichoderma sp. (88,2 %) (рис. 1).
Из 20 перспективных штаммов бактерий рода Bacillus выделены 11, эффективность которых на фоне искусственного зараже-130
ния возбудителем фузариоза превысила 70,0 %: 01 кор£ D 1-1, Fa 4-1, Fa 4-2, 5-3, D 7-3, 3-3 и 11,3 Bacillus sp., Б (2-1) B. licheniformis, Б-2 и Б-4 B. circulans (табл. 2).
а б
Рисунок 1 - Влияние обработки семян льна масличного лабораторным образцом микробиопрепарата на основе перспективного штамма И-3 Basidiomycetes на развитие возбудителя фузариоза льна масличного Fusarium oxysporum var. orthoceras in vitro (а - вариант; б - контроль без обработки) через 10 суток, 2019 г. (ориг.)
Таблица 2
Эффективность обработки семян льна масличного лабораторными образцами микробиопрепаратов на основе перспективных штаммов-антагонистов из рода Bacillus на фоне искусственного заражения возбудителем фузариоза Fusarium oxysporum var. orthoceras in vitro, через 10 суток
Ц (ЭБ, ВНИИ МК, 2019 г.
№ п/п Вариант Титр, КОЕ/мл Биологическая эффективность, %
1 Контроль - 85,9*
2 01 корf Bacillus sp. 2,4 x 1010 76,5
3 3-2 Bacillus sp. 1,8 x 1010 52,9
4 D 1-1 Bacillus sp. 1,6 x 1010 70,6
5 Fa 4-2 Bacillus sp. 2,1 x 1010 76,5
6 5-3 Bacillus sp. 3,1 x 1010 82,4
7 11-2 Bacillus sp. 2,0 x 1010 64,7
8 11-3 Bacillus sp. 3,6 x 1010 70,6
9 D 7-3 Bacillus sp. 3,4 x 1010 82,4
10 Fz 9 Bacillus sp. 3,6 x 1010 29,4
11 3-3 Bacillus sp. 3,4 x 1010 76,5
12 Fa 4-1 B. subtilis 2,4 x 1010 70,6
13 K 1-2 B. subtilis 2,8 x 1010 41,2
14 D 7-1 B. subtilis 2,4 x 1010 47,1
15 5Б-1 B. subtilis 2,6 x 1010 35,3
16 Б-2 B .circulans 8,5 x 108 94,1
17 Б-4 B. circulans 6,2 x 108 88,2
18 Б-5 B. licheniformis 3,6 x 1010 0
19 Б-12 B .licheniformis 4,8 x 1010 58,8
20 Б (2-1) B. licheniformis 3,9 x 1010 82,4
21 P-9 B. polymyxa 7,6 x 1010 41,2
Примечание: * — поражено возбудителем фу-зариоза в контроле без обработки
Максимальная эффективность установлена у штаммов Б-2 B. circulans (94,1 %), Б-4 B. circulans (88,2 %), а также 5-3 Bacillus sp. и Б (2-1) B. licheniformis (82,4 %) (рис. 2).
а
б
Рисунок 2 - Влияние обработки семян льна масличного лабораторным образцом микробиопрепарата на основе перспективного штамма Б-2 Bacillus
circulans на развитие возбудителя фузариоза льна масличного Fusarium oxysporum var. orthoceras in vitro (а - вариант; б - контроль без обработки), через 10 суток, 2019 г. (ориг.)
Из восьми перспективных штаммов бактерий псевдомонад выделены два штамма: Sgc-1 и 16-2 Pseudomonas sp., эффективность которых на фоне искусственного заражения возбудителем фузариоза составила 70,6 % (табл. 3, рис. 3).
Таблица 3
Эффективность обработки семян льна масличного лабораторными образцами микробиопрепаратов на основе перспективных штаммов-антагонистов на фоне искусственного заражения возбудителем фузариоза Fusarium oxysporum var. orthoceras in vitro, через 10 суток
ЦЭБ, ВНИИМК, 2019 г.
№ п/п Вариант Титр, КОЕ/мл Биологическая эффективность, %
1 Контроль - 85,9*
2 Sgc-1 Pseudomonas sp. 2,5 x 1011 70,6
3 12-2 Pseudomonas sp. 1,8 x 1011 64,7
4 15-1 Pseudomonas sp. 1,5 x 1011 64,7
5 Sgrc-1 P. fluorescens 3,5 x 1011 52,9
6 14-3 P. chlororaphis 3,8 x 1011 23,5
7 14-4 Pseudomonas sp. 2,5 x 1011 52,9
8 16-2 Pseudomonas sp. 1,8 x 1011 70,6
9 Oif 2-1 Pseudomonas sp. 2,5 x 1011 47,1
Примечание: * - поражено возбудителем фузариоза в контроле без обработки
а б
Рисунок 3 - Влияние обработки семян льна масличного лабораторным образцом микробиопрепарата на основе перспективного штамма Sgc-1 Pseudomonas sp. на развитие возбудителя
фузариоза льна масличного Fusarium oxysporum var. orthoceras in vitro (а - вариант; б - контроль без обработки), через 10 суток, 2019 г. (ориг.)
Выводы. В результате вторичного скрининга 43 перспективных штаммов антагонистов к возбудителю фузариоза льна масличного Fusarium oxysporum var. orthoceras in vitro выделено 20 перспективных штаммов-продуцентов, показавших биологическую эффективность, превышающую 70,0 %.
Из 15 перспективных грибных штаммов максимальная эффективность установлена у трех: И-3 Basidiomycetes (94,1 %), Pv-3 Penicillium verrucosum и T-1 Trichoderma sp. (88,2 %).
Из 20 перспективных штаммов бактерий рода Bacillus максимальная эффективность установлена у четырех: Б-2 B. circulans (94,1 %), Б-4 B. circulans (88,2 %), а также 5-3 Bacillus sp. и Б (2-1) B. licheniformis (82,4 %).
Из восьми перспективных штаммов бактерий рода Pseudomonas выделены два -Sgc-1 и 16-2 Pseudomonas sp., эффективность которых на фоне искусственного заражения возбудителем фузариоза составила 70,6 %.
Все выделенные перспективные штаммы антагонистов будут включены в следующий этап скрининга на фоне искусственного заражения льна масличного возбудителем фузариоза в почве.
Список литературы
1. Маслиенко Л.В. Лаборатория биологических средств защиты растений (вчера, сегодня, завтра) // История научных исследований во ВНИИМКе за 90 лет. -Краснодар, 2003.- С. 273-281.
2. Егоров Н.С. Основы учения об антибиотиках. - М.: Изд-во «Наука», 2004. - 525 с.
3. Зайчук В.Ф. Об устойчивости подсолнечника к гнилям // Масличные культуры. -1983. - № 1. - С. 16-17.
4. Зайчук В.Ф., Коновалов Н.Г., Калюж-ная Г.А., Полянская О.Ф. Метод оценки устойчивости рапса и горчицы к фузариозу // Науч.-тех. бюл. ВНИИМК. - 1990. - Вып. 4 (111). - С. 49-52.
5. Маслиенко Л.В., Воронкова А.Х., Дацен-ко Л.А., Ефимцева Е. А. Сравнение двух методов искусственного заражения семян льна масличного возбудителями фузариоза in vitro // Масличные культуры. Науч.-тех. бюл. ВНИИМК. - 2019. - Вып. 3 (179). - С. 100105.
6. Маслиенко Л.В., Воронкова А.Х., Дацен-ко Л.А., Ефимцева Е. А. Первичный скрининг штаммов-антагонистов из коллекции лаборатории биометода ВНИИМК к возбудителю фузариоза льна масличного // Масличные культуры. Науч.-тех. бюл. ВНИИМК. - 2019. -Вып. 3 (179). - С. 92-99.
7. Рудаков О.Л. Микофильные грибы, их биология и практическое значение. - М.: Наука, 1981. - 160 с.
8. Егоров Н.С. Выделение микробов-антагонистов и биологические методы учета их антибиотической активности. - М.: Изд-во Моск. ун-та, 1956. - 78 с.
9. King E.O., Ward M.K, Raney D.E. Two simple media for the demonstration of pyocyanin and fluorescing // J. Lab. Clin. Med. - 1954. -Vol. 44. - P. 301-307.
10. Нетрусов Ф.И., Егорова М.А., Захарчук Л.М. Практикум по микробиологии. - М.: Издательский центр «Академия», 2005. - 608 с.
11. Груздев Г.С. Практикум по химической защите. - М.: Колос, 1983. - 230 с.
References
1. Maslienko L.V. Laboratoriya biologicheskikh sredstv zashchity rasteniy (vchera, segodnya, zavtra) // Istoriya nauchnykh
issledovaniy vo VNIIMKe za 90 let. -Krasnodar, 2003. - S. 273-281.
2. Egorov N.S. Osnovy ucheniya ob antibiotikakh. - M.: Izd-vo «Nauka», 2004. -525 s.
3. Zaychuk V.F. Ob ustoychivosti podsolnechnika k gnilyam // Maslichnye kul'tury. - 1983. - № 1. - S. 16-17.
4. Zaychuk V.F., Konovalov N.G., Kalyuzhnaya G.A., Polyanskaya O.F. Metod otsenki ustoychivosti rapsa i gorchitsy k fuzariozu // Nauch.-tekh. byul. VNIIMK. - 1990. - Vyp. 4 (111). - S. 49-52.
5. Maslienko L.V., Voronkova A.Kh., Datsenko L.A., Efimtseva E. A. Sravnenie dvukh metodov iskusstvennogo zarazheniya semyan l'na maslichnogo vozbuditelyami fuzarioza in vitro // Maslichnye kul'tury. Nauch.-tekh. byul. VNIIMK. - 2019. - Vyp. 3 (179). - S. 100-105.
6. Maslienko L.V., Voronkova A.Kh., Datsenko L.A., Efimtseva E. A. Pervichnyy skrining shtammov-antagonistov iz kollektsii laboratorii biometoda VNIIMK k vozbuditelyu fuzarioza l'na maslichnogo // Maslichnye kul'tury. Nauch.-tekh. byul. VNIIMK. - 2019. -Vyp. 3 (179). - S. 92-99.
7. Rudakov O.L. Mikofil'nye griby, ikh biologiya i prakticheskoe znachenie. - M.: Nauka, 1981. - 160 s.
8. Egorov N.S. Vydelenie mikrobov-antagonistov i biologicheskie metody ucheta ikh antibioticheskoy aktivnosti. - M.: Izd-vo Mosk. un-ta, 1956. - 78 s.
9. King E.O., Ward M.K, Raney D.E. Two simple media for the demonstration of pyocyanin and fluorescing // J. Lab. Clin. Med. - 1954. -Vol. 44. - P. 301-307.
10. Netrusov F.I., Egorova M.A., Zakharchuk L.M. Praktikum po mikrobiologii. - M.: Izdatel'skiy tsentr «Akademiya», 2005. - 608 s.
11. Gruzdev G.S. Praktikum po khimicheskoy zashchite. - M.: Kolos, 1983. -230 s.
Получено: 14.11.2019 Принято: 14.11.2019 Received: 14.11.2019 Accepted: 14.11.2019
