CC BY
24
УДК 579.26: 631.46
А.М. Петров, А.А. Вершинин, Л.К. Каримуллин, Т.В. Кузнецова
Институт проблем экологии и недропользования АН РТ, A-vershinin@mail.ru
БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ И СОСТАВ МИКРОБНОГО ПУЛА СЕРОЙ ЛЕСНОЙ ПОЧВЫ В УСЛОВИЯХ ДЛИТЕЛЬНОГО НЕФТЯНОГО ЗАГРЯЗНЕНИЯ
Исследована динамика дыхательной активности и численности отдельных групп почвенных микроорганизмов серой лесной легкоглинистой почвы в условиях длительного воздействия нефти при разном начальном содержании поллютанта. Показано, что в присутствии нефти усиливается интенсивность эмиссии СО2 и увеличивается численность микроорганизмов. Основные адаптационные процессы в почвенном микробном сообществе происходят в первый год после попадания нефти в почву. Уровни дыхательной активности и пики численности отдельных групп микроорганизмов определяются начальным содержанием нефти и временем воздействия поллютанта на микробное сообщество почвы.
Ключевые слова: нефть; серая лесная почва; дыхательная активность; почвенный микробоценоз; минерализация нефтепродуктов.
Введение
Попадание нефти в окружающую среду создает серьезные экологические проблемы в нефтедобывающих регионах. Для возвращения загрязненных нефтью земель в хозяйственный оборот требуется проведение мероприятий, направленных на устранение негативного действия нефтепродуктов. Комплекс проводимых рекультиваци-онных процедур должен основываться на понимании влияния начального содержания нефти на процессы трансформации и деградации поллю-танта и его воздействия на почвенные микроорганизмы, что позволит минимизировать затраты на работы по восстановлению плодородия и свойств нефтезагрязненных почв.
В связи с этим представляется важным изучение влияния начального содержания нефти на почвенные микробные сообщества и интенсивность процессов самоочищения при длительном воздействии поллютанта.
Цель работы - изучить динамику дыхательной активности и состава микробного пула серой лесной почвы при длительном воздействии нефти.
Материалы и методы исследований
В качестве объекта исследования использован горизонт А1 серой лесной легкоглинистой почвы (СЛ), физико-химическая характеристика которой приведена в таблице 1. В освобожденную от остатков растений воздушно-сухую просеянную почву вносили различное количество сернистой нефти Ямашинского месторождения Республики Татарстан. Конечное содержание внесенного поллютанта составляло 5, 10, 15 и 20%. Эксперименты проводились в лабораторных условиях в контейнерах из пищевого пластика размером 180х140х90 мм, содержащих по 1400 г почвы при влажности на уровне 60% от полной влаго-емкости и температуре окружающего воздуха 20-25оС. В качестве контроля (К) использовали незагрязненную почву. Еженедельно проводилось рыхление контрольных и опытных почвенных образцов. Суммарное содержание нефтепродуктов (НП) в почве в ходе эксперимента определяли ИК-спектрофотометрическим методом на анализаторе КН-2м (ПНД Ф 16.1.2.2.22-98).
Для определения скорости базального дыхания (Убазал) во флаконы емкостью 15 мл помещали
Гумус, % N, P подв K подв pH Содержание фракций (мм), %
% мг/100 г H2O KCl 1.0-0.25 0.25-0.05 0.05-0.01 <0.01
6.1 0.33 27.6 50.3 6.47 5.94 0.80 18.05 22.35 58.80
Таблица 1. Физико-химические характеристики серой лесной почвы
по 2 г почвы, добавляли 0.4 мл стерильной водопроводной воды и закрывали резиновыми пробками. Флаконы инкубировали при температуре 22оС в течение 24 ч. Скорость субстрат-индуци-рованного дыхания (V) устанавливали таким же способом с той лишь разницей, что во флаконы вместо воды добавляли по 0.4 мл 5% глюкозы, а время инкубации составляло 2 часа (Ананьева и др., 1993). Величину эмиссии СО2 определяли газохроматографическим способом на хроматографе «Хроматек Кристалл 5000.2» (Звягинцев, 1991). Скорость дыхания выражали в мкг СО2/г-час. Вычисляли коэффициент микробного дыхания (Q), который представляет собой отношение Уб /V (Anderson, Domsch 1993).
базал сид 4 ' '
В процессе выполнения микробиологических исследований определяли общую численность микроорганизмов (ОМЧ), численность углево-дородокисляющих (УОМ), целлюлозоразруша-ющих микроорганизмов (ЦРМ), актиномицетов (АМ) и микромицетов (ММ), бактерий усваивающих минеральный азот (БУМА) при различных уровнях загрязнения почв углеводородами нефти.
Количественный состав различных эколо-го-трофических групп микроорганизмов в почвах изучали методом посева почвенной суспензии на диагностические среды с использованием общепринятых методов почвенной микробиологии. Результаты оценивали путем сопоставления числа колоний в опытных и контрольных вариантах.
Коэффициент минерализации (Км) определяли, как соотношение численности микроорганизмов, выросших на крахмало-аммиачном агаре (КАА) и характеризующих процесс преобразования аммиачного азота, к численности микроорганизмов, выросших на мясо-пептонном агаре (МПА) и характеризующих превращение белковых веществ почвы.
Результаты экспериментов обработаны методами статистики при помощи программы Microsoft Excel.
Результаты и их обсуждение
Дыхательная активность почв
На протяжении эксперимента V контроль-
базал
ной почвы находилась в интервале 2.19-3.98 мкг СО2/гчас. Как и в ранее проведенных исследованиях (Киреева и др., 2001; Вершинин и др., 2014; Каримуллин и др., 2015; Петров и др., 2016), внесение нефти в почву существенно увеличивало эмиссию СО2.
Сложность нефти как субстрата, взаимозависимый метаболизм ее отдельных компонентов приводили к тому, что динамика V6 носила немонотонный характер. В каждом опытном вари-
анте обнаруживался свой временной интервал с максимальными значениями . Для варианта
5% наиболее интенсивная эмиссия СО2 была зарегистрирована на 180-270 сутки эксперимента, для варианта 10% на 270-365 сутки, для вариантов 15 и 20% на 365 сутки эксперимента (рис. 1А). Если в первых трех опытных вариантах максимальные значения V, были сопоставимы, то
базал
в варианте с 20% содержанием нефти предельная Vбазал в 15 раза превышала эмиссию СО2 из проб с более низким содержанием поллютанта. При 5% загрязнении в период с 270 по 365 сутки происходило снижение скорости базального дыхания, которое в дальнейшем стабилизировалось на уровне 3.85-4.16 мкг СО2/гчас, что близко к уровню дыхания контрольных образцов почв. Этот факт свидетельствует о восстановлении нормального функционирования почвенных микробоценозов.
20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0
А
100 200 300 400 500 600 700 Время, сутки
Б
800
О
О
35 1
30 -25 -20 -15 -10 -5 0
0
300 400 500 Время, сутки
Рис. 1. Параметры дыхания серой лесной почвы при разном начальном содержании нефти: А - V ; Б - V ; В - О
оазал сид ^г
0
100 200
500 700
800
2/2018
27
В остальных случаях (10-20%) снижение скорости Убазал регистрировалось при более длительных сроках инкубации. По истечении 730 суток величина Убазал вариантов содержащих 10, 15 и 20% поллютанта составляла 4.63-6.83 мкг СО2/гчас, и была в 2.1, 2.7 и 3.1 раза выше, чем в контроле.
Внесение нефти привело к активизации почвенных микроорганизмов, которая сопровождалась повышением Усид. Скорость субстрат-инду-цированного дыхания загрязненной почвы зависела от дозы вносимой нефти и менялась в течение периода наблюдения. Не обнаружено прямой зависимости Усид от начального содержания пол-лютанта. На 30 сутки инкубации максимальная активность почвенной микрофлоры выявлена при 20% загрязнении, тогда как на 270 сутки наибольшей активностью обладала почва с 10% исходным содержанием нефти (рис. 1Б).
Если в первые 180 суток эксперимента изменения У в опытных образцах имели немоно-
сид
тонный характер, то после 270 суток инкубации для всех нефтезагрязненных образцов была характерна общая тенденция - снижение скорости субстрат-индуцированного дыхания во времени. Через 730 суток величина Усид загрязненных почв незначительно отличалась от показателей У чи-
сид
стой почвы (рис. 1Б).
В первые 30 суток эксперимента значения Qг опытных образцов варьировали в диапазоне, характерном для устойчиво функционирующих почвенных микробоценозов - 0.22-0.27 (Благо-датская и др., 1995), что, вероятно, определяется пролонгированной ответной реакцией микробного сообщества на поступление токсичного и богатого органическим веществом субстрата.
На 90 сутки эксперимента разбалансирован-ность микробных процессов была зарегистрирована в варианте, исходно содержавшем 20% нефти, на 180 сутки негативное влияние проявлялось и при более низких дозах поллютанта (рис. 1В). При исходном содержании поллютанта 5% наиболее сильное воздействие на почвенный биоценоз наблюдалось на 180-270 сутки эксперимента. К 360 суткам инкубации значения Qг данных загрязненных образцов снижались до 0.43, а к 730 суткам до 0.40.
Наиболее значительное отрицательное действие нефтяных компонентов, приводящее к снижению устойчивости микробного пула, в вариантах с исходным загрязнением 10-20% наблюдалось на 365 сутки инкубации 0.62-1.21). Дальнейшее увеличение времени экспозиции до 730 суток приводило к снижению разбалансиро-ванности биохимических процессов в исследуемых образцах почв.
Значения Qr к концу эксперимента характеризовали все опытные почвенные образцы, как испытывающие негативное действие нефтяных компонентов.
Микробиологический состав почв Для почвенных микроорганизмов нефтяные углеводороды с одной стороны являются токсикантами, с другой - источником питания. Именно поэтому их поступление в почву может приводить как к повышению активности, так и к ингибиро-ванию и деградации микробного пула. Ответная реакция микробного пула на присутствие поллю-танта определяется типом почвы, содержанием нефти и характеристиками разных групп почвенных микроорганизмов (Гилязов, Гайсин, 1993; Кузнецова и др., 2016).
Данные о составе основных групп микроорганизмов являются важными характеристиками, позволяющими оценить состояние микробоце-ноза, потенциальную способность загрязненной нефтью почвы к самовосстановлению, судить о процессах деструкции поллютантов при проведении рекультивационных мероприятий.
Проведенные исследования показали, что внесение нефти в почву стимулировало развитие практически всех исследованных групп почвенных микроорганизмов, за исключением целлюло-зоразрушающих.
Анализ изменения содержания отдельных групп микроорганизмов во времени показал, что основные адаптационные изменения в микробном пуле при нефтяном загрязнении почв происходят в первый год после внесения поллютанта (рис. 2).
В варианте с 5% содержанием нефти пик общей численности микроорганизмов наблюдался на 90 сутки эксперимента (в 5.3 раза выше, чем в контроле). При более высоком содержании пол-
40 -35 -30 -25 -
о 20 "
га
* 15 -10 -5 0
-ОМЧ
-УОМ
-ММ
-АМ
-БУМА
-ЦРМ
-5
0 100 200 300 400 500 600 700 800 Время, сутки
Рис. 2. Средняя численность микроорганизмов в серой лесной почве при начальном содержании нефти до 15% (кратность отклонения относительно контроля, раз)
лютанта (10-20%) массовое развитие микроорганизмов было выявлено на 180 сутки (в 10-13 раз выше, чем в контроле). При увеличении времени инкубации к 365 суткам во всех опытных вариантах наблюдалось достаточно равномерное снижение ОМЧ. К 730 суткам эксперимента в опытных вариантах общая численность микроорганизмов была в 1.8-2.0 раза ниже, чем в контроле.
Присутствие нефти в почве приводило к закономерному увеличению количества углеводо-родокисляющих микроорганизмов. К 30 суткам эксперимента в варианте 5% их численность превышала контроль в 9.8 раз, в остальных опытных вариантах - в 3.3-4.0 раза. Если в варианте, исходно содержавшем 5% нефти, к 270 суткам эксперимента потребление субстрата приводило к снижению содержания УОМ до значений, в 1.5 раза превышающих контроль, то при более высоком содержании поллютанта именно в этот момент наблюдался рост численности активных окислителей углеводородов (в 6-10 раз выше, чем в контроле).
Содержание микромицетов в опытных вариантах начиная с 90 суток увеличивалось и достигало максимума к 270 суткам эксперимента (в 12-46 раз выше, чем в контроле). Всплеск численности микромицетов, вероятно, связан с повышением доступности алифатических и ароматических углеводородов нефти, являющихся источником их питания (Heath, 1993; Solano-Serena, 1998; Ки-реева и др., 2003). На более поздних сроках эксперимента (365-730 сутки) количество выделенных микромицетов в опытных вариантах была сопоставимо или несколько ниже, чем в контроле.
Активное развитие актиномицетов было зарегистрировано в интервале между 180-270 сутками инкубации и характеризовалось 4.3-13.9-кратным превышением их содержания относительно контрольного варианта. Как и в случае с микро-мицетами, к концу эксперимента количество ак-тиномицетов снизилось до уровня контроля.
В первые 365 суток после загрязнения почвы нефтью наблюдалось увеличение содержания бактерий, усваивающих минеральный азот, что связано с интенсивным протеканием процессов минерализации органического вещества. Следует отметить, что коэффициент минерализации во всех опытных вариантах, начиная с 365 суток эксперимента, был выше, чем в контроле, что свидетельствует об активизации процессов биотрансформации углеводородов и связывания свободного азота почвы.
Как и ожидалось, высокая чувствительность целлюлозоразрушающих микроорганизмов к нефтяным загрязнениям привела к снижению их
численности в опытных вариантах, что согласуется с ранее полученными данными (Благодатская и др., 2015). Следует отметить, что их численность не восстановилась даже к концу двухлетнего эксперимента.
Анализ усредненных данных динамики микробного пула показал, что при содержании в почве до 15% нефти наиболее активное развитие исследованных групп микроорганизмов было разделено во времени в интервале между 90 и 365 сутками инкубации (рис. 2). На второй год эксперимента численность почвенных микроорганизмов в нефтезагрязненных пробах снижалась и, в большинстве случаев, приближалась к их численности в контроле. Однако в опытном варианте при максимальном испытанном содержании нефти (20%) и через 730 суток инкубации было зарегистрировано двадцатикратное превышение численности УОМ относительно контроля.
Изменение содержания нефтепродуктов в почве
Проведенный после внесения нефти анализ показал, что при использовании стандартной методики определения нефтепродуктов (ПНД Ф 16.1.2.2.22-98) их содержание составляет 22-25% от количества, внесенной в почву нефти.
Мониторинг нефтепродуктов в почве с высоким уровнем достоверности продемонстрировал, что в первые 365 суток снижение их содержания в вариантах 5% и 10% имело линейную, а в вариантах 15% и 20% полиномиальную зависимость.
В вариантах 15% и 20% наиболее интенсивное снижение содержания нефтепродуктов было зарегистрировано в первые 180 суток эксперимента (на 35.6 и 41.2%, соответственно). К концу эксперимента остаточное содержание нефтепродуктов варьировало от 36.8% (вариант 5%) до 43.2-46.6% от исходного в вариантах с содержанием нефти 10-20%.
Выводы
1. В загрязненной нефтью серой лесной почве усиливается интенсивность эмиссии СО2 и увеличивается численность микроорганизмов.
2. Все основные адаптационные процессы в почвенном микробном сообществе происходят в первый год после загрязнения почвы нефтью.
3. Уровень дыхательной активности и пики численности отдельных групп микроорганизмов определяются начальным содержанием нефти и временем воздействия поллютанта на почвенный микробоценоз.
4. Значения коэффициента микробного дыхания показали, что негативное воздействие нефтяных компонентов на микробный пул проявля-
2/2018
29
лось начиная с 90 суток при содержании нефти 20%, с 180 суток при содержании 5-15% и сохранялось во всех опытных вариантах до конца эксперимента.
5. Остаточное содержание нефтепродуктов в почве через 730 суток их инкубации в условиях периодического перемешивания и увлажнения составляло 36.8-46.6% от исходного.
Список литературы
1. Ананьева Н.Д., Благодатская Е.В., Орлинский Д.Б., Мякшина Т.Н. Методические аспекты определения скорости субстрат-индуцированного дыхания почвенных микроорганизмов // Почвоведение. 1993. № 11. С. 72-77.
2. Благодатская Е.В., Ананьева Н.Д., Мякшина Т.Н. Характеристика состояния микробного сообщества почвы по величине метаболического коэффициента // Почвоведение. 1995. №2. С. 205-210.
3. Вершинин А.А., Петров А.М., Акайкин Д.В., Игнатьев Ю.А. Оценка биологической активности дерново-подзолистых почв разного гранулометрического состава в условиях нефтяного загрязнения // Почвоведение. 2014. №2. С. 250-256.
4. Гилязов М.Ю., Гайсин И.А. Агроэкологическая характеристика и приемы рекультивации нефтезагрязненных черноземов Республики Татарстан. Казань: Фэн, 2003. 228 с.
5. Звягинцев Д.Г. Методы почвенной микробиологии и биохимии. М.: Изд-во МГУ, 1991. 304 с.
6. Каримуллин Л.К., Петров А.М., Вершинин А.А., Шур-мина Н.В. Физиологическая активность почв при разных уровнях нефтяного загрязнения // Известия Самарского научного центра РАН. 2015. Т.17. № 4. С. 797-803.
7. Киреева Н.А., Водопьянов В.В., Мифтахова А.М. Биологическая активность нефтезагрязненных почв. Уфа: Ги-лем, 2001. 376 с.
8. Кузнецова Т.В., Петров А.М., Князев И.В., Хабибуллин Р.Э. Состав микробных сообществ при разном содержании нефтепродуктов в серых лесных почвах // Вестник технологического ун-та. 2016. Т. 19. № 14. С. 165-168.
9. Киреева Н.А., Бакаева М.Д., Галимзянова Н.Ф. Влияние возрастающих концентраций нефти на микромицеты в выщелоченном черноземе // Микология и фитопатология. 2003. Т 3, №2. С. 53-59.
10. Петров А.М., Вершинин А.А., Каримуллин Л.К.,
Акайкин Д.В., Тарасов О.Ю. Динамика эколого-биологиче-ских характеристик дерново-подзолистых почв в условиях длительного нефтяного загрязнения // Почвоведение. 2016. №7. С. 848-856.
11. ПНД Ф 16.1.2.2.22-98.Методика выполнения измерений массовой доли нефтепродуктов в минеральных, органогенных, органо-минеральных почвах и донных отложениях методом ИК-спектрометрии.
12. Anderson T.-H., Domsch K.H. The metabolic quotient for CO2 (q CO2) as a specific activity parameter to assess the effect of environmental conditions, such as pH, on the microbial biomass of forest soils // Soil Biol. Biochem. 1993. V25. № 3. Р. 393-395.
13. Heath J.S. Review of chemical, physical and toxicologic properties of components of total petroleum hydrocarbons// Journal of Soil Contamination. 1993. №2. Р. 548-611.
14. Solano-Serena F., Marchal R., Blanchet D., Vande-casteele J.P. Intrinsic capacities of soil microfloras for gasoline degradation // Biodegradation. 1998. № 9. Р. 319-326.
Petrov A.M., Vershinin A.A., Karimullin L.K., Kuznetsova TV. Biological activity and microbial community composition of gray forest soil under long-term exposure of oil pollution.
Dynamics of respiration and enzyme activity, microbial abundance of different groups of microbes in grey forest light loamy soil under long-term exposure of oil pollution with different initial pollutant concentrations were assessed. The results show increase in C02 emission intensity and microbial abundance upon oil pollution. Main adaptation processes in mi-crobial community of soils are likely to occur during the first year after oil pollution. Levels of respiration activity and microbial abundance peaks of different microbial groups are dependent on initial oil concentration and duration of pollution effect on microbial community.
Keywords: oil; grey forest soil; soil respiration; enzyme activity; soil microbial community; mineralization of oil products.
