CC BY
387
БИОХИМИЯ И БИОТЕХНОЛОГИЯ
УДК 631.46
А. А. Вершинин, А. М. Петров, Ю. А. Игнатьев,
Р. Р. Шагидуллин
ДЫХАТЕЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ ДЕРНОВО-КАРБОНАТНОЙ ПОЧВЫ, ЗАГРЯЗНЕННОЙ ДИЗЕЛЬНЫМ ТОПЛИВОМ
Ключевые слова: дизельное топливо, почвенные ценозы; базальное дыхание; субстрат-индуцированное дыхание; углерод микробной биомассы; коэффициент микробного дыхания.
Загрязнение дерново-карбонатной почвы дизельным топливом приводило к усилению дыхательной активности, увеличению содержания микробной биомассы и снижению устойчивости микробного пула. Реакция микробного сообщества на 3-5% содержание дизельного топлива происходила на ранних этапах загрязнения, тогда как более высокие концентрации первоначально оказывали ингибирующее действие на почвенную микрофлору. Почвенная биота способна трансформировать загрязнитель в диапазоне концентрации до 15%. Содержание в почве дизельного топлива, превышающее эту величину, является критическим для почвенных ценозов.
Key words: diesel fuel; soil cenosis; carbon of microbial biomass; basal respiration; substrate-induced respiration;
microbial respiration quotient.
Pollution of calcareous soil by diesel fuel resulted in enhancement of respiration activity, increased microbial biomass and decreased sustainability of microbial pool. Response of microbialcenosis to small concentrations of diesel fuel (3-5%) was registered at early steps of pollution, whereas medium and high concentrations initially inhibited soil microbialcenosis. Soil biota is capable of transforming the pollutant within the range of concentrations before 15%. The amount of diesel fuel exceeding this value is critical for soil cenosis.
Введение
Минерализация углеводородов нефти и продуктов ее трансформации осуществляется в почве в результате жизнедеятельности комплекса почвенных микроорганизмов, обеспечивающих снижение и снятие их токсичности. Определение самоочищающей способности нефтезагрязненных почв прогнозирование сроков восстановления их свойств требует учета показателей, которые бы в наибольшей степени характеризовали биологическую активность микробных сообществ. Такими интегральными показателями могут служить ферментативная и дыхательная активность - показатели интенсивности микробиологических процессов [1-3].
Параметры почвенного дыхания дают представление о микробиологической активности, запасах питательных веществ и устойчивости системы микробного пула, позволяя тем самым определить экологическое состояние почв и установить перечень мероприятий по ее скорейшей и эффективной рекультивации [1,4-6].
Нефть и продукты ее переработки по-разному влияют на почвенную микрофлору. Известно, что наименьшее снижение микробиологической активности происходило при внесении в почву моторного масла и дизельного топлива. Наиболее угнетающее воздействие на активность почвенного микробного сообщества оказывало внесение бензина и некоторых компонентов ракетного топлива [4]. Способность почв к преодолению негативного влияния углеводородов (УВ) нефти зависит от ее типа, состава аборигенной микрофлоры, начальной дозы и длительности воздействия загрязнителя, а также характера растительности на поверхности почвы [2,4,7]. Эти факторы необходимо учитывать при планировании и проведении восстановительных мероприятий.
Цель исследований заключалась в изучении влияния различных начальных концентраций дизельного топлива на динамику дыхательной активности микробиоценоза дерновокарбонатной почвы.
Экспериментальная часть
Исследования проводились в модельных лабораторных опытах. Дерново-карбонатная почва, была отобрана с горизонта 0-15 см на границе ООПТ «Дачный» в Верхнеуслонском районе РТ. Почвенные пробы освобождали от посторонних включений и корешков и просеивали через сито с диаметром ячеек 2 мм. При проведении экспериментов влажность почвы поддерживали на уровне 60% полной влагоемкости, температуру в интервале от 18 до 23 °С.
Образцы почвы загрязняли дизельным топливом в диапазоне исходных концентраций 3-20%. В качестве контроля использовали не загрязненную почву.
В начале и в ходе эксперимента в образцах определяли влажность [8] и содержание нефтепродуктов [9].
Определение скорости базального дыхания (Vbasai). В пенициллиновые флаконы помещали по 2 г почвы, инкубировали при 25оС в течение 2 часов, а затем проветривали в течение 30 мин. Во флаконы добавляли 0,5 мл воды, герметично закрывали и инкубировали при 25оС. Продолжительность инкубации варьировала от 24 до 48 часов в зависимости от интенсивности выделения СО2.
Величину субстрат-индуцированного дыхания (Vsir) устанавливали согласно рекомендациям [10]. Во флаконы помещали навеску почвы (2 г.) и прединкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре. После проветривания в течение 1 ч. во флаконы добавляли по 0,5 мл 4,0% раствора глюкозы (10 мг/г почвы). Длительность инкубации флаконов с обогащенной субстратом почвой составляла 3 часа. В этот период скорость Vsir была максимальной.
Интенсивность почвенного дыхания устанавливали газохроматографическим методом [11]. Концентрацию СО2 определяли на газовом хроматографе Chrom 5. Колонка длиной 1,2 м, внутренним диаметром 3 мм с Porapak Q (0,15-0,20 мм). В качестве детектора использовали катарометр. Повторность измерений 3-кратная. Скорость дыхания выражали в мкг СО2/г сухой почвы в час.
Содержание углерода микробной биомассы (CMic ) рассчитывали по уравнению: CMic (мкг/г) =
Vsir(m^ сО2/г час) х 40,04 + 0,37 [12].
Коэффициент микробного дыхания (Qr) вычисляли исходя из показателей базального и субстрат-индуцированного дыхания по формуле: QR = Vbasal/VSIR [13].
Полученные результаты обработаны статистически при помощи программы Microsoft Excel.
Результаты и обсуждение
После загрязнения почвы нефтепродуктами, происходит снижение концентрации поллютанта, обусловленное абиотическими (испарение, воздействие ультрафиолетового излучения, связывание почвенными частицами и др.) и биологическими факторами. В нашем случае, при 20% исходном содержании дизельного топлива, через 3 месяца содержание нефтепродуктов в почве снизилось со 185,3 г/кг до 36,3 г/кг (в 5,1 раза). Максимальное снижение концентрации углеводородов за время экспозиции зафиксировано при самой низкой начальной концентрации дизельного топлива (3%) - в 81,2 раза. В остальных опытных
вариантах за 90 дней эксперимента содержание нефтепродуктов снижалось в 8,2 - 53,6 раз (рис.1).
В загрязненных нефтепродуктами почвах интенсивность дыхания может увеличиваться, что связано с повышением численности, в первую очередь, углеводородокисляющих микроорганизмов, или, может снижаться, что определяется интоксикацией почвенной микрофлоры. Повышение скорости дыхания свидетельствует о физиологической активности микроорганизмов в загрязненных почвах и характеризует высокую скорость окислительно-восстановительных процессов.
Базальное дыхание отражает интенсивность минерализации органических веществ в почве. Его динамика в значительной степени зависела от исходной концентрации дизельного топлива. При «низких» дозах углеводородов - 3 и 5% скорость Vbasal. уже на 3 день резко возрастала. Однако, если в варианте с 5% исходным загрязнением интенсивность Vbasal и продолжала увеличиваться в течение четырнадцати дней после внесения дизельного топлива,
то в варианте с 3% содержанием нефтепродукта уже на 3-и сутки наблюдалось снижение интенсивности базального дыхания (рис.2), вероятно, из-за уменьшения концентрации нефтяных углеводородов являющихся энергетическим субстратом для почвенной микрофлоры.
Рис. 1 - Динамика содержания нефтепродуктов в дерново-карбонатной почве
Рис. 2 - Динамика базального дыхания (Vbasal) контрольного и опытных образцов почвы
После преодоления стресса, обусловленного внесением высоких доз дизельного топлива (10-20%) и адаптации, микробные сообщества почвы ответили всплеском активности
Vbasal. Максимум базального дыхания для всех испытанных концентраций поллютанта был зафиксирован на 14 сутки. В последующем интенсивность эмиссии СО2 почвой неуклонно снижалась, но на протяжении всего эксперимента оставалась выше фоновых значений. При этом различия скорости базального дыхания исследуемых вариантов во времени в значительной степени нивелировались. По мнению ряда авторов [2] снижение интенсивности
дыхания указывает на замедление процессов минерализации УВ и на преобладание других процессов, с которыми связан распад углеводородов - окисление, соокисление, конденсирование.
В начальной фазе после внесения нефтепродукта субстратное-индуцированное дыхание, характеризующее потенциальную активность микробного сообщества почвы, в варианте с 3% начальным содержанием дизельного топлива было на уровне контроля, в остальных вариантах ниже. Максимум в вариантах с 5 и 10% начальным содержанием изучаемого вещества отмечен через 14 суток. В случае, когда первоначальное содержание загрязнения составляло 15-20%, пик интенсивности Узш. сдвигался к тридцатым суткам эксперимента. По истечении 3 месяцев потенциал микробного сообщества в вариантах 10 и 15% оставался выше, чем в незагрязненной почве, при 20%-ном начальном загрязнении уровень субстратного-индуцированного дыхания был ниже, чем в контроле (рис.3).
Рис. 3 - Динамика субстрат-индуцированного дыхания (Уэ^) контрольного и опытных образцов почвы
К числу значимых эколого-физиологических показателей, отражающих состояние почв, относится содержание углерода микробной биомассы Смцс- Высокие дозы дизельного топлива первоначально приводили к снижению содержания микробного углерода в почве (табл. 1). Однако, через 10-14 суток, эта величина в вариантах 3, 5, 10 и 15% уже превышала концентрацию углерода микробной массы контрольного образца соответственно в 1,6, 1,7, 1,2 и 1,1 раза. При 3% исходном загрязнении почвы через 14 суток инкубации содержание Сшс в почве достигало 1165,1 мкг С/г почвы, что в 2 раза превышало его концентрацию в контрольном образце. Через 3 месяца экспозиции загрязненных образцов, во всех вариантах, за исключением 20%, концентрация микробного углерода была выше (10 и 15%) или на уровне (3 и 5%) контрольного варианта.
Таким образом, в исследуемом диапазоне концентраций, по мере адаптации, происходило увеличение количества активных микробных клеток (соответственно увеличивался и потенциал почвенного микробного сообщества). Динамика этого процесса была различной, и зависела от начальной концентрации дизельного топлива.
Интегральным показателем, отражающим состояние почв, является коэффициент микробного дыхания (Оя). Его величина дает представление о запасах питательных веществ в почве, устойчивости системы микробного сообщества, отражает степень антропогенного или
климатического воздействия на почвенные ценозы [1,3,6,12].Величина Оя почв естественных биоценозов при оптимальных климатических условиях располагается в интервале значений
0,1-0,2. Значения меньше 0,1 отражают недостаток питательных веществ в почве. Величины, превышающие 0,2-0,3 свидетельствуют о неблагоприятных антропогенных или климатических воздействиях. Более высокие (приближающиеся к 1,0 и выше), указывают на интенсивные процессы разложения органики в почве [3,12].
Таблица 1 - Содержание углерода микробной биомассы (Смк ) в контрольном и опытных образцах почвы (мкг С/г почвы)
Исходная концентрация НП Длительность экспозиции (сутки)
3 14 30 90
Контроль 546,6 723,1 734,3 459,2
3% 567,3 1165,1 902,1 438,4
5% 489,7 1223,0 1039,8 457,2
10% 225,0 855,6 834,4 578,1
15% 307,9 783,6 1002,6 517,7
20% 314,9 592,2 1007,0 368,7
Реакция почвенных микроорганизмов на «низкие» дозы поллютанта (3 и 5%) проявилась на ранних стадиях загрязнения почвы - уже на 3 сутки Ор увеличился в 7-8 раз. Однако, вслед за этим последовало быстрое уменьшение его величины (рис. 4). Природа снижения коэффициента микробного дыхания обусловлена, в первую очередь, резким увеличением скорости субстрат-индуцированного дыхания и некоторым снижением интенсивности базального дыхания. Это указывает на то, что почвенная микрофлора значительно активизируется, а содержание питательных субстратов в почве уменьшается.
1 ? и
}-ч 1 —
СУ
1.0 -0.8 -0.6 -
0.4 -0.2 -
0.0 -
0 20 40 60 80 Сутки
Рис. 4 - Динамика коэффициента микробного дыхания (Ор) контрольного и опытных образцов почвы
Ответ почвенного микробного сообщества на средние и высокие дозы дизельного топлива был иным. В первые дни после внесения нефтепродукта не наблюдалось заметного изменения значений QR, но к 14 дню эксперимента коэффициент микробного дыхания возрос в 8-10 раз в сравнении с контрольной почвой. В ходе сукцессии изменение величины QR почвы загрязненной высокими дозами дизельного топлива определялись, главным образом, изменением скорости базального дыхания. Субстрат-индуцированное дыхание менялось не столь существенно. В контроле коэффициент микробного дыхания оставался на уровне 0,1 (рис. 4).
Заключение
Внесение в дерново-карбонатную почву дизельного топлива в диапазоне концентраций 3-20% способствовало усилению минерализации органических веществ и увеличению содержания углерода микробной биомассы, а, следовательно, возрастанию потенциала микробного пула почвы. Низкие концентрации дизельного топлива (3%) оказывали стимулирующее действие на сообщество почвенных микроорганизмов. Реакция микробного сообщества на «низкие» дозы дизельного топлива (3-5%) происходила на первых этапах после загрязнения, тогда как средние и высокие дозы поллютанта (10-20%) первоначально оказывали ингибирующее действие на почвенную микрофлору и требовали определенного периода для адаптации почвенной микрофлоры. Внесение дизельного топлива в почву, особенно в высоких концентрациях, приводит к нарушению гомеостаза, разбалансировки обменных процессов, снижает устойчивость микробного сообщества.
Наиболее эффективно дизельное топливо разлагалось при исходной концентрации 3%. Почвенная биота способна трансформировать загрязнитель в концентрации до 10-15%. Начальное содержание в почве дизельного топлива, превышающее данную величину, является критическим для почвенных биоценозов.
Литература
1. Ананьева, Н.Д. Оценка устойчивости микробных комплексов почв к природным и антропогенным воздействиям / Н.Д. Ананьева, Е.В. Благодатская, Т.С. Демкина // Почвоведение. - 2002. - №5. -С.580-587.
2. Киреева, Н.А. Биологическая активность нефтезагрязненных почв/ В.В. Водопьянов, А.М. Мифтахов. - Уфа: Гилем, 2001. -376 с.
3. Закиров, Р.К. Ферментативная диагностика промышленных илов в процессах продленной аэрации сточных вод / Р.К. Закиров, Ф.Ю.Ахмадуллина, И.В.Вербенко, А.С. Сироткин // Вестник Казан. технол. ун-та. - 2009. -№2. -С. 33-41.
4. Благодатская, Е.В. Характеристика состояния микробного сообщества почвы по величине метаболического коэффициента / Е.В. Благодатская, Н.Д.Ананьева, Т.Н. Мякшина // Почвоведение. -1995. - №2.- С.205-210.
5. Полянская, Л.М. Содержание и структура микробной биомассы как показатель экологического состояния почв / Л.М. Полянская, Д.Г. Звягинцев // Почвоведение.- 2005. - № 6.- С.706-714.
6. Anderson, T.-H. Application of eco-physiological quotient CO2 (q CO2 and qD) on microbial biomasses from soil of different cropping histories / T.-H. Anderson, K.H. Domsch // Soil Biol. Biochem. - 1990. -V.22. - №2.- P.251-255.
7. Благодатская, Е.В. Оценка устойчивости микробных сообществ в процессе разложения поллютантов в почве / Е.В. Благодатская., Ананьева Н.Д. // Почвоведение. - 1996. - №11. - С.1341-1346.
8. ГОСТ 28268-89 Почвы. Методы определения влажности, максимальной гигроскопической влажности и влажности устойчивого завядания растений. - Введ. 01.06.90.- М.: Стандартинформ, 2006.- 7с.
9. Методика выполнения измерений массовой доли нефтепродуктов в минеральных, органоминеральных почвах и донных отложениях методом ИК-спектрометрии. ПНД Ф 16.1:2.2.22-98 М., 2005. 18 с.
10. Ананьева, Н.Д. Методические аспекты определения скорости субстрат-индуцированного дыхания почвенных микроорганизмов / Н.Д. Ананьева Е.В. Благодатская, Д.Б. Орлинский, Т.Н. Мякшина // Почвоведение.- 1993.- №11.- С.72-77
11. Газовая хроматография в биологическом мониторинге почвы / Гарусов А.В [и др. ] - Казань: Изд-во КГУ, 2006. - 90 с.
12. Anderson, T.-H. A physiological method for the quantitative measurement of microbial biomass in soils / T.-H. Anderson, K.H. Domsch // Soil Biol. Biochem. - 1978. - V.10. - №3. - Р.215-221.
13. Anderson, T.-H. The metabolic quotient for CO2 (q CO2) as a specific activity parameter to assess the effect of environmental conditions, such as pH, on the microbial biomass of forest soils / T.-H. Anderson K.H. Domsch // Soil Biol. Biochem. - 1993. - V.25. - №3. - Р.393-395.
© А. А. Вершинин - канд. биол. наук, ст. науч. сотр. лаб. экологических биотехнологий;
Государственного бюджетного учреждения Институт проблем экологии и недропользования
Академии наук Республики Татарстан, A-vershinin@mail.ru; А. М. Петров - канд. биол. наук, зав. лаб. экологических биотехнологий Государственного бюджетного учреждения Институт проблем экологии и недропользования Академии наук Республики Татарстан, zpam2@rambler.ru; Ю. А. Игнатьев - канд. хим. наук, ст. науч. сотр. лаб. эколого-аналитических измерений и мониторинга окружающей среды Государственного бюджетного учреждения Институт проблем экологии и недропользования
Академии наук Республики Татарстан; Р. Р. Шагидуллин - канд. физ.-мат. наук, дир. Государственного бюджетного учреждения Институт проблем экологии и недропользования Академии наук Республики Татарстан.
