CC BY
32
ОБЩАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 631.46
Т. В. Кузнецова, А. М. Петров, Р. Э. Хабибуллин
ДИНАМИКА МИКРОБНОГО ПУЛА ДЕРНОВО-ПОДЗОЛИСТЫХ ПОЧВ
ПРИ РАЗНЫХ НАЧАЛЬНЫХ УРОВНЯХ НЕФТЯНОГО ЗАГРЯЗНЕНИЯ
Ключевые слова: нефть, нефтепродукты, почвенное микробное сообщество, дерново-подзолистые почвы,
гранулометрический состав.
Изучена динамика микробного пула дерново-подзолистых супесчаных и среднесуглинистых почв при разных начальных уровнях нефтяного загрязнения. В ходе 365-ти суточного эксперимента показано, что изменение численности различных групп микроорганизмов в нефтезагрязненных почвах определяется исходной концентрацией поллютанта и гранулометрическим составом почвы. Среднесуглинистая почва способна преодолевать негативное влияние более высоких концентраций нефтяных загрязнений. Скорость минерализации нефтепродуктов в дерново-подзолистой среднесуглинистой почве выше, чем в супесчаной.
Key words: oil, oil products, microbial community, soddy-podzolic soils, soil texture.
Changes in the microbial pool of loamy-sandy and loamy soddy-podzolic soils with different initial levels of oil contamination were studied. During a 365-day experiment it was shown that the change in the population of different groups of microorganisms in oil-contaminated soils is determined by the initial pollutant concentration and soil texture. Loamy soddy-podzolic soil can overcome negative effects of higher concentration of oil pollutants. The speed of oil products mineralization in loamy soddy-podzolic soil is higher than in loamy-sandy soil.
Введение
Возврат почв после нефтяного загрязнения в хозяйственный оборот является сложной экологической проблемой. Токсические свойства нефтяных углеводородов, их низкие действующие концентрации, приводят к изменению физико-химических свойств, снижению плодородия почв, деградации почвенного микробиоценоза. Элиминация нефти и продуктов ее трансформации из почв сложный физико-химический и биохимический процесс, скорость и направленность которого зависит от комплекса факторов, таких как, характеристики среды, концентрация нефти, тип и гранулометрический состав почвы, устойчивость почвенных микроорганизмов к поллютанту.
Важным условием биологического
самоочищения почвы от нефти является уровень функциональной активности почвенной
микрофлоры. Почвенное микробное сообщество выполняет две важные функции: - участвует в круговороте органического вещества и биогенных элементов, - обеспечивает удаление поллютантов. Почвенный микробоценоз структурно представлен различными эколого-трофическими группами микроорганизмов [1,2]. Определение таких характеристик, как численность, динамика физиологических групп микроорганизмов является важным инструментом для объяснения происходящих в почве процессов. Именно поэтому сопоставление экспериментально полученных микробиологических характеристик позволяет оценить способность почв к самоочищению, сделать вывод о последствиях воздействия нефтяных загрязнений на почвенные сообщества.
Согласно литературным данным, попадание нефти в почву приводит к повышению численности
практически всех систематических групп микроорганизмов [3-5]. Численность
целлюлозоразрушающих микроорганизмов в присутствии нефтяного загрязнения снижается [6]. На численность микроорганизмов в загрязненных почвах влияют интенсивность и длительность загрязнения, свойства нефти и почв [7,8].
В проведенных Киреевой с соавторами многолетних полевых и лабораторных исследованиях показано, что при содержании в почве нефтяных углеводородов более 10% большинство типов нефти негативно влияет на численность почвенных микроорганизмов [9]. Более низкие дозы поллютанта способствовали бурному развитию углеводородокисляющей микробиоты и приводили к росту численности грибов и бактерий. Изменение численности микроорганизмов в этом случае не было напрямую связано с токсическими свойствами почвы, а изменение численности до исходных значений совпадало с моментом завершения процессов активного разложения легкодоступных для микроорганизмов нефтяных фракций.
Цель работы - изучение влияния длительного воздействия разных доз нефтяного загрязнения на численность микроорганизмов в супесчаных и среднесуглинистых дерново-подзолистых почвах.
Экспериментальная часть
В лабораторных экспериментах были использованы дерново-подзолистые (ДП) супесчаная (СП) и среднесуглинистая (СГ) почвы (табл. 1).
Из предварительно подсушенных почв удалялись корни, остатки растений. Образцы просеивались через сита Винклера с диаметром ячеек 1 мм.
Опытные образцы с заданным содержанием поллютанта готовились путем внесения в почвы весовым методом различных количеств сернистой нефти Ямашинского месторождения Республики Татарстан. Нефть в исследуемые почвы вносили с учетом их сорбционной емкости.
Таблица 1 - Физико-химические характеристики дерново-подзолистых почв
Почва Гумус, % P 1 подв Кподв pH водн. NB„, % Содержание фракций (мм), %
мг/100г 1,00,25 0,250,05 0,050,01 <0,01
СП 2,7 12,5 17,2 6,4 0,09 45,1 22,7 15,0 17,2
СГ 6,4 13,1 23,1 5,9 0,25 3,0 21,3 40,2 35,7
В экспериментах с ДП супесчаной почвой использовались опытные образцы, исходно содержавшие 2,4%, 4,8%, 9,0%, 13,0%, с ДП среднесуглинистой, образцы, содержавшие 4,8%, 7,1%, 9,0%, 13,0%, 16,6%, 20,0% нефти. Контролем служили чистые почвы.
Опытные и контрольные образцы инкубировали в течение 365 суток при влажности 60% от полной влагоемкости почвы и температуре 20-24оС. Для оптимизации факторов среды (влажность, температура, массообмен) еженедельно
проводилось рыхление контрольных и опытных почвенных образцов.
Микробиологический анализ почвенных образцов проводили на 7, 30, 180 и 365 сутки эксперимента. Численность физиологических групп микроорганизмов определяли стандартными методами [10]. Общую микробную численность (ОМЧ) определяли на питательном агаре. Количество углеводородокисляющих
микроорганизмов (УОМ) оценивали на агаризованной среде Ворошиловой-Диановой, используя в качестве источника углерода дизельное топливо, микромицеты учитывали на кислой среде Чапека, аэробные целлюлозоразрушающие микроорганизмы на среде Гетчинсона. Численность исследуемых групп выражали в КОЕ/г абсолютно-сухой почвы. Полученные результаты обработаны при помощи программы Microsoft Excel.
На 1, 7, 30,180 и 365 сутки эксперимента в опытных образцах почв проводили определение суммарного содержания нефтепродуктов (НП) ИК-спектрометрическим методом на анализаторе КН-2м согласно ПНД Ф 16.1:2.2.22-98 [11].
Результаты и обсуждение
В окружающей среде и, соответственно, в почве, всегда присутствуют факультативные
биодеструкторы нефтяных компонентов и продуктов их метаболизма, активность которых, в первую очередь, определяется наличием доступного субстрата, их устойчивостью к конкретным концентрациям токсичных компонентов. Фактически внесение значительных доз нефти в почву может рассматриваться как одномоментное обогащение источником углерода и энергии. Факт роста численности общего количества
микроорганизмов в составе исследуемых почв подтвердили полученные результаты, которые показали, что на 7 сутки после внесения нефти в ДП среднесуглинистую почву при всех испытанных концентрациях наблюдалось 27-45-кратное увеличение численности сапрофитной микрофлоры (рис. 1).
50
45 40
0 "
0 100 200 300 400
Время, сутки
Рис. 1 - Динамика общей численности микроорганизмов в ДП среднесуглинистой почве в зависимости от начального содержания нефти и длительности ее воздействия (кратность отклонения от контроля, раз)
Хотя на 30 сутки эксперимента численность микроорганизмов в опытных вариантах снижалась, их общее количество было 7,8-27,6 выше, чем в контроле. Снижение содержания НП в почве к 180 и 365 суткам эксперимента (табл. 2), приводило к уменьшению ОМЧ (рис. 1). При высоких концентрациях субстрата падение численности гетеротрофных микроорганизмов наблюдалось на более поздних сроках эксперимента. Через год инкубации общая численность микроорганизмов относительно контроля варьировала в интервале от 90% в варианте, исходно содержавшем 4,8% нефти, до 420% в варианте содержавшем 13% поллютанта. Варианты с высоким остаточным содержанием НП в почве характеризовались более высокой численностью гетеротрофных микроорганизмов.
Ведущая роль в разрушении нефтяных загрязнений принадлежит углеводородокисляющим микроорганизмам. Количество присутствующих в почве УОМ в определенной мере отражает интенсивность процессов биодеградации нефти. В опытах на ДП среднесуглинистой почве после ее загрязнения нефтью численность УОМ закономерно увеличилась (рис. 2).
Максимальное количество деструкторов углеводородов в почве было выявлено на 30 сутки эксперимента в вариантах, исходно содержащих 4,8%, 7,1%, 16,6% и 20,0% нефти.
При увеличении времени инкубации какие-либо закономерности в изменении содержания углеводородокисляющих микроорганизмов в опытных вариантах не проявлялись. На 365 сутки эксперимента минимальное количество УОМ выделено из образцов с максимальным исходным содержанием нефти. Полученные данные в целом согласуются с ранее представленными результатами [12].
4,8% 7,1% 9,0% 13,0% 16,6% 20,0% Начальное содержание нефти
Рис. 2 - Динамика численности УОМ в ДП среднесуглинистой почве в зависимости от начального содержания нефти и длительности ее воздействия (кратность отклонения от контроля, раз)
Хотя внесение нефти в ДП супесчаную почву, как и в случае со среднесуглинистой, приводило к увеличению ОМЧ, ответная реакция микробного сообщества существенно отличалась. На 7 сутки эксперимента заметный рост ОМЧ был зарегистрирован только при начальном содержании нефти 2,4% (в 6,3 раза выше, чем в контроле). В остальных вариантах численность микроорганизмов превышала контроль не более, чем в 1,8 раза (рис. 3).
О 100 200 300 400
Время, сутки
Рис. 3 - Динамика общей численности микроорганизмов в ДП супесчаной почве в зависимости от начального содержания нефти и длительности ее воздействия (кратность отклонения от контроля, раз)
Более выраженный рост численности микроорганизмов в варианте, содержавшем 2,4% нефти определялся минимальным ингибирующим действием, присутствующего в почве комплекса загрязняющих веществ. Ингибирующее действие в вариантах содержащих 4,8% поллютанта и выше проявлялось и на 30 сутки эксперимента - ОМЧ в них было примерно в 2 раза ниже, чем в варианте с исходным содержанием нефти 2,4%.
Если в ДП среднесуглинистой почве, начиная с 30 суток эксперимента, наблюдалось снижение ОМЧ, то в супесчаной почве в вариантах 2,4 и 4,8% именно этот момент характеризовался максимальной численностью гетеротрофов. Снижение концентрации токсичных веществ в почве к 180 суткам эксперимента, перестройка микробного
сообщества способствовали увеличению численности сапрофитной микрофлоры в вариантах исходно содержавших 9,0 и 13,0% нефти. На 365 сутки эксперимента ОМЧ во всех опытных вариантах составляло 30-60% от контроля.
Как и в случае с ДП среднесуглинистой почвой, поступление нефтяного загрязнения в ДП супесчаную почву стимулировало рост численности деструкторов углеводородов (рис.4).
2,4% 4,8% 9,0% 13,0%
Начальное содержание нефти
Рис. 4 - Динамика численности УОМ в ДП супесчаной почве в зависимости от начального содержания нефти и длительности ее воздействия (кратность отклонения от контроля, раз)
В ДП супесчаной почве на 7 сутки эксперимента значительное увеличение численности УОМ было зарегистрировано только в варианте, содержащем 2,4% нефти. Рост численности УОМ при концентрациях нефти в почве 4,8% и выше был незначительным, превышения над контрольными вариантами составляли 1,2-1,8 раза. Увеличение времени инкубации до 30 суток характеризовалось ростом количества УОМ во всех вариантах. Причем, если при содержании нефти 4,8-13,0% численность УОМ увеличивалась в 5,0-8,7 раза, то при исходной концентрации поллютанта 2,4% превышение содержания УОМ над контролем составляло 29,3 раза, что определяется более активным массообменном при оптимальной влажности почвы и низкой концентрации токсичного субстрата.
На 180 сутки эксперимента численность УОМ во всех опытных вариантах имела сопоставимые значения. Снижение количества УОМ в варианте, содержавшем 2,4% нефти через 6 месяцев инкубации почв, вероятно, определяется уменьшением доли доступного углеродного питания. Исчерпание доступного для УОМ токсичного органического субстрата в данном варианте к 365 суткам эксперимента способствовало стабилизации состояния почвенного микробного сообщества, приведшей к снижению количества углеводородокисляющих микроорганизмов до их численности в контроле. На 365 сутки инкубации численность УОМ в вариантах с 4,8-13,0% содержанием нефти была ниже, чем в контроле, что может определяться накоплением токсичных продуктов ее трансформации.
Нефть, стимулируя развитие сапрофитных и углеводородокисляющих микроорганизмов,
действовала неоднозначно на другие группы
почвенного сообщества (целлюлозоразрушающие микроорганизмы, актиномицеты и микромицеты).
Загрязнение нефтью существенно снижало содержание в почвах целлюлозоразрушающих микроорганизмов. Следует отметить, что целлюлозоразрушающие микроорганизмы ДП супесчаной почвы оказались более чувствительными к нефтяному загрязнению. При концентрациях нефти 2,4 и 4,8% на 7 сутки эксперимента их численность составляла 50-70% от контроля, а при более высоких концентрациях поллютанта они полностью элиминировались из микробоценозов. На 180 сутки инкубации целлюлозоразрушающие микроорганизмы не обнаруживались и в варианте с исходным содержанием нефти 4,8% при снижении их численности до 16% от контроля в варианте 2,4%. Высокая чувствительность целлюлозоразрушающих микроорганизмов к присутствию нефтяных загрязнений согласуется с ранее полученными данными [13]. Через год инкубации почв, целлюлозоразрушающие микроорганизмы были обнаружены во всех опытных вариантах. Их содержание составляло 75, 25, 25 и 25% от контроля соответственно в вариантах исходно содержавших 2,4%, 4,8%, 9,0% и 13,0% нефти.
В ДП среднесуглинистой почве в ходе эксперимента целлюлозоразрушающие
микроорганизмы обнаруживались при всех испытанных концентрациях загрязнителя. На 7 сутки инкубации их численность варьировала от 24 до 67% от контроля. На 180 сутки эксперимента их численность снизилась и составляла 26%, 13%, 7%, 8%, 8% и 8% от контроля, соответственно в вариантах содержавших 2,4%, 4,8%, 7,1%, 9,0%, 13,0%, 16,6% и 20,0% нефти. К 365 суткам эксперимента численность целлюлозоразрушающих микроорганизмов составила 6% от контроля в варианте 4,8% и 1% при более высоких концентрациях поллютанта.
Присутствие нефти в ДП супесчаной почве оказывало угнетающее действие на микромицетов. Снижение их численности относительно контроля наблюдалось во всем испытанном диапазоне концентраций, как на начальном этапе (86-18% от контроля), так и на 180 сутки эксперимента (8027%). К 365 суткам численность микромицетов резко увеличилась, их содержание составляло 483%, 550%, 1617% и 4233%, соответственно в вариантах с начальным содержанием нефти 2,4%, 4,8%, 9,0% и 13,0%.
Внесение поллютанта в ДП среднесуглинистую почву в концентрациях 4,8%, 7,1%, 9,0%, 13,0%, 16,6% и 20,0% на 7 сутки эксперимента привело к 48, 78, 6, 3, 98 и 10-кратному увеличению численности микромицетов. На 180 сутки численность микромицетов в почве относительно контроля варьировала от 150% в варианте, содержащем 9,0% нефти, до 2430% в варианте 16,6%. К концу эксперимента содержание микромицетов в почве резко снизилось и составляло 36-65% от контроля.
Интенсивность минерализации нефтяных углеводородов в ДП среднесуглинистой почве к 30 и 180 суткам эксперимента была в 1,5-3,1 и 2,2-6,5 раза выше, чем в супесчаной (табл. 2).
Таблица 2 - Динамика содержания нефтепродуктов в ДП почвах при длительном воздействии нефти
Время, сутки Начальное содержание нефти, %
2,4 4,8 7,1 9,0 13,0 16,6 20,0
Среднесуглинистая, % снижения содержания НП
7 - 2 6 9 6 2 1
30 - 30 25 18 17 13 17
180 - 69 71 65 55 47 47
365 - 77 78 67 66 65 65
Супесчаная, % снижения содержания НП
7 3 4 - 3 1 - -
30 20 10 - 20 15 - -
180 47 47 - 28 51 - -
365 84 77 - 53 53 - -
На 30 сутки в ДП среднесуглинистой почве прослеживалась зависимость между
интенсивностью минерализации углеводородов и начальной концентрацией нефти. К концу эксперимента эффективность деструкции НП в ДП среднесуглинистой почве при начальных концентрациях нефти 4,8% и 7,1% составляла 7778%, при 9,0-20,0% 65-67%.
Динамика снижения содержания нефтепродуктов в супесчаной ДП почве не имела явно выраженной зависимости от начальной концентрации поллютанта. Только на 365 сутки эксперимента было выявлена более высокая эффективность биодеградации нефтепродуктов при начальном содержании 2,4 и 4,8% (табл. 2).
Таким образом, результаты исследования показали, что нефтяное загрязнение привело к снижению численности наиболее чувствительных к загрязнению групп микроорганизмов и стимулировало рост физиологических групп, осуществляющих окисление углеводородов и их метаболитов.
Заключение
Проведенные исследования показали, что при попадании нефти в ДП почвы разного гранулометрического состава в них протекают однонаправленные процессы, интенсивность которых определяется характеристиками почв.
Внесение нефти в исследуемые почвы во всем диапазоне концентраций приводило к увеличению общей микробной численности и численности углеводородокисляющих микроорганизмов.
Микробное сообщество ДП среднесуглинистой почвы более устойчиво к токсическому действию «свежих» нефтяных загрязнений. Длительное воздействие нефти на легкие почвы приводит к более серьезным изменениям в составе почвенных микробоценозов, элиминации отдельных групп микроорганизмов.
Скорость минерализации нефтепродуктов в ДП среднесуглинистой почве выше, чем в супесчаной почве. Среднесуглинистая почва способна преодолевать негативное влияние более высоких концентраций нефтяных загрязнений.
Литература
1. Н.А. Киреева. Микробиологическая оценка почвы, загрязненной нефтяными углеводородами // Башкирский химический журнал, 2, 3-4, 65-68, (1995).
2. И.А.Дегтярева, А.Я. Хидиятуллина Оценка влияния природных ассоциаций углеводородокисляющих микроорганизмов на состояние нефтезагрязненной почвы// Ученые записки Казанского университета. Серия: Естественные науки, 153, 3, 137-143, (2011).
3. М.Ю. Гилязов, И.А.Гайсин, Л.Г. Шамсиева Естественная деградация нефти в черноземах лесостепи Закамья Татарстана // Достижения науки -сельскохозяйственному производству. Казань, 2002. С.89-90.
4. Т.В.Кузнецова, А.М.Петров, И.В.Князев, Р.Э.Хабибуллин Состав микробных сообществ при разном содержании нефтепродуктов в серых лесных почвах // Вестник технологического университета, 19, 14, 165-168, (2016).
5. А.Х. Яппаров, И.А. Дегтярева, А.М. Ежкова, И.А. Яппаров, Н.Л. Шаронова, А.Я.Давлетшина, И.А. Шайдуллина Ремедиация нефтезагрязненной почвы с использованием наносорбента и консорциума аборигенных углеводородокисляющих микроорганизмов // Нефтяное хозяйство, 1, 115-117, (2016).
6. Н.М. Исмаилов Микробиологическая и ферментативная активность нефтезагрязненных почв // Восстановление нефтезагрязненных почвенных экосистем. М.: Наука, 1988. С.42-56.
7. С.А. Алиев, Д.А. Горджиев Влияние загрязнения нефтяным органическим веществом на активность биологических процессов почв // Изв. АН АзССР сер. биол. наук, 2, .35-40, (1977).
8. А.М. Петров, Э.Р. Зайнулгабидинов, Л.М. Сунгатуллина, Р.Р. Шагидуллин, Д.В.Иванов, О.Ю. Тарасов, Б.Р. Григорьян Разработка нормативов допустимого остаточного содержания нефти и продуктов ее трансформации в почвах Республики Татарстан для земель сельскохозяйственного назначения //Вестник Казанского технологического университета, 23, 129-135, (2011).
9. Н.А.Киреева, М.Д.Бакаева, Е.М. Тарасенко Комплексное биотестирование для оценки загрязнения почв нефтью // Экология и промышленность России, 2, 26-29, (2004).
10. Н.С. Егоров Практикум по микробиологии. М.: Изд-во Московского университета, 1976. 307 с.
11. ПНД Ф 16.1:2.2.22-98. Методика выполнения измерений массовой доли нефтепродуктов в минеральных, органо-минеральных почвах и донных отложениях методом ИК-спектрометрии. М.: 2005. -18 с.
12. Н.А Киреева Микробиологические процессы в нефтезагрязненных почвах. Автореф. дисс. ... докт. биол. наук. Уфа, 1996. 37 с.
13. Хазиев Ф.Х., Тишкина Е.И., Киреева Н.А., Кузяхметов Г.Г. Влияние нефтяного загрязнения на некоторые компоненты агроэкосистемы // Агрохимия, 2, 56-61, (1988).
© Т. В. Кузнецова - с.н.с. лаборатории экологических биотехнологий Института проблем экологии и недропользования Академии наук Республики Татарстан, kuznetsovatatyan@mail.ru; А. М. Петров - к.б.н., заведующий лабораторией экологических биотехнологий Института проблем экологии и недропользования Академии наук Республики Татарстан, zpam2@rambler.ru; Р. Э. Хабибуллин - д.т.н., профессор кафедры ТММП ФГОУ ВО КНИТУ.
© T. V. Kuznetsova - Researcher of the Laboratory of Ecological Biotechnologies Research Institute for Problems of Ecology and Mineral Wealth Use of Tatarstan Academy of Sciences, kuznetsovatatyan@mail.ru; A. M. Petrov - Cand. Sci. (Biol), Head of the Laboratory of Ecological Biotechnologies Research Institute for Problems of Ecology and Mineral Wealth Use of Tatarstan Academy of Sciences, zpam2@rambler.ru; R. E. Khabibullin - Doctor of technical sciences (Full Professor), Professor Department of Meat and Milk Products Technology, KNRTU, hrustik@yandex.ru.
