CC BY
33
УДК 631.461:631.427
А. М. Петров, Л. К. Каримуллин, Т. В. Кузнецова, А. А. Вершинин, Р. Э. Хабибуллин
ВЛИЯНИЕ ОСТАТОЧНОГО СОДЕРЖАНИЯ НЕФТЕПРОДУКТОВ
НА СОСТАВ И АКТИВНОСТЬ ПОЧВЕННОГО МИКРОБНОГО СООБЩЕСТВА
Ключевые слова: нефтепродукты, нефтяное загрязнение, почвы, биохимическая активность, почвенное микробное сообщество.
При использовании микробиологических и биохимических критериев определено влияние различных уровней остаточного содержания нефтепродуктов после проведения рекультивационных и иных восстановительных работ на микробиоценозы ряда почв Чувашской Республики. Определены концентрации поллютанта не оказывающие влияние на респираторную, каталазную и уреазную активности почв.
Key words: petroleum products, oil pollution, soil, biochemical activity, soil microbic community.
Using the microbiological and biochemical criteria the effect of different levels of residual oil content and products of its transformation after remediation and other rehabilitation activities on microbial community of a number of soil in Chuvash Republic is determined. The concentrations of the pollutant that do not affect respiratory, catalase and urease activity of soils are found.
Введение
Попадание нефти и нефтепродуктов на почвенный покров ведет к потере биопродуктивности, деградации ландшафтов, надолго выводит природные территории из хозяйственного использования.
Необходимость скорейшего их возврата в хозяйственный оборот, требует экспериментального определения концентраций поллютанта, при которых сохраняется способность природных экосистем к самовосстановлению, установления критериев позволяющих экономически и экологически обосновано определять методы рекультивационных мероприятий, обеспечивающих скорейшее восстановление плодородия и свойств почв.
Учитывая сложность изучаемых объектов исследования, должны опираться на данные о совокупности биологических процессов, обусловливающих детоксикацию и разложение нефти и нефтепродуктов (НП) в почве [1-4].
Целью настоящей работы являлось получение экспериментальных данных по определению влияния разных остаточных концентраций НП в почве после проведения рекультивационных и иных восстановительных работ на активность микробоценоза ряда почв Чувашской Республики.
Экспериментальная часть
При проведении лабораторных экспериментов использовались образцы дерново-подзолистых (ДП), светло-серых лесных (ССЛ), серых лесных (СЛ), темно-серых лесных (ТСЛ), аллювиальных дерновых (АД) фоновых (контрольных) и загрязненных сернистой нефтью почв (горизонты А) (табл. 1).
Опытные варианты с заданными концентрациями НП готовились путем смешивания в различных соотношениях загрязненных и чистых контрольных образцов соответствующих почв. Концентрации НП в опытных образцах почв в экспериментах составляли в ДП - 1,2, 2,5, 3,2 и 4,8 г/кг, в ССЛ - 1,1, 1,6, 5,2 и 7,2 г/кг, в СЛ - 0,8, 1,8, 2,8 и 5,2 г/кг, в ТСЛ -
0,8, 2,2, 3,6 и 7,0 г/кг и АД - 1,6, 2,9, 4,1 и 5,8 г/кг. Влажность почвенных образцов составляла 60% от полной влагоемкости.
Микробиологические исследования выполнены с использованием общепринятых методов почвенной микробиологии [5,6]. Численность микроорганизмов оценивали методом посева почвенной суспензии на жидкие (метод предельных разведений) и плотные (чашечный метод Коха) питательные среды, с последующим подсчетом выросших колоний [6].
Определяли общую численность микроорганизмов (ОМЧ), численность спорообразующих и углеводородокисляющих микроорганизмов (УОМ), актиномицетов и микромицетов, нитрификаторов, азотофиксаторов и целлюлозоразрушающих микроорганизмов при различных уровнях остаточного содержания нефтяных углеводородов в почве.
Дыхательную активность и коэффициент микробного дыхания (Qr) определяли аналогично [2].
Определение каталазной и протеазной активности почвы проводили согласно [7], уреазной согласно [8]. Активность каталазы выражали в мг Н2О2/г почвы, уреазы в мкг N/г-час.
Полученные результаты обработаны статистически при помощи программы Microsoft Excel.
Результаты и обсуждение
Физико-химические свойства исследуемых почв
Согласно гранулометрическому составу исследуемые почвы относятся к супесчаным (ДП), легкоглинистым (ССЛ и СЛ), среднесуглинистым (ТСЛ) и тяжелосуглинистым (АД). Исследуемые почвы отличаются не только гранулометрическим составом, но и содержанием органического вещества, подвижного фосфора и калия (табл. 1).
Таблица 1 - Характеристики фоновых (контрольных) образцов изучаемых почв
Влияние концентрации НП на численность микроорганизмов
Нефть и нефтепродукты (НП) при попадании в почву с одной стороны выступают, как источник углерода, с другой - как токсичные вещества, отрицательно воздействующие на почвенный биоценоз [9]. В зависимости от концентрации НП, почвенных характеристик, климатических условий их присутствие может по-разному воздействовать на микробиоту - стимулировать рост и активность одних групп, ин-гибировать жизнедеятельность других групп микроорганизмов [10, 11].
Общая численность микроорганизмов, как правило, достаточно четко отражает микробиологическую активность почвы, скорость разложения органических веществ и круговорота минеральных элементов. На основании данного показателя можно не только судить о степени загрязненности почвы нефтью, но и о потенциальной способности к восстановлению, а также о процессах разложения нефти в естественных природных условиях и при рекультивации загрязненных почв [12].
С целью анализа влияния остаточного суммарного содержания НП на микробоценоз была определена численность ряда физиологических групп почвенных микроорганизмов в нефтезагрязненных почвах.
Наиболее чувствительными к содержанию НП в ДП почве являлись актиномицеты, численность которых во всех опытных вариантах была ниже, чем в контроле. Присутствие органического субстрата в концентрации 2,5 г/кг приводило к увеличению ОМЧ, количества УОМ, спорообразующих микроорганизмов, микромицетов и нитрификаторов (табл. 2). Более высокие остаточные концентрации НП в почве не ингибировали развитие УОМ, микромицетов и нитрификаторов.
Содержание НП в ССЛ почве в концентрации до 7,2 г/кг не приводило к достоверному снижению численности исследованных групп микроорганизмов (табл. 2). Увеличение остаточного содержания НП характеризовалось увеличением численности споро-образующих и углеводородокисляющих микроорганизмов, актиномицетов, микромицетов и нитрифика-торов.
Присутствие НП в СЛ почве во всех вариантах приводило к повышению количества УОМ и ОМЧ, численности актиномицетов при концентрации пол-лютанта до 2,8 г/кг, микромицетов и аммонификато-
ров при концентрации НП в почве - 5,2 г/кг. Количество спорообразующих микроорганизмов во всех опытных вариантах было ниже, чем в контроле. Воздействие испытанных концентраций НП не оказывало выраженного угнетающего действия на микробоценоз более чем по одному показателю [13].
Таблица 2 - Влияние концентрации НП в почвах, на численность групп почвенных микроорганизмов
Почва НП, г/кг Группа микроорганизмов
ОМЧ | Со | УОМ Ам | Мм | Нф | Аф
Кратность отклонения от контроля, раз
ДП 2,5 1,6 1,6 4,2 0,7 77,4 1,1 0,6
3,2 0,5 0,9 6,2 0,7 52,0 11,4 0,4
4,8 0,3 1,0 6,4 0,3 10,5 14,0 1,3
ССЛ 1,6 4,3 3,5 1,3 3,8 11,5 1,1 0,6
5,2 3,0 12,4 3,4 29,2 36,0 11,4 0,4
7,2 4,1 23,8 2,7 40,3 64,7 14,0 1,3
СЛ 1,8 4,7 0,9 18,7 24,0 1,0 0,0 5,0
2,8 15,6 1,3 30,0 46,0 1,0 0,0 1,0
5,2 10,3 0,1 34,7 0,8 5,0 12,3 18,0
ТСЛ 2,2 1,2 1,6 1,7 3,3 4,5 1,0 25,0
3,6 3,9 1,2 2,9 4,4 1,9 2,1 25,0
7,0 6,5 2,8 3,4 3,9 11,9 1,4 25,0
АД 2,9 4,2 1,6 1,3 1,6 3,3 0,2 1,0
4,1 2,7 1,1 0,6 0,5 9,1 0,1 0,7
5,8 0,6 0,6 0,7 0,2 7,6 5,0 0,0
Со - спорообразующие, Ам - актиномицеты, Мм - мик-ромицеты, Нф - нитрификаторы, Аф - азотфиксаторы
ТСЛ почва характеризовалась увеличением численности всех исследованных групп микроорганизмов. Для сапрофитной микрофлоры, УОМ прослеживалось закономерное увеличение количества клеток при повышении содержания НП в почвах. Численность представителей остальных групп микроорганизмов была выше, чем в контроле. Некоторое снижение численности актиномицетов и нитрификаторов было зафиксировано в варианте содержащем 7,0 г/кг НП. Содержание азотфиксаторов во всех опытных образцах было в 25 раз выше, чем в контроле.
Увеличение остаточной концентрации НП в АД почве до 5,8 г/кг приводило к снижению ОМЧ, количества УОМ, спорообразующих микроорганизмов и актиномицетов до 19-64% от их содержания в контроле, элиминированию азотфиксаторов (табл. 2). Общее количество микромицетов в загрязненных образцах почв было выше, чем в контрольных образцах.
Согласно [13], «пороговой является та концентрация нормируемого вещества, которая вызывает любые достоверные отрицательные изменения нескольких показателей (более 1)». Для микробиологических показателей действующей концентрацией химического вещества считается та, которая оказывает выраженное угнетающее действие на 50% и более по отношению к контролю.
Рассматривая полученные результаты, можно сделать вывод, что при концентрациях НП в ДП почве до 4,8 г/кг, в ССЛ до 7,2 г/кг, в СЛ до 5,2 г/кг, в ТСЛ до 7,0 г/кг и в АД до 4,1 г/кг не наблюдается ингибирующее действие поллютанта.
Гу- N Р рн Р К Г ранулометрический состав, %
мус вал вал вод подв подв 1,0- 0,25- 0,05- 0,01- 0,005- <
% мг/100 г 0,25 0,05 0,01 0,005 0,001 0,001
Дерново-подзолистая
2,7 0,09 0,14 5,42 12,5 17,2 45,12 22,73 15,00 3,80 4,45 8,90
Светло- серая лесная
2,8 0,31 0,26 4,9719,5 36,4 45,72 24,73 8,55 3,35 4,70 12,95
Серая лесная
6,1 0,33 0,25 6,47 27,6 50,3 0,80 18,05 22,35 9,10 16,70 33,00
Темно-серая лесная
7,9 0,07 0,20 7,04 17,8 26,0 1,16 16,84 47,90 7,65 10,65 15,80
Аллювиальная дерновая
4,9 0,17 0,20 8 11,5 10,3 18,20 9,65 32,70 10,8 10,60 18,05
Респираторная активность почв
Параметры респираторной активности являются интегральными показателями, позволяющими адекватно определить экологическое состояние почв. Уровни базального и субстрат-индуцированного дыхания дают представление о запасах и доступности питательных веществ, активности почвенного микробного сообщества, его устойчивости к присутствующим поллютантам. Рассчитываемый из соотношения базального и субстрат-индуцированного дыхания коэффициент микробного дыхания (Ор) является одним из наиболее объективных показателей, отражающих физиологическое состояние микробиоценоза, сбалансированность, происходящих в почве процессов [14].
Анализ величин Ор контрольных вариантов исследуемых почв показал, что они варьируют в широком диапазоне и составляют 0,50 в ДП почве, 0,56 в ССЛ, 0,1 в СЛ, 0,42 в ТСЛ и 0,22 в АД почве. Если значения СЛ и АД свойственны для нативных почв и свидетельствуют об их устойчивости и сбалансированности почвенных обменных процессов, то относительно высокие значения Ор контрольных образцов ДП, ССЛ и ТСЛ почв указывают на активную минерализацию органического вещества, характеризующуюся изменениями в составе почвенного микробиоценоза.
Экспериментальные значения Ор опытных образцов ДП почвы отличались от контрольных в 1,2-2,3 раза, что указывает на достаточно благополучное состояние микробных сообществ загрязненных почв.
Образцы ССЛ почвы, содержащие НП в концентрации 5,2 г/кг, имели показатель Ор сопоставимый с контрольными вариантами. Микробоценозы данной почвы при концентрации НП 1,1 и 1,6 г/кг по значению коэффициента микробного дыхания (0,32 и 0,30, соответственно) были устойчивее сообщества контрольной почвы.
Содержание НП в СЛ почве до 2,8 г/кг (Ор -0,29) практически не влияло на устойчивость микробного пула (рис. 1). При концентрации поллютанта 5,2 г/кг, значение Ор составляло 0,46.
Значения Ор опытных образцов ТСЛ почвы в диапазоне концентраций НП от 0,8 до 7,0 г/кг варьировали в интервале от 0,10 до 0,21, что указывает на сбалансированность почвенных обменных процессов. Величины опытных вариантов АД почв свидетельствует о снижении устойчивости почвенного сообщества при концентрации НП в почве 4,1 г/кг и выше.
Построенные по результатам экспериментов графики показывают, что значения коэффициентов микробного дыхания и концентрация НП в ССЛ, СЛ, ТСЛ и АД почвах имеют достоверную прямую линейную зависимость (рис. 1). Отсутствие достоверной зависимости в ДП почве, вероятно, определяется ее легким гранулометрическим составом.
Проведенные исследования показали, что для большинства образцов испытанных почв, содержащих НП в различных концентрациях, характерно их незначительное воздействие на почвенный микробо-ценоз. Значения Ор до 0,5 указывают на активное
протекание процессов минерализации нефтяных углеводородов в почве, при достаточно высокой стабильности почвенного микробного сообщества.
Рис. 1 - Взаимосвязь между значениями и остаточным содержанием НП в почве
Экспериментальные концентрации НП в почвах, при которых значения Ор характеризовали активное окисление нефтяных загрязнений при сохранении стабильности почвенного микробного сообщества с учетом испытанного диапазона содержания поллютанта составили: для ДП почвы -4,8 г/кг; для ССЛ и СЛ почв - 5,2 г/кг; для ТСЛ почвы - 7,0 г/кг; для АД почвы - выше 4,1 г/кг.
Ферментативная активность почв
Ферментативная активность почвенного микробиоценоза играет немаловажную роль в процессе детоксикации и минерализации УВ и служит чутким индикатором уровня воздействия поллю-танта, отражает интенсивность протекания биохимических процессов, обеспечивает прогноз состояния почв при разных уровнях нефтяного загрязнения.
Распад нефтяных углеводородов в почве связан с окислительно-восстановительными процессами, происходящими при участии ферментов, в том числе и каталазы, активность которой зависит от степени и срока загрязнения, вида нефтепродукта, типа почвы [15-20]. По данным ряда авторов, на ранних сроках загрязнения почвы нефтью активность каталазы снижается [16, 18, 19, 20].
Активность уреаз является одним из важнейших показателей биологической активности почв [21], т.к. они, во-первых, меньше подвержены воздействию других экологических факторов а, во-вторых, прослеживается четкая зависимость их активности от степени загрязнения почв [16].
В опытах на ДП, ССЛ, СЛ, ТСЛ и АД почвах во всем испытанном диапазоне концентраций поллютанта не наблюдалось ингибирование ката-лазной активности (рис. 2). Экспериментальные данные продемонстрировали, что повышение содержания НП приводило к росту уреазной активности в ССЛ, ТСЛ почвах (рис. 3). АД почва характеризовалась сопоставимой активностью фермента во всем диапазоне концентраций, а в ДП и СЛ почвах наблюдалось незначительное снижение уреазной активности после достижения максимальных значений при концентрации НП 3,2 и 1,8 г/кг, соответственно.
2 1 s
Hei|?ren род уггы. г/кг
а АД
Рис. 2 - Каталазная активность почв при различном содержании НП
П.5 3.0
, 3.5
1
: 1.5
-----------*
------------------
2 4 6
Нефтепродукты, г/к г
♦ДПП
■ссл
- жСЛ
тел
а АД
Рис. 3 - Уреазная активность почв при различном содержании НП
Учитывая, что критерием отрицательного воздействия поллютанта на почвенный микробоце-ноз является снижение биохимической активности более, чем на 25% [13], полученные результаты показывают, что при максимально испытанных остаточных концентрациях НП, не проявляется их ингиби-рующее действие на ферментативную активность почвенных микроорганизмов.
Заключение
Полученные результаты показали, что в испытанном диапазоне поллютанта по изученным параметрам не наблюдается ингибирующее действие нефтепродуктов на микробоценоз исследованных почв при следующих остаточных концентрациях НП в почвах: ДП - до 4,8 г/кг; ССЛ и СЛ - до 5,2 г/кг; ТСЛ - до 7,0 г/кг; АД - до 4,1 г/кг.
Результаты проведенных исследований были использованы в качестве основы при разработке региональных нормативов допустимого остаточного содержания нефтепродуктов в почве после проведения рекультивационных и иных восстановительных работ в Чувашской Республике [22].
Литература
1. Р.Р. Шагидуллин, А.М. Петров, Д.В. Иванов, О.Ю. Тарасов, Р.А. Шагидуллина, М.А. Буфатина, Экология и промышленность России, июнь, 24-28 (2011).
2. А.А. Вершинин, А.М. Петров, Ю.А. Игнатьев, Р.Р. Шагидуллин, Вестник Казанского технологического университета, 7, 168-174 (2011).
3. А.М. Петров, Э.Р. Зайнулгабидинов, Л.М. Сунгатуллина, Р.Р. Шагидуллин, Д.В. Иванов, О.Ю. Тарасов, Б.Р. Гри-горьян, Вестник Казанского технологического университета, 23, 129-136 (2011).
4. А.М. Петров, Р.Р. Шагидуллин, Э.Р. Зайнулгабидинов, Д.В. Иванов, О.Ю. Тарасов, Б.Р. Григорьян, Экология и промышленность России, июнь, 29-35 (2011).
5. Д. Г. Звягинцев (ред.), Методы почвенной микробиологии и биохимии, МГУ, Москва, 1991. 304 с.
6. Н.С. Егоров (ред.) Практикум по микробиологии МГУ, Москва, 1976. 307 с.
7. Р.С. Кацнельсон, В.В. Ершов, Микробиология, Т.27, 1, 8288 (1958).
8. Ф.Х. Хазиев, Методы почвенной энзимологии. Наука, Москва, 2005, 252 с.
9. Г.Н. Чупахина, П.В Масленников, Экология, 5, 330-335 (2004).
10. А.И. Фатеев, Агрохимия, 10, 53-60(2004).
11. М.Ю. Гилязов, И.А. Гайсин, Агроэкологическая характеристика и приемы рекультивации нефтезагрязненных черноземов Республики Татарстан. Фэн, Казань, 2003. 228 с.
12. Киреева Н.А., Башкирский химический журнал Т.2, 3-4, 65-68 (1995).
13. Методические рекомендации по гигиеническому обоснованию ПДК химических веществ в почве (утверждены 5 августа 1982 г. № 2609-82).
14. T.H. Anderson, K.H. Domsch, Soil Biol. Biochem, 25, 3, 393-395 (1993).
15. Н.М. Исмаилов, в сб. Восстановление нефтезагрязнен-ных почвенных экосистем. Наука, Москва,1988. С.42-56.
16. Н.А. Киреева, В.В. Водопьянов, А.М. Мифтахова, Биологическая активность нефтезагрязненных почв, Гилем, Уфа, 2001. 376 с.
17. С.К. Зарипова, И.Т. Храмов, Ф.К. Алимова, А.В. Гарусов, Р.Э. Хабибуллин, Р.С. Кашаев, Р.П. Наумова Биологическая активность почв: влияние нефтяного загрязнения и различных методов биоремедиации. Труды ТатНИИ агрохимии и почвоведения. Плодородие почв, удобрения, урожай. ДАС, Казань, 2001. С.176-186.
18. Ф.Х. Хазиев, Ф.Ф. Фатхиев, Агрохимия, 1, 10, 102-111(1988).
19. Р.Р. Сулейманов, И.М. Габбасова, Р.Н. Ситдиков, Известия РАН, Сер. Биологическая, 1, 109-115(2005).
20. Д.К. Азнаурьян, Автореф. дисс. канд. биол. наук, Южный федеральный ун-т, Ростов-на-Дону, 2009. 22 с.
21. А.Ш. Галстян, Почвоведение, 2, 107-114(1978).
22. Постановление КМ Чувашской Республики «Об утверждении нормативов допустимого остаточного содержания нефти и продуктов её трансформации после проведения рекультивационных и иных восстановительных работ в дерново-подзолистых, светло-серых лесных, серых лесных, тёмно-серых лесных и аллювиальных дерновых почвах для земель сельскохозяйственного назначения, лесного фонда и особо охраняемых территорий и объектов на территории Чувашской Республики» от 24.01.2013 г. № 6.
© А. М. Петров - к.б.н., зав. лаб. экологических биотехнологий Института проблем экологии и недропользования АН РТ, Казань, [email protected]; Л. К. Каримуллин - м.н.с. той же лаборатории; Т. В. Кузнецова - н.с. той же лаборатории; А. А. Вершинин -с.н.с. той же лаборатории; Р. Э. Хабибуллин - к.т.н., доцент кафедры ТММП ФГОУ ВПО КНИТУ, [email protected]
© A. M. Petrov - Cand. Sci. (Biol), Head of the Laboratory of Ecological Biotechnologies Research Institute for Problems of Ecology and Mineral Wealth Use of Tatarstan Academy of Sciences, [email protected]; L. K. Karimullin - junior researcher of the Laboratory of Ecological Biotechnologies Research Institute for Problems of Ecology and Mineral Wealth Use of Tatarstan Academy of Sciences; T. V. Kuznetsova -senior researcher of the Laboratory of Ecological Biotechnologies Research Institute for Problems of Ecology and Mineral Wealth Use of Tatarstan Academy of Sciences; A. A. Vershinin - Cand. Sci. (Biol.), senior researcher of the Laboratory of Ecological Biotechnologies Research Institute for Problems of Ecology and Mineral Wealth Use of Tatarstan Academy of Sciences; R. E. Habibullin - Cand. Sci. (Tech.), Docent, Depatment of Meat and Milk Production Technology, KNRTU, [email protected].
