БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ДНК ИЗ ОТХОДОВ производства ЛИДАЗЫ Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

2001

Известия Тихоокеанского научно-исследовательского рыбохозяйственного центра

Том 129

Ю.И.Касьяненко, Т.Н.Пивненко, Г.М.Сафонова (ТИНРО-центр, г. Владивосток; НПО "Биомед", г. Пермь)

БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ДНК ИЗ ОТХОДОВ ПРОИЗВОДСТВА ЛИДАЗЫ

Препараты ДНК различного состава, выделенные из ряда источников, таких как тимус теплокровных животных, дрожжевая культура (Mirsky, 1968; Davidson, 1972), используются как биологически активные пищевые добавки и лекарственные средства, влияющие на процессы метаболизма, кроветворения и иммунную систему. Считают, что механизм действия ДНК способен реализовываться на уровне олигонуклеотидов и осуществляется путем связывания с клеточными рецепторами (Карамы-шева и др., 1998; Рыкова и др., 2001). Существует мнение, что многие макромолекулы резорбируются из кишечника в кровь в комплексе с транспортными белками, не теряя фармакологической активности (Liebow, Rothman, 1975). Наиболее перспективным источником ДНК являются молоки осетровых и лососевых рыб (Касьяненко и др., 1997). Как известно, молоки рыб и семенники млекопитающих, кроме ДНК, содержат целый комплекс биологически активных веществ - ферменты, гормоны и др. Так, для производства гиалуронидазы (КФ 3.2.1.35) (коммерческое название "лидаза") - фермента, специфически разрушающего соединительную ткань, традиционным источником являются семенники крупного рогатого скота (Машковский, 1993). В работе Н.Н.Ковалева и Л.М.Эп-штейна (1995) установлено наличие гиалуронидазы в молоках лососей и показано ее сходство с аналогичным ферментом из семенников крупного рогатого скота.

Целью нашей работы было обоснование последовательных технологий производства лидазы и ДНК из отходов получения этого фермента. Для этого использованы результаты выделения искомого компонента и исследования его биологической активности. Необходимо было показать, что процесс предварительной обработки сырья не оказывает отрицательного воздействия на биологическую активность ДНК. В качестве сырья использовали семенники крупного рогатого скота и молоки лососевых рыб.

Материалы и методы. Молоки дальневосточных лососевых рыб и семенники крупного рогатого скота были заморожены и хранились при температуре минус 18 °С.

Для получения лидазы сырье очищали от жира и соединительной

ткани, измельчали и подвергали водной экстракции, нерастворимый оса-

62

док удаляли центрифугированием и использовали для получения ДНК согласно ранее разработанному методу (Пат. № 2122856).

Концентрацию ДНК в сырье определяли по методу Дише (Северин, Соловьева, 1989), концентрацию ДНК в препарате - по разнице поглощения азотистых оснований (при 270 и 290 нм), полученных в результате гидролиза ДНК раствором 0,5 %-ной хлорной кислоты при 100105 оС (Карклиня и др., 1989).

Статистическая обработка результатов эксперимента включала определение средних значений величин и стандартной ошибки. Достоверность различий между средними величинами оценивалась с помощью критерия Стьюдента (Урбах, 1962).

Результаты и обсуждение. На первом этапе работы получали ДНК из отходов производства лидазы. Использовали осадок после экстракции фермента, который обрабатывали щелочным раствором хлористого натрия. После фильтрации полученный экстракт концентрировали методом ультрафильтрации с помощью волоконных фильтров с пределом пропускания 100 кДа. Затем концентрат сушили сублимационным или распылительным способом.

В табл. 1 представлены составы препаратов, полученных из необработанных молок, а также из сырья после экстракции лидазы.

Таблица 1

Химический состав препаратов из различных видов сырья

Table 1

Chemical contents of prepapation from different raw materials Сырье, использованное для Содержание ДНК, Выход препарата,

получения препаратов % %

Молоки лососей

без предварительной обработки Молоки лососей 66- -75 4,0- ■5,2

после экстракции лидазы Семенники КРС 68- -69 5,3- ■6,0

после экстракции лидазы со -53 3,6- 6,0

Экстракция исходного сырья для выделения лидазы незначительно снижает содержание ДНК в конечном препарате, при этом сохраняется высокий выход препарата. Таким образом, рассмотренная технология последовательного получения двух препаратов из одного вида сырья целесообразна.

На втором этапе работы исследовалось влияние биологически активной пищевой добавки, содержащей ДНК из отходов производства лидазы, на физическую и умственную работоспособность.

В опытах при использовании белых беспородных мышей массой 22-24 г изучали влияние препарата ДНК на мышечную работоспособность. В этих же экспериментах оценивали влияние аскорбиновой кислоты и глюкозы, использованных при изготовлении таблеток и порошков ДНК. Были взяты 4 группы животных: 1 - контроль; 2 - получавшая аскорбиновую кислоту; 3 - глюкозу; 4 - ДНК из отходов производства лидазы.

Препарат ДНК и аскорбиновую кислоту вводили в дозе 0,03 мг на мышь, глюкозу - в дозе 0,18 мг/мышь в 0,5 мл дистиллированной воды. Контрольным животным вводили эквиобъемное количество дистилли-

63

рованной воды. Все растворы вводились перорально с помощью зонда в течение 7 дней. Мышечная работоспособность оценивалась в следующих тестах: тест вынужденного плавания; проба с подвисанием; проба с поднятием грузиков (Елизарова и др., 1974).

Для испытания пробы с плаванием использовали емкость, где столб воды составлял 20-25 см, а температура - 22 °С. Каждому животному давали нагрузку, составлявшую 7 % массы тела. За окончание плавания принимается время до первого погружения животного в воду.

В пробе с подвисанием определяли время удержания животного на горизонтальном стержне передними лапами.

В пробе с поднятием грузиков к пластинке из мелкой кристаллической сетки массой 1,9 г привязывали цепь грузиков, мышь сажали на сетчатую пластинку, поднимали за хвост вверх, фиксировали массу грузиков, которые смогла поднять и удержать мышь. Результаты тестов приведены в табл. 2.

Таблица 2

Влияние ДНК и наполнителей на работоспособность мышей

Table 2

Influence of DNA and additives on mouse's workability

Группы животных, получавших

Тест воду - аскорбиновую глюкозу ДНК

контроль кислоту

Время пла-

вания, с 465,6±74,9 392,2±95,0 473,6 ± 13,5 778,2**±58,7

Время удер-

жания на

стержне, с 9,2 ±1,7 10,5 ± 3,4 14,6*±4,9 15,4*±5,3

Масса под-

нятых гру-

зиков, г 36,8±4,6 37,6±5,9 40,2 ± 1,3 44,2±2,08

* Р<0,05 по сравнению с контролем. ** Р<0,005 по сравнению с контролем.

Как видно из данных табл. 2, препарат ДНК из отходов производства лидазы достоверно повышает физическую работоспособность мышей (среднее повышение на 20-67 % по сравнению с контролем).

Далее было изучено влияние биологически активной пищевой добавки, содержащей ДНК, на умственную и физическую работоспособность человека. Для этого была подобрана группа из 4 добровольцев в возрасте от 30 до 55 лет, принимавших комплексный препарат 2 нед в дозе 800 мг в сутки. Физическая работоспособность проверялась с помощью степ-теста, а умственная - с помощью корректуры текстов по методу В.Я.Анфимова (Загрядский, Сулимо-Самуйло, 1976). В обоих тестах снимались фоновые показатели (до начала приема препарата), через 1 и через 2 нед приема порошков.

Степ-тест характеризует реакцию сердечно-сосудистой системы на физическую нагрузку. Подверженные испытаниям люди в течение 3 мин поднимались на ступеньку высотой 50 см в заданном ритме (30 восхождений в 1 мин). После нагрузки измерялась частота пульса (табл. 3).

При проведении корректурной пробы испытуемые в течение 5 мин просматривали текст и вычеркивали заранее им сообщенные сочетания

64

Таблица 3 из двух букв, отмечая конец

Индекс реакции сердечно-сосудистой каждой минуты вертикальной

системы при приеме препарата ДНК чертой. Оценка результатов

Table 3 проводилась по показателю

Cardio-vascular system reaction's index интенсивности внимания, ко-

at eating DNA prepapation__торый представляет собой

Фон Через 1 нед Через 2 нед

51,5±3,9 58,3±6,6 64,3±6,7*

выраженное в процентах отношение количества просмот-

ТГ"7ГТ^ё ренных букв к их общему

Р < 0,05 по сравнению с контролем. r J J

числу, а также по показателю внимания (ПВ): ПВ = КЗ/К0 - 1,

где КЗ - количество знаков, просмотренных за 1 мин; К0 - количество ошибок (табл. 4).

Таблица 4

Интенсивность и показатель внимания при приеме препарата ДНК, %

Table 4

Intensity and index of attention at eating DNA prepapation, %

Интенсивность внимания Показатель внимания

Фон Через 1 нед Через 2 нед Фон Через 1 нед Через 2 нед

91,5±4,1 94,1 ±3,4 114,8*±6,6 74,2±4,9 204,5**±50,2 139,1**±25,2 * Р < 0,005 по сравнению с контролем. ** Р < 0,001 по сравнению с контролем.

Несмотря на недостаточное для статистической обработки данных количество испытуемых, мы сочли возможным привести данные этих исследований. Это связано с тем, что полученные результаты в целом совпадают с данными обширных исследований, проведенных для ДНК обычной технологии по тем же тестам в Институте физиологии им. И.П.Павлова РАН в 1997 г. (Разработка технологии получения..., 1997).

Таким образом, биологически активная добавка, содержащая ДНК из отходов производства лидазы, значительно стимулирует физическую и умственную работоспособность человека.

Третий этап работы включал исследование влияния биологически активной добавки, содержащей ДНК, на иммунную активность.

Иммунизацию морских свинок проводили эритроцитами кролика (ЭК). О биологической активности препарата судили по показателю восстановления розеткообразующих тимоцитов (РОТ) после их обработки трипсином без добавок и на фоне испытуемого препарата (табл. 5).

Таблица 5

Восстановление розеткообразующих клеток, %

Table 5

Rosette-formed cells recovery, %

Вариант опыта Серия № 1 Серия № 2 Серия № 3

Контроль 1: тимоциты морской свинки

+ эритроциты кролика 61,0 68,2 68,2

Контроль 2: тимоциты морской свинки

+ эритроциты кролика + трипсин 14,0 30,0 30,0

Опыт: тимоциты морской свинки +

эритроциты кролика + трипсин +

препарат 50,7 45,6 41,4

Восстановление активности тимоцитов 78,0 41,0 30,0

Как видно из полученных результатов, биологическая активность трех серий препарата ДНК различна. Это, вероятно, зависит от различий в технологии получения препарата. В процессе концентрирования экстракта были использованы ультрафильтрационные колонки с половоло-конными мембранами, обладающими разными пределами разделения: серия № 1 - ВПУ-5; № 2 - ВПУ-15; № 3 - ВПУ-100. Эти данные подтвердили предположение о том, что присутствие в препарате ДНК белковых фракций полезно. На основании этих результатов проведена коррекция ранее разработанной (Пат. 2098107) технологической схемы производства препарата. В процессе концентрирования вместо ВПУ-100 рекомендовано применять ВПУ-5 или ВПУ-15.

Далее проводили эксперименты по оценке влияния препарата, содержащего ДНК, на поствакцинальный ответ мышей (8 мышей массой 18-20 г) при вакцинации против гепатита В.

Вакцину против гепатита В вводили в дозе, эквивалентной человеческой, по 0,17 мл внутримышечно в разведении 1: 1000.

Препарат, содержащий ДНК, вводили в дозе 1 мг/кг массы подкожно одновременно с вакциной. Кровь на анализ забирали через 14 дней.

Полученные результаты (табл. 6) показывают, что препарат ДНК стимулирует поствакцинальный ответ, вызывая при этом достоверное увеличение уровня иммуноглобулина в крови животных.

Исследовали также

Таблица 6

Влияние ДНК на поствакцинальный ответ мышей при вакцинации против гепатита В

Table 6

DNA influence to post vaccination mouse's replay at vaccination against hepatitis B

№ мыши

Фон (вакцина) Вакцина + ДНК

1

2

3

4

5

6

7

8

М±о

Титр log2 Титр log2

1 4 2 1 32 5

1 8 3 1 64 6

1 8 3 1 64 6

1 4 2 1 32 5

1 16 4 1 64 6

1 2 1 1 64 6

1 4 2 1 128 7

1 2 1 1 64 6

2,25 ±0,3 5,9 ±0,3*

Р < 0,001.

влияние препарата ДНК на поствакцинальный ответ мышей при вакцинации против вируса клещевого энцефалита.

На данном этапе 84 белые беспородные мыши массой 18-20 г вакцинировали концентрированной вакциной клещевого энцефалита по схеме: 0-й день -вакцина в дозе, эквивалентной человеческой в пересчете на массу тела; на 14-й день - первая ревакцинация; на 42-й день - вторая ревакцинация той же дозой вакцины. Препарат ДНК вво-

дили внутрибрюшинно по трем схемам: 1 - однократно одновременно с вакциной; 2 - в течение 5 дней после первой инъекции вакцины; 3 -однократно одновременно со второй ревакцинацией.

Половине мышей препарат вводили перорально, а другой половине - внутрибрюшинно. Мышей контрольных групп вакцинировали по той же схеме, но вместо препарата им вводили эквиобъемное количество физиологического раствора хлорида натрия. Титр антител в сыворотке крови определяли на 7-е сут после второй ревакцинации.

Полученные данные показывают, что наличие препарата ДНК в процессе иммунизации приводит к увеличению титра иммуноглобулина в крови животных.

Таким образом, проведенные биологические исследования показали, что ДНК, полученная из отходов производства лидазы, как БАД оказывает заметное влияние на регуляцию защитной активности организма.

Литература

Елизарова О.Н., Жидкова Л.В., Кочеткова Т.А. Пособие по токсикологии для лаборантов. - М.: Медицина, 1974. - 193 с.

Загрядский В.П., Сулимо-Самуйло З.К. Методы исследования в физиологии труда. - Л., 1976. - 212 с.

Карамышева, В.Я., Ройхель В.М., Фокина Г.И. и др. Некоторые механизмы действия олигонуклеотидов: стимуляция иммунной системы и уменьшение поражений головного мозга при клещевом энцефалите // Вопр. виру-сол. - 1998. - Т. 43, № 1. - С. 39-42.

Карклиня В.А., Бирска И.А., Лимаренко Ю.А. Количественное определение нуклеиновых кислот в молоках лососевых различными методами // Химия природных соединений. - 1989. - Т. 1. - С. 122-126.

Касьяненко Ю.И., Ковалева Ю.В., Эпштейн Л.М., Артюков А.А. Получение и свойства производных ДНК из молок лососевых // Изв. ТИНРО. - 1997. - Т. 120. - С. 37-43.

Ковалев Н.Н., Эпштейн Л.М. Гиалуронидаза гидробионтов. Метод определения активности // Изв. ТИНРО. - 1995. - Т. 118. - С. 73-81.

Машковский М.Д. Лекарственные средства. - М.: Медицина, 1993. - Т. 2. - 294 с.

Пат. № 2098107. Способ получения нуклеопротеинового комплекса из отходов производства лидазы / Л.М.Эпштейн, Ю.И.Касьяненко, В.Ф.Петров и др. Заявлен 28.06.95. Опубл. 10.12.97.

Пат. № 2122856. Способ получения нуклеопротеинового комплекса / Ю.И.Касьяненко, Л.М.Эпштейн, А .А.Артюков. 10.12.1998.

Разработка технологии получения и использования БАВ из океанических промысловых объектов: Отчет о НИР (промежут.) / ТИНРО. № гр. 01880073029; Инв. № 22629. - Владивосток, 1997. - 155 с.

Рыкова Е.Ю., Лактионов П.П., Власов В.В. Активирующее влияние ДНК на иммунную систему // Успехи современной биологии. - 2001. - Т. 121, № 2. - С. 160-171.

Северин С.Е., Соловьева Г.А. Практикум по биохимии. - М.: МГУ, 1989. - 163 с.

Урбах В.М. Математическая статистика для медиков и биологов. - М.: Медгиз, 1962. - 255 с.

Davidson J.N. The Biochemistry of the nucleic acids. - NY: Academic Press, 1972. - 322 p.

Liebow C., Rothman S.S. Enteropancreatic circulation of digestive enzymes // Science. - 1975. - № 189. - P. 472.

Mirsky A.E. // Science Am. - 1968. - № 218. - P. 497-509.

Поступила в редакцию 18.05.2001 г.