CC BY
61
УДК 612.06 : 557.19 : 639.211
£
* Л.Н. Федянина
; ИММУНОАДЪЮВАНТНОЕ ДЕЙСТВИЕ БАД ДНК ИЗ МОЛОК ЛОСОСЕВЫХ РЫБ
V
Ь Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии
СО РАМН, г. Владивосток
Как известно, специфические последовательности нуклеотидов распознаются иммунокомпетен-тными клетками и могут оказывать как стимулирующее, так и угнетающее действие на иммунную систему [7]. В последнее время все чаще начинают использоваться лекарства и биологически активные добавки (БАД) на основе ДНК, в частности из молок осетровых и лососевых рыб [1,2, 6]. На Дальнем Востоке, а также в других регионах России широкое распространение получила БАД ДНК из молок лососевых рыб, разработанная в Тихоокеанском научно-исследовательском рыбохозяйсгвенном центре и производимая в ООО "Биополимеры" (г. Партизанск). Если лекарственные средства проходят жесткий контроль и механизм действия многих из них, в основном, понятен, то точки приложения БАД на основе низкомолекулярной дезоксирибонуклеиновой кислоты (нДНК) требуют своего детального изучения.
В предыдущих сообщениях мы показали действие нДНК на облученный организм, ее влияние на кроветворение, протективный эффект при заражении мышей Escherichia coli и Salmonella enteritidis, фагоцитозстимулирующее и антиокси-дантное действие [2-4, 8]. В настоящем сообщении приводятся результаты исследования влияния нДНК из молок лососевых рыб на процесс анти-телогенеза у мышей.
При анализе адъювантного действия различных биологически активных веществ (БАВ) наиболее информативными интегральными показателями функциональной активности B-системы иммунитета являются титры антител (AT) в сыворотке крови, а также число антителообразующих клеток (АОК) в селезенках животных, иммунизированных антигеном.
Материалы и методы
В экспериментах использовали мышей-гибри-дов (CBAxC57BL)F,, а также линии СВА, полученных из питомника РАМН "Столбовая". В опытах были использованы также неинбредные мыши. Животные находились на стандартной диете в боксированных помещениях с соблюдением всех правил и международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных работах. В качестве гетерологичного корпускулярного антигена для иммунизации мышей применяли эритроциты барана (ЭБ). ЭБ в субоптимальной иммуногенной дозе 5x106 ЭБ вводили
Резюме
В статье представлены материалы по иммуностимулирующей активности ДНК из молок лососевых рыб, разрешенной к применению в качестве биологически активной добавки (БАД) к пище. В эксперименте установлено, что ДНК оказывает стимулирующее действие па гуморальный иммунитет, причем как в индуктивную, так и в продуктивную фазы антителообразования. Действие ДНК носит дозозависимый характер, его активность более выражена при подкожном введении, чем при перо-ральном. БАД ДНК может применяться в комплексном лечении заболеваний, протекающих с дефектами гуморального иммунитета, а также при иммунореабилитации пожилых людей и при вакцинации лиц, слабо реагирующих на антигены вакцин.
L.N. Fedyanina
IMMUNE ADJUVANT ACTIVITY OF BIOLOGICALLY ACTIVE ADDITIVE TO FOOD-SALMON SOFT ROE DNA
Research Institute of Epidemiology and Microbiology of RAMS, Siberian Branch, Vladivostok
S u m ш а г у
Data of immune stimulative activity of salmon soft roe DNA approved for application as biologically active additive (BAA) to food are represented. DNA is proved to stimulate humoral immunity both in productive and inductive phases of antibodies formation. DNA activity is dose-dependent and marked deeply under hypodermic application. DNA BAA can be included to combined treatment of disease with hymoral immunity deficiency.
внутрибрюшинно по 0,5 мл 0,85% раствора ИаС1. Интенсивность образования ^М антител, специфичных к ЭБ, определяли на 4; 7 и 14 дни после иммунизации. Количество АОК в селезенке мышей определяли методом локального гемолиза в геле агарозы [10].
ДНК из молок лососевых рыб растворяли в 0,85% растворе ЫаС1 и вводили трехкратно подкожно в область бедра задней лапки мыши в дозах 1; 10 и 100 мг/кг в течение трех дней перед иммунизацией. Другой группе животных нДНК вводили подкожно однократно в тех же дозах за сутки до иммунизации мышей ЭБ (индуктивная фаза антителообразования) и через 3 сут после иммунизации (продуктивная фаза антителообразования). Поскольку нДНК выпускается в виде таблеток для перорального применения продолжительным кур-
Влияние различных доз ДНК на титр гемагглютининов у мышей СВА при подкожном введении и введении per os
Группа Подкожное введение Введение per os
4 сут 7 сут 14 сут 4 сут 7 сут 14 сут
Контроль (физраствор) 6,69 ±0,26 7,0 ±0,27 6,75 ±0,19 6,32 ±0,2 7,89 ±0,28 6,75 ±0,19
ДНК 1 мг/кг 7,0 ±0,27 7,18 ±0,24 7,32 ±0,29 6,61 ±0,17 7.18 ±0,24 7,18 ±0,24
ДНК 10 мг/кг 7,75 ±0,28* 7,89 ±0,34* 8,03 ±0,27** 6,75 ±0,28 7.89 ±0,28 7,89 ±0,19***
ДНК 100 мг/мл 7,61 ±0,27* 7,89 +0,28* 6,89 ±0,28 6,75 ±0,19 7.61 ±0,2 6,6! ±0,17
Примечания. * - р<0,05; ** - р<0,01; *'** - p<0,06l.
Таблица 2
Влияние различных доз ДНК, введенной per os, на формирование АОК в селезенках мышей СВА к корпускулярному антигену (ЭБ)
сом лечения (25-30 дней), одна группа мышей перед иммунизацией ЭБ получала перорально через зонд нДНК в течение 2 нед. в дозе 10 мг/кг. Экспериментальный иммунодефицит моделировали внутрибрюшинным введением мышам-гибридам массой 18-20 г 100 мг/кг циклофосфамида (ЦФ) однократно. В этой серии экспериментов показатели опытных групп животных сравнивали с результатами оценки в двух контрольных группах мышей: контроль 1 — животные, получавшие перорально по 0,5 мл 0,85% раствора №С1; контроль 2 — животные, получавшие ЦФ и по 0,5 мл 0,85% раствора ЫаС1. Влияние нДНК на гуморальный ответ организма старых животных исследовали на неинбредных мышах в возрасте 8 мес. ДНК старым животным вводили подкожно и перорально ежедневно в дозах 1,10 и 100 мг/кг в течение 2 нед. перед иммунизацией.
Результаты и обсуждение
При исследовании зависимости уровня антите-лообразования от дозы и способа введения нДНК было установлено, что у мышей линии СВА оптимальный адъювантный эффект наблюдается при введении ее подкожно в дозе 10 мг/кг массы тела (табл. 1). В этом случае стимуляция антителооб-разования имела место на 4; 7 и 14 сут после иммунизации. При пероральном введении БАВ адъювантный эффект был наиболее оптимальным и
Влияние различных доз ДНК, введенной per os, на количество АОК и титр антител при первичном
иммунном ответе на фоне иммуносупрессии, вызванной однократным введением циклофосфана
Группа АОК(хЮ6) Абс. число АОК Титр гемагглютининов (-log титра)
Контроль! 168+i1 27865±2656 9,25+0,17
Контроль 2 79±18,6 19365+1228 5,! ±0,12
ДНК 1 мг/кг 110,8+9.6 21623+2115 8,6±0,14***
ДНК 10 мг/кг 128.4±9,9* 2351 1+3110 10,16+1,2**
ДНК 100 мг/кг 121,3+10,0 20050±4344 9,65±1,4**
Примечание. * - р<0,05; ** - р<0,01; *** - р<0,00!.
статистически значимым только на 14 сут после иммунизации. Оценивая в целом действие нДНК на антителообразование, следует отметить, что в данном случае имеет место умеренная стимуляция — антителообразования, титры антител у мышей, получавших нДН К, превышали контрольные на 12-22%. При этом более эффективным было подкожное введение нДНК.
При исследовании клеточных элементов, участвующих в образовании антител, было установлено (табл. 2), что в селезенках мышей в период индуктивной фазы антителообразования накапливалось в среднем от 210+15,бхЗО6 до 311±36,1х10б АОК, секретирующих 1§М-антитела, специфические к антигену (ЭБ). Различия с показателями контрольной группы были статистически достоверными. В селезенках мышей этой группы наблюдалась также тенденция к увеличению абсолютного числа АОК. Такая же картина имела место в продуктивную фазу антителообразования, однако статистически достоверные результаты были получены при введении нДНК только в дозах 10 и 100 мг/кг массы.
Поскольку нДНК выпускается в виде БАД к пище, представлялось необходимым исследование ее действия не только в условиях неизмененного иммунного ответа, но и на модели приобретенного иммунодефицита. Введение ЦФ (табл. 3) мышам (контроль 2) приводило к угнетению процесса накопления АОК в селезенке и уменьшению титра антител к ЭБ по сравнению с показателями у мышей, которые получали только ЭБ (контроль 1). Нивелирование супрессирующего действия ЦФ низкомолекулярной ДНК проявилось увеличением уровня АОК (при введении нДНК в дозе 10 мг/кг), а также уровня ^М-антител (при введении нДНК в дозах 1,10 и 100 мг/кг массы). Несмотря на этот выраженный эффект, ни в одном случае показатели мышей опытных групп не достигали уровня контроля 1. Таким образом, нДНК вносит коррективы в иммунодефицитное состояние, мягко повышая уровень гуморального ответа на корпускулярный антиген.
В аналогичных экспериментах на мышах-гибридах (СВАхС57В1_/6)Р1 (табл. 4) нДНК купиро-
Фаза антителообразования Доза ДНК, мг/кг
1 10 100
Контроль (0,85% NaCl) АОК (xlO6) - 168 ±11,5
абс. число АОК - 27865 ±2656
Индуктивная АОК (xlO6) 210 ±15,6* 311 ±36, i** 298 ±45*
абс. число АОК 39668 ±1764 49565 + 1986 44365 ±1811
Продуктивная АОК (х!06) 195 ±18,5 254 ±19** 242 ±20**
абс. число АОК 48271 ±1865 51364 ±1110 51900 ±1211
Примечания. * — р<0,05; ** - р<0,01.
Влияние ДНК на количество АОК и титр антител у мышей Р1 (СВА С 57ВЬ/6) при первичном иммунном ответе на ЭБ на фоне иммуносупрессии, вызванной однократным введением ЦФ
Группа АОК (х10*) Число АОК на селезенку Титр гемагглютининов (-log 2 титра)
Контроль1 92,7± 16,9" 27200+ 5438** 9,25±0,16**
Контроль 2 35,8+4,6 7205+1110 8,73±0,14
ДНК 1 мг/кг 48,3+14 7625±2001 8,02+0,12
ДНК 10 мг/кг 90,6±15** 19620±3600** 10,0±0,18***
ДНК 100 мг/кг 94,7± 18,6** 22653+2029** 10,6+0,18***
Примечания. * - р<0,05; ** - р<0,01; *** - р<0,001.
вала иммунодефицит, возвращая сниженные ЦФ-показатели к уровню показателей контроля. Ранее нами Ц-З, 8] было показано, что нДНК при пероральном введении мышам-гибридам (СВАх С57ВЬ/6)Р, оказывает выраженное влияние на гуморальный ответ, в 2,1 раза увеличивает продукцию АОК и в 2-4 раза повышает титры гемагглю танинов. Близкие результаты получены в экспериментах и на неинбредных мышах. По-видимому, иммуностимулирующая активность нДНК выражена в большей степени у низкоотвечающих на ЭБ животных. Такая картина отмечена, например, при введении мышам линий СВА С57ВЬ/ 6 и гибридам (СИФхС57ВЬ/6)Р, препарата ГМДП [5].
Более низкий эффект ДНК при пероральном введении, возможно, объясняется размерами молекул нуклеотидов, которые оказывают иммуно-адъювантное действие.
Поскольку БАД нДНК рекомендуется к применению и лицам старших возрастных групп, мы считали необходимым исследовать ее влияние на гуморальный иммунитет у старых мышей. Эта серия экспериментов поставлена на неинбредных мышах. В табл. 5 представлены результаты этих опытов. Как следует из материалов таблицы, у старых мышей нДНК, введенная подкожно, тоже оказывает умеренный адъювантный эффект, усиливая антителообразование и увеличивая число антителопродуцентов в селезенке мышей. Перо-ральное введение нДНК увеличивало сниженные показатели гуморального ответа только в дозах 10 и 100 мг/кг. При этом показатели у старых животных, получивших нДНК, не достигали уровня показателей у молодых животных, однако различия были статистически достоверными.
При развитии иммунного ответа по гуморальному типу выделяют две фазы — индуктивную и продуктивную. Увеличение числа АОК и титра антител при введении биологически активных веществ вообще и нДНК в частности в индуктивную фазу антителообразования может быть обусловлено влиянием на любые из процессов, в течение которых В-лимфоцит получает специфический
Влияние ДНК на количество АОК в селезенке и титр антител в сыворотках крови неинбредных мышей в возрасте 8 мес.
Группа Титр гемагглютининов (-log2) Число АОЕ xlO6 яск селезенки Число АОК на селезенку
Контроль 1 8,0+0,69*** 120±5,8*** 37600+1716,6***
Контроль 2 5,8±0,19 72±9,2 23760±1114
ДНК 1 мг/кг 6,8+0,2* 75+8,6 26650±1529
ДНК 10 мг/кг 7,8+1,2* 95+8,9* 3285611460
ДНК 100 мг/кг 8,2±2,1** 116±9,4*** 33365±1567***
Примечания. * - р<0,005; ** - р<0,01; *** - р<0,001.
Таблица 6
Действие ДНК на гуморальный иммунитет неинбредных мышей в возрасте 8 мес. (пероральное введение)
Группа Титр гемагглютининов (-log 2) Число АОЕ нах106яск селезенки Число АОК на селезенку
Контроль 1 8,010,69*** 12015,8*** 37600+1716,6***
Контроль 2 5,810,19 7219,2 23760+1114
ДНК 1 мг/кг 5,6+0,22 7518,4 2398011120**
ДНК 10 мг/кг 6,911,1* 8218,4* 3693011220*
днк 100 мг/кг 7,4+1,2** 8119,1** 3344011360
Примечания. * — р<0,005; ** - р<0,01; *** - р<0,001
антигенный сигнал и ряд дополнительных сигналов от клеток-помощников (взаимодействие кос-тимулирующих молекул С028 и СБ80) [9]. Различные этапы активации и последующего развития В-лимфоцитов находятся под контролем комплекса цитокинов. Существенно, что если активация лимфоцитов через рецептор для антигена доводит процесс активации до экспрессии генов цитокинов, то взаимодействие последних, преодолевая "точку рестрикции", завершает подготовку клетки к пролиферации. Дальнейшая диф-ференцировка клеток В-ряда проявляется превращением В-лимфоцигов сначала в плазмобласт, а затем в плазматическую клетку, секретирующую антитела. Образование плазматических клеток знаменует переход к продуктивной фазе иммунного ответа.
Поскольку нДНК оказывает влияние как на индуктивную, так и на продуктивную фазы антителообразования, можно полагать, что это вещество в продуктивный период осуществляет действие на этапе дифференцировки В-лимфоцитов в зрелые антителопродуценты и может быть связано с их влиянием на дифференцировку СВ4+Т-лимфоцитов в ТЬ2-хелперы, выделяя комплекс цитокинов (в первую очередь ИЛ-4, а также ИЛ-2, ИЛ-5, у-ИФ), действующих как ростовые факторы на предварительно активированные В-клетки, в результате чего В-лимфоцит дифференцируется в
плазматическую клетку, секретирующую антитела.
Таким образом, нДНК, которая применяется в настоящее время в качестве БАД к пище не только на Дальнем Востоке, но и в других регионах России, при пероральном применении обладает умеренным адъювантным действием и может использоваться в комплексном лечении болезней с дефектами гуморального иммунитета, а также при вакцинации лиц, низкоотвечающих на различные антигены. Кроме того, данная БАД может быть полезной для использования ее в комплексе реабилитационных мероприятий у пожилых людей.
Выводы
1. нДНК является неспецифическим стимулятором иммунного ответа на корпускулярный антиген — ЭБ в широком диапазоне доз.
2. БАД нДНК более эффективно действует на гуморальный иммунитет при подкожном введении, чем при пероральном. Однако в последнем случае наблюдается мягкое повышение показателей, что является положительным фактором, учитывая возможность бесконтрольного применения этой БАД населением.
3. нДНК оказывает стимулирующее действие как в индуктивную, так и в продуктивную фазы антителообразования.
4. Действие нДНК на гуморальный иммунитет носит дозозависимый характер.
5. БАД нДНК может включаться в комплексное лечение заболеваний, протекающих с дефектами гуморального иммунитета, а также исполь-
В течение последних лет в мире увеличилось число катастроф, в результате которых большое количество людей подверглось воздействию патогенных факторов, таких как выброс химических
зоваться при иммунореабилитации пожилых людей и при вакцинации лиц, слабо реагирующих на антигены вакцин.
Литература
1. Беседнова H.H., Касьяненко Ю.И., Эпш-тейн Л.М. и др. // Антибиотики и химиотерапия. 1999. Т.44. №10. С. 13-16.
2. Беседнова H.H., Эпштейн Л.М. Дезокси-рибонуклеиновая кислота (ДНК) из молок рыб: перспективы клинического применения. Владивосток: ТИНРО-центр, 2002. 38 с.
3. Гажа А.К., Эпштейн Л.М., Боровская Г .А. Новые медицинские технологии на Дальнем Востоке. II Дальневост. регион, конф. Владивосток: Дальнаука, 1998. С. 26-28.
4. Касьяненко Ю.И., Эпштейн Л.М., Гажа А.К. // Изв. ТИНРО. 1999. Т.125. С. 139-146.
5. Манько В.М., Петров Р.В., Хаитов P.M. // Иммунология. 2002. Т.23. №3. С. 132-138.
6. Использование препарата деринат в различных областях медицины: Мат-лы I Всерос. конф. М., 2000. С. 47.
7. Серебрянная Н.Б., Новик A.A. // Медицинская иммунология. 2001. Т.З. №1. С.27-34.
8. Федянина J1.H., Потапова В.В., Иванушко Л.А. и др. Здоровье и образование: Мат-лы меж-дун. науч.-практ. конф. Пермь, 2003. С. 281-283.
9. Ярилин A.A. Основы иммунологии. М.: Медицина, 1999. 608 с.
10. Yerne N.K, Nordin A.A. // Science. 1963. Vol.140, P. 405-407.
или радиоактивных веществ в окружающую среду. Наиболее актуальной эта проблема стала после аварии на Чернобыльской АЭС, в результате которой воздействию ионизирующей радиации
□ □□
УДК 616.155 : 618.9789 - 053.4 / 6 (571.55) Н.В. Говорин, Т.П. Злова, В.В. Ахметова
ОСОБЕННОСТИ СОДЕРЖАНИЯ ПРОВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЦИТОКИНОВ В ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ У ДЕТЕЙ С ЭКОЛОГООБУСЛОВЛЕННОЙ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТЬЮ
Читинская государственная медицинская академия, г. Чита
