CC BY
71
линарной :ин, ЮЛ. гиинали-1993. -
ингиби->ные про-, наук. -
■ :>>';;> ЯВУ "АЗ'и,
‘ ■ |% ГОТ -';?.•!! ~г ф,0 , -■ ■-г., ;>; , ,■ го • -.г-..-;
••• ' ; • -и.
л.0! : ,-С - У-,"-.. 4 ’Р1 .1! I -.-г':- 5 -г и, ■■■ •: , • -.ипЧН*1»
■ . -л ^. !Сг,; 641.12:577.15.062.001.2
• БИОКАТАЛИТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ПРЕПАРАТА МЕГАТЕРИИГ2Ох \......... л ПРИ ОБРАБОТКЕ БЕЛКОВ МЯСА
Л.В. АНТИПОВА, О.А. РЕШЕТНИК, В.Я. ПОНОМАРЕВ
Воронежская государственная технологическая академия Казанский государственный технологический университет .....
■ Мясная промышленность традиционно является поставщиком высокоценных белков и занимает важное место в обеспечении сбалансированных рационов питания. •
Вместе с тем в мясоперерабатывающей отрасли формируются значительные ресурсы низкосортного мясного сырья, богатого соединительными тканями и имеющего ограниченное применение, а также вторичные продукты переработки мяса животных - сухожилия, хрящи, фасции, стенки сосудов и др., которые совсем не используются. Высокое содержание белков в подобном сырье, необходимость повышения выхода
■ полноценных продуктов с единицы мясного сырья тре-
■ буют разработки путей рационального и максимального использования вторичных ресурсов, богатых соеди-
; нительнотканнымибелками [1]. >•.;,>
Методы биотехнологии, высоко зарекомендовавшие себя в ряде отраслей народного хозяйства, имеют положительный опыт использования и в мясной промышленности. Однако ферментные технологии обработки мясного сырья в России используются еще весьма ограниченно, требуют разработки специальных препаратов и форсированного внедрения их в производство. Растущее применение протеолитических фер-
1 ментов выдвигает важную задачу поисков удобных и экономичных источников для их получения в промышленном масштабе. В этом отношении микроорганизмы представляют исключительно перспективный объект исследований, что связано с рядом существенных преимуществ: выделением значительных количеств ферментов в окружающую среду, возможностью управления образованием ферментов за счет подбора соответствующих питательных сред и условий культивирования, способностью некоторых микроорганизмов вырабатывать ферменты, уникальные по своей субстратной специфичности или по оптимальным условиям действия.
Для обработки мясного сырья наибольший интерес имеют протеолитические ферментные препараты, действие которых основано на ферментативном гидролизе мясных белков, изменении на этой основе структурных элементов мяса и улучшении функционально-технологических свойств сырья. Следует отметить, что известные виды ферментов, применяемых в мясной отрасли,
не решают многих проблем, связанных с переработкой сырья с высоким содержанием соединительной ткани. Поэтому значительный интерес представляют ферментные препараты, обладающие высокой коллагеназ-ной активностью [2].
Объектом исследования служил препарат микробного происхождения мегатерии Г20х, вырабатываемый отечественными производителями на Вышневолоцком биохимическом заводе на основе Bacillus megaterium со стандартной активностью 900 ед./г, представляющий собой препарат кремового цвета, хорошо растворимый в воде. Он рекомендован для обработки пищевого сырья, в том числе мясного. Препарат относится к IV классу опасности. Штаммы-продуценты не обладают патогенностью. ПДК в воздухе рабочей зоны составляет 104 клеток в 1 м3. Контрольными препаратами служили протосубтилин ГЮх и трипсин.
В качестве мясного сырья использовали говядину жилованную 2-го сорта, полученную в соответствии с ГОСТ 779-87.
Оценку фракционного состава ферментного препарата определяли методом электрофореза в вертикальных пластинах градиентного (6,16%) полиакриламидного геля (stock, трис-буфер (pH 8,8). SDS (25%), вода-бидистиллят, сахароза), используя в качестве буфера для электрофореза трис-буфер с pH 8,0 (TRIS-HC1 (0,01 М), SDS-Na (25%), ЭДТА (0,001 М), глицерин (25%), бромфеноловый синий (1%), р-меркаптоэтанол (5%)) в соотношении 1 : 1 и центрифугировали 1,5 мин при 20 000 об/мин [3].
Общую протеолитическую активность (ПА) ферментных препаратов находили модифицированным методом Ансона с использованием в качестве субстрата казеина по Гаммерстену при pH 7,2 [4]. Необходимые значения pH субстрата поддерживали при помощи фосфатного буферного раствора.
Коллагеназную активность определяли гравиметрическим методом, а также по содержанию продуктов расщепления коллагена с биуретовым реактивом [5].
В качестве субстратов для определения ПА и кинетических характеристик использовали водо-, соле- и щелочерастворимые белковые фракции мяса, получаемые путем последовательного экстрагирования соответственно дистиллированной водой, солевым раствором Вебера и раствором гидроксида натрия с массовой долей 10%, с определением белка по методу Бредфорда [6j, - .-it'H'JO ' < i < . il
Субстратом для определения коллагенолитической активности служили коллагеновые массы на основе ферментативно очищенных жилок и сухожилий и химически обработанного гольевого спилка шкур крупного рогатого скота, полученные на заводе по производству искусственной колбасной оболочки Белкозин (Луга Ленинградской области).
Актомиозин для определения кинетических характеристик получали путем его осаждения из солевого раствора ацетатным буфером при pH 5,2, уплотнения и высушивания до постоянной массы.
При исследовании влияния температуры на общую ПА ферментного препарата использовали раствор субстрата с pH 7,0 при температуре 10-70°С. Максимальная активность фермента отмечается при 37°С. При 40°С начинается спад активности, интенсивная инактивация фермента наблюдается в температурном интервале 40-70°С, что позволяет использовать фермент для обработки пищевых рродуктов, так как тепловая обработка приводит к полной инактивации ферментного препарата.
При изучении влияния pH на активность ферментного препарата варьировали значения pH субстрата в диапазоне от 2 до 8 (при температуре 37°С) в соответствии с рекомендациями метода [4]. Анализ зависимости показал наличие двух экстремумов графика ПА = ХрН): один при pH 7,0, другой при рН7,5-7,8.
Полученные данные позволяют предположить наличие двух протеолитических фракций в ферментном комплексе препарата.
Известно, что поваренная соль является основным консервирующим компонентом мясных систем. В связи с этим представляло интерес изучить влияние различных концентраций поваренной соли на ПА препарата. Исследование проводили при температуре субстрата 37°С и pH 7,0. Соль вносили в раствор фермента в массовых концентрациях 0,1-6% и определяли активность согласно методу [4]. Установлено, что в пределах концентраций ЫаС1 (0-2%) ПА пропорционально возрастала, затем резко снижалась. Поэтому обработку ферментным препаратом мегатерии целесообразно проводить при массовой концентрации поваренной соли 2%, а оставшуюся часть соли вводить по окончании процесса ферментации в соответствии с рецептурой. ' ' •••*'■ '* ‘
Фракционный состав ферментного препарата определяли методом электрофореза в вертикальных пластинах градиентного (6-16%) полиакриламидного геля. Полученные результаты показали, что мегатерии Г20х гетерогенен и включает 8 основных фракций, при этом 1-я и 8-я фракции превалируют. По результатам эксперимента были определены молекулярные массы белковых фракций, лежащие в диапазоне от 11 481,5 до 28 183,8 Д.
Решающее значение в оценке целесообразности применения ферментных препаратов для обработки мясного сырья имеет их действие на различные белковые компоненты мяса, количественная оценка эффекта
гидролиза, так как соотношение белковых фракций, их состояние определяют не только технологические свойства сырья, но и его биологическую ценность. Протеолитическую активность мегатерина изучали на водо-, соле- и щелочерастворимых фракциях мяса. Дополнительно, в качестве специфических белковых субстратов, использовали плазму крови, форменные элементы крови, яичный альбумин. О специфичности препарата судили по ПА, которую определяли в соответствии с методикой [4] при температуре субстрата 37°С и pH 7,0. Полученные результаты свидетельствуют, что ферментный препарат мегатерии Г20х активно гидролизует все исследуемые субстраты. Следует отметить достаточно высокую коллагенолитическую активность (54,5%) гидролизованного белка при массовой концентрации фермента 1%.
По атакуемости белков под действием препарата их можно расположить в убывающий ряд: казеин по Гам-мерстену>солерастворимая фракция мяса>водорас-творимая фракция мяса> яичный альбумин>формен-ные элементы крови>белки плазмы крови>коллагено-вая масса.
Как известно, фермент-субстратное соотношение является одним из существенных факторов, определяющих скорость ферментативных реакций и выход конечных продуктов. Концентрация субстрата оказывает огромное влияние на скорость реакций, катализируемых ферментами. Существенную роль играет влияние изменения концентрации субстрата на начальную скорость ферментативной реакции при постоянной концентрации фермента. В таких условиях практическое значение имеет определение величины константы Михаэлиса Ат, так как 1 / Кт - есть сродство ферментак субстрату. Эксперимент проводили при варьировании концентрации субстрата [5]0 при постоянных условиях проведения реакции гидролиза (/ 37°С, pH 7,0). После статистической обработки результатов эксперимента и выражения в виде кривой Михаэлиса-Ментен в координатах V от [5] о была проведена линеаризация данных в координатах Лайнувера-Берка (у“‘-[5]0'*1) и рассчитаны константы Кт (1 • 10 5 моль) для различных субстратов:
Коллагеновые массы ; : ->3'‘4;0
Водорастворимая фракция мяса . - • . дд
Солерастворимая фракция мяса 2,5
Казеин по Гаммерстену . т , 4,8
Актомиозиновый комплекс . . 2,0.. ,
* ■ ■ ■ ■ \
Из полученных данных видно, что, несмотря на довольно значительную по сравнению с другими препаратами коллагенолитическую активность, мегатерии проявляет наибольшее сродство к соле- и водорастворимым фракциям мяса, актомиозину, в меньшей степени - к коллагену. Тем не менее, полученные результаты позволяют рекомендовать мегатерии для биотехнологической модификации низкосортного мясного сырья с
ИЗ!
ВЫ'
К0£
ра>
асс
бот
чес
до;
лаг
ни:
тял
ли
не!
0,5
ет;
ше
дес
урс
сис
М3!
стр
зеи
мае
ньг
ген
к
в
б<
с
б<
К:
ЦИК
м.в
Кубе
ных
ион
изу
>-3,-2002
ций, их иеские
Еность. али на ка. До-ых суб-ые эле-
[ЧНОСТИ
в соот-бстрата льству-
1КТИВНО
(ует откую ак-массо-
1рата их по Гам-одорас-Ьормен-
шагено-
ошение опреде-[ выход оказы-тализи-
5ТВЛИЯ-
альную гоянной актиче-ктанты мента к ювании услови-рН 7,0). кспери-Ментен ризация Ко'1) и личных
1.0 3,8 2,5 (,8 2,0 ;
я на до-I препа-гатерин |раство-йстепе-ультаты ехноло-сырья с
высокой массовой долей соединительнотканных белков с целью последующего его применения в рецептурах модифицированных мясных продуктов широкого ассортиментного спектра.
Для оптимизации технологических режимов обработки необходимо уточнить эффективную и экономически оправданную дозировку препарата, а также продолжительность процесса гидролиза.
Гидролиз проводили на различных субстратах: коллагене и белках, выделенных из различных фракций низкосортного мясного сырья, водной и солевой вытяжках. В качестве контрольного варианта использовали казеин по Гаммерстену.
- Полученные результаты показывают, что при изменении концентрации фермента в пределах от 0,1 до 0,5% степень гидролиза исследуемых белков возрастает до определенного значения. При дальнейшем повышении концентрации ферментного препарата степень деструкции белков остается практически на том же уровне, т.е. внесение большего количества препарата в систему нецелесообразно. Однако для достижения максимальной степени деструкции для различных субстратов требуется разное количество фермента. Для казеина по Гаммерстену достаточно 0,3% фермента к массе субстрата, для соле- и водорастворимых мышечных белков 0,4-0,5 и 0,7% соответственно, для коллагена 0,9-1,0%.
Таблица
Оптимальные условия гидролиза
Субстраты Концентрация фермента, % Длительность, мин
Коллагеновые массы 0,9-1 200
Водорастворимая белковая фракция 0,7 1.40
Солерастворимая белковая фракция . и 0,5 г!; -1. Я', г-' - . 100
Казеин по Гаммерстену 0,3 80
При добавлении мегатерина в массовой концентрации 0,3-1,0% степень гидролиза всех исследуемых
субстратов достигает максимума. Значения, оптимальных концентраций мегатерина для исследуемых субстратов представлены в таблице.
Как известно, одной из основных технологических характеристик процесса является его длительность. Результаты исследования влияния времени обработки препаратом мегатерина на степень гидролиза различных белковых фракций мяса свидетельствуют, что при гидролизе водо- и солерастворимых белковых фракций происходит интенсивное накопление продуктов деструкции в течение первых 1-2,5 ч, при увеличении времени воздействия ферментом прирост продуктов гидролиза невелик. В связи с этим может быть рекомендована продолжительность обработки данных субстратов мегатерином 2 ч. При обработке коллагена аналогичная степень гидролиза наблюдается после более длительного воздействия ферментом - 3,3 ч.
Таким образом, препарат мегатерии Г20х весьма эффективен для деструкции практически всех имеющихся белковых комплексов мяса. Его целесообразно использовать для смягчения мяса, получения белковых гидролизатов, ассортимента высококачественных мясопродуктов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Ратушный А.С. Применение ферментов для обработки мяса. - М.: Легкая и пищевая пром-сть, 1976. - 186 с.
2. Антипова Л.В., Глотова И.А. Основы рационального использования вторичного коллагенсодержащего сырья мясной промышленности / ВГТА. - Воронеж, 1977. -248 с.
3. Лабораторный практикум по технологии ферментных
препаратов: Учеб. пособ. - М.: Легкая и пищевая пром-сть, 1982. -240 с.
4. ГОСТ 25264.2 - 88. Препараты ферментные. Методы определения протеолитической ативности. - Введ. 01.01.89 до 01.01.94. -М.: Изд-во стандартов, 1988. - 11 с.
5. Соловьев В.И. Созревание мяса. - М.: Пищевая
пром-сть, 1966. - 342 с.
6. Справочник биохимика: Пер. с англ. / Досон Р., Элиот
Д., ЭлиотУ., Джонс К. - М.: Мир, 1991. - 544 с.
Кафедра технологии мяса и мясных продуктов '
Кафедра технологии пищевых производств
Поступила 30.08.01 г.
664.1:658.562.6
РЕЗУЛЬТАТЫ ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКОГО КОНТРОЛЯ ТОКСИЧНЫХ ИОНОВ В САХАРЕ-ПЕСКЕ
«С . - • «>
М.В. ЕСИПОВА, Р.С. РЕШЕТОВА
Кубанский государственный технологический университет
В связи с ростом техногенных загрязнений природных сред различного рода токсикантами, в том числе ионами тяжелых металлов, возникает необходимость в изучении их перераспределения в почвенно-раститель-
ном покрове. Такой контроль является одной из составных задач экомониторинга окружающей среды.
Для объективной оценки происходящих процессов необходимы регулярные данные не только о состоянии окружающей среды, но и о миграции химических элементов в продукты растительного происхождения.
В работах [1,2] было определено и проанализировано перераспределение ионов токсичных .металлов в
