БИОИНФОРМАЦИОННО-СТРУКТУРНЫЙ ПОДХОД К ПОИСКУ НОВЫХ ОКСИДАЗ D-АМИНОКИСЛОТ Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

УДК 577.322.24

Биоинформационно-структурный подход к поиску новых оксидаз D-аминокислот

Д. Л. Атрошенко1,2, Д. И. Головина1, Е. П. Сергеев1, М. Д. Шеломов1, А. Г. Ельченинов2, И. В. Кубланов12, Т. А. Чубарь1, А. А. Пометун12, С. С. Савин1, В. И. Тишков12* Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, химический факультет, Москва, 119991 Россия

2Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН,

Москва, 119071 Россия

*E-mail: [email protected]

Поступила в редакцию 22.08.2022

Принята к печати 29.09.2022

DOI: 10.32607/actanaturae.11812

РЕФЕРАТ Оксидаза D-аминокислот (DAAO, КФ 1.4.3.3) играет важную роль в жизни и прокариот, и эу-кариот - как низших (дрожжи и грибы), так и высших (млекопитающие). В геномах архей гены DAAO пока не найдены. При этом даже внутри одной группы организмов (бактерии, дрожжи и грибы, млекопитающие) DAAO характеризуются очень низкой гомологией аминокислотных последовательностей. Особенно это выражено у бактериальных DAAO. Высокая вариабельность первичных структур DAAO сильно ограничивает поиск генов новых ферментов в известных геномах. В результате многие гены DAAO (если не большинство) остаются или неаннотированными, или неправильно аннотированными. Нами предложен подход, в котором биоинформатические методы в сочетании с анализом общей структуры и структуры активного центра используются для подтверждения того, что найденный ген кодирует именно оксидазу D-аминокислот и предсказания возможного типа ее субстратной специфичности. С помощью поиска по гомологии получают набор кандидатных последовательностей, проводят моделирование третичной структуры отобранных ферментов и сравнивают их с экспериментальными и модельными структурами известных DAAO. Показана эффективность предложенного подхода для дискриминации DAAO и глициноксидаз. С использованием этого подхода в шести штаммах экс-тремофильных бактерий найдены гены новых DAAO, и впервые в мире один ген идентифицирован в геноме галофильных архей. Предварительные эксперименты подтвердили предсказанную специфичность DAAO из Natronosporangium hydrolyticum ACPA39 в отношении D-Leu и D-Phe. КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА оксидаза D-аминокислот, первичная структура, третичная структура, моделирование, AlphaFold 2, глициноксидаза.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ DAAO - оксидаза D-аминокислот; GOX - глициноксидаза.

ВВЕДЕНИЕ

Любая клетка представляет собой сложнейшую мультиферментную систему открытого типа, причем в зависимости от сложности и специфики состояния функционирования организма один и тот же фермент может выполнять разную физиологическую роль. Ярким примером является оксидаза D-аминокислот ^ААО, КФ 1.4.3.3). В бактериях, дрожжах и микроскопических грибах основная роль этого фермента сводится к утилизации экзогенных D-аминокислот (в первую очередь D-Ala) [1, 2]. У высших эукариот - позвоночных и особенно у млекопитающих, основная роль DAAO

заключается в поддержании определенного уровня D-аминокислот, которые являются регуляторами важнейших процессов, в первую очередь нервной деятельности. Например, снижение уровня D-Ser в спинномозговой жидкости за счет повышенной активности DAAO ассоциировано с шизофренией [3, 4]. При болезнях Альцгеймера и Паркинсона в нервных тканях наблюдается повышение уровня D-Ala [4, 5]. Поэтому актуальным представляется поиск эффективных и специфичных ингибиторов DAAO человека. Оксидаза D-аминокислот также широко используется на практике [6-9]. Например, DAAO из дрожжей Trigonopsis variabilis используется

в двухферментном биокаталитическом процессе получения 7-аминоцефалоспорановой кислоты (7-АЦК) из цефалоспорина С [10, 11]. Это позволяет сократить расход органических растворителей в 400 раз по сравнению с ранее используемым чисто химическим процессом. Производство 7-АЦК, используемого в качестве исходного синтона для получения полусинтетических цефалоспоринов различных поколений, достигает нескольких тысяч тонн в год.

Практическое применение фермента требует использования биокатализатора с определенными свойствами. В природе не существует универсального фермента. Его активность и специфичность определяются той ролью, которую он выполняет в природе. В большинстве биотехнологических процессов субстраты и условия проведения реакции отличаются от природных. Поэтому при разработке нового процесса, метода анализа и в прочих случаях для каждого из них проводится доводка свойств биокатализатора к требованиям процесса. Это, как правило, выполняется с помощью методов белковой инженерии. Совершенно очевидно, что в качестве исходного объекта оптимальным представляется использование фермента, свойства которого наиболее близки к требуемым. С этой целью проводят поиск генов в секвенирован-ных геномах, число которых постоянно возрастает. У оксидаз D-аминокислот из дрожжей и грибов клонированы гены и изучены свойства ферментов всего из 7 источников - Fusarium solani (FsoDAAO) [12], Trigonopsis variabilis (TvaDAAO) [13], Rhodosporidium toruloides (ранее Rhodotorula gracilis) (RtoDAAO) [14], Pichia pastoris (PpaDAAO) [15], Candida boidinii (CboDAAO) [16], Rasamsonia emer-sonii штамм YA (RemDAAO) [17] и Ogataea parapoly-morpha DL-1 [18]. Причем в последнем случае идентифицировали, клонировали и экспрессирова-ли в E. coli гены пяти разных DAAO (OpaDAAO1 -OpaDAAO5) и одной D-аспартатоксидазы (DASPO). В случае бактерий в настоящее время клонированы и описаны всего три фермента - из Rubrobacter xylanophilus (RxyDAAO), Streptomyces coelicolor (ScoDAAO) и Arthrobacter protophormiae (AprDAAO) [9]. Ни одна из бактериальных DAAO на практике не применяется. В настоящее время данные о присутствии потенциальных генов daao в геноме архей в литературе и базах данных отсутствуют. Основной причиной такого состояния в исследовании и применении бактериальных DAAO являются трудности поиска генов фермента в геномах бактерий. Всего идентифицировано немногим более 10 генов DAAO и все они найдены в геномах бактерий, принадлежащих к Acinetobacteria [7, 9]. Сложность поиска связана с тем, что аминокислотные последовательности

DAAO очень вариабельны. Поэтому традиционный широко используемый поиск по гомологии представляет собой очень непростую задачу. Кроме того, существует близкородственный фермент - глицин-оксидаза ^ОХ), которая очень часто появляется при поиске DAAO по гомологии с известными ферментами данного типа.

Второй важный момент в поиске новых DAAO -отбор кандидатов со свойствами, наиболее близкими к требуемым. Обычные DAAO за исключением высокоспецифичной D-аспартатоксидазы проявляют широкую субстратную специфичность. В зависимости от источника спектр субстратной специфичности сильно варьируется и активность с разными D-аминокислотами может отличаться на порядок и более. Более того, в ряде случаев к субстратной специфичности DAAO могут предъявляться особые требования. Например, при разработке методов диагностики нейродегенеративных заболеваний требуются DAAO, активные с D-Ser, но не с D-Ala и наоборот [5]. Поэтому для выбора DAAO с желаемой субстратной специфичностью (если ее описание отсутствует) приходится проводить клонирование, экспрессию и очистку ферментов, изучать их каталитические свойства и отбирать лучший. Совершенно очевидно, что данная процедура трудоемка, продолжительна и затратна.

Нами предложен биоинформационно-структурный подход, который позволяет с высокой достоверностью показать принадлежность кандидатных ферментов именно к DAAO, дискриминировать их от глициноксидаз, а также, используя корреляцию между субстратной специфичностью и экспериментальными и модельными структурами известных DAAO, высказать обоснованное предположение о спектре субстратной специфичности. Особый акцент сделан на использовании данных о ферментах из термотолерантных дрожжей О. parapolymorpha DL-1 (пять OpaDAAO и OpaDASPO), поскольку пять из шести ферментов демонстрируют необычные зависимости стабильности и активности от рН среды, а также имеют очень интересный и перспективный спектр субстратной специфичности. Этот подход успешно апробирован на ряде последовательностей из экстремофильных бактерий. Впервые в мире показано наличие гена daao в геноме галофильной ар-хеи.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Биоинформатический поиск генов потенциальных DAAO

Поиск новых DAAO по гомологии проводили с помощью программы BLASTp (https://blast.ncbi.nlm.nih.

gov/Blast.cgi?PAGE=Proteins) против базы данных транслированных белковых последовательностей из геномов экстремофильных бактерий. В качестве основной базы использовали базу UniProt NCBI. Также проводили поиск в геномах бактерий и архей, последовательности которых были секвенирова-ны в ходе выполнения работ в рамках Соглашения № 075-15-2021-1396 от 26.10.2021 (Федеральная научно-техническая программа развития генетических технологий на 2019-2027 годы). Для дальнейшей работы отбирали последовательности, показавшие наиболее высокую гомологию.

Множественное выравнивание отобранных последовательностей и ряда известных последовательностей бактерий и дрожжей проводили с помощью программы Clustal X 1.83.

Построение и анализ модельных структур DAAO

Для построения модельных структур ферментов использовали открытый онлайн-сервер для AlphaFold2 [19, 20]. Для множественного выравнивания использовали MMseqs2, для каждой модели было выполнено по три цикла уточнения предсказания. Генерировали по пять моделей, лучшую выбирали по pLDDT [19]. Все полученные структуры имели pLDDT более 90. Молекулу FAD встраивали, проводя оптимизацию положения в глобуле и геометрии связей в программе Coot [21].

Докинг субстратов проводили при помощи программы AutoDock [22] с ускорением на GPU [23]. Для проведения докинга использовали следующие параметры: ga_pop_size = 150, ga_num_evals = 25000000, ga_run = 20, ga_muta-tion_rate 0.02^0.08, Solis-Wets-метод. Результаты докинга отбирали, ориентируясь на положения карбоксильной группы, аминогруппы и Ca-атома D-аминокислоты, подходящих для катализа реакции. Соответствующие положения выбирали на основании кристаллических структур RtoDAAO в комплексе с D-аланином/иминопируватом (PDBID 1C0P) и pkDAAO (из почек свиньи) в комплексе с иминотриптофаном (PDBID 1DDO). Положение боковых радикалов D-аминокислот выбирали исходя из потенциально возможных взаимодействий субстрата с DAAO.

Расчет RMSD между структурами проводили по Ca-атомам, используя команду "align" пакета программ PyMol (The PyMOL Molecular Graphics System, Version 2.1.0, Schrodinger, LLC). Для расчета RMSD использовали пять циклов отклонений структурных выбросов (параметр "cycles").

Визуализацию структур проводили также с помощью программы PyMol (The PyMOL Molecular Graphics System, Version 2.1.0, Schrodinger, LLC).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Поиск новых DAAO из экстремофильных бактерий и архей по гомологии

Поиск новых потенциальных DAAO проводили по базе UniProt NCBI для геномов бактерий и совместной базе секвенированных геномов экстремофильных микроорганизмов МГУ имени М.В. Ломоносова и ФИЦ «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН. В качестве референс-ных использовали аминокислотные последовательности ферментов из дрожжей R. toruloides (более известных как R. gracilis), T. variabilis, C. boidi-nii, O. parapolymorpha DL-1 (пять DAAO и одна DASPO) и бактерий A. protophormiae, R. xylanophilus и S. coelicolor. Подробная информация об источниках последовательностей DAAO, рассмотренных в данной работе, представлена в табл. 1. В случае бактерий использовали последовательности только тех ферментов, для которых была точно показана оксидаз-ная активность. В первую очередь новые ферменты сравнивали с наиболее хорошо изученными DAOO из R. toruloides и T variabilis. Особое внимание было уделено пяти DAAO и одной DASPO из дрожжей O. parapolymorpha DL-1, поскольку это единственный на настоящий момент организм, у которого получено и изучено такое количество паралогичных ферментов. Гены daao и daspo из дрожжей O. parapolymor-pha DL-1 клонировали и экспрессировали в клетках E. coli в активной форме. Четыре DAAO и DASPO получены в высокоочищенном виде, определены их каталитические параметры с D-аминокислотами и изучены зависимости активности и стабильности при различных значениях рН, а также изучена термостабильность при значениях рН, оптимальных для стабильности. Аминокислотные последовательности DAAO позвоночных не использовали, поскольку они изначально имели низкую гомологию с ферментами микроорганизмов [1, 2, 9].

В результате поиска гомологов DAAO в бактериальных геномах, депонированных в UniProt NCBI, найдено большое количество кандидатных последовательностей, но уровень гомологии не превышал 30%. Экспертная оценка результатов поиска показала, что абсолютное большинство последовательностей с уровнем гомологии менее 23% не могут быть отнесены к DAAO. Поэтому для дальнейшей работы были отобраны только последовательности из термофильных бактерий с гомологией 24-30%. Экспертная оценка этих белков по консервативным остаткам (см. следующий раздел) позволила сузить набор до последовательностей, характерных для DAAO и GOX. Аналогичный набор процедур использовали при поиске генов потенциальных DAAO

в геномах экстремофилов и архей в базе МГУ имени М.В. Ломоносова и ФИЦ Биотехнологии РАН.

Сравнение аминокислотных последовательностей новых DAAO с известными ферментами из бактерий, дрожжей и грибов

На рис. 1 представлена часть результатов множественного выравнивания найденных последовательностей (названия новых ферментов выделены полужирным курсивом) и последовательностей референсных DAAO. Чтобы не загромождать и так большой рисунок, на нем не приведены все результаты поиска в базе UniProt NCBI. Мы оставили только найденные последовательности пяти DAAO из экстремофильных микроорганизмов и не привели данные для глициноксидаз. Однако проведено также множественное выравнивание последовательностей глициноксидаз и построены модельные структуры, по результатам анализа которых они и были отнесены к GOX. Из базы геномов МГУ и ФИЦ Биотехнологии РАН после экспертной оценки были отобраны четыре последовательности - по одной из бактерий Natronosporangium hydrolyticum ACPA39 [24] и Natroglycomyces albus ACPA22 [25] (этот фермент в результате оказался глициноксидазой), и две из археи Natrarchaeobius halalkaliphilus AArcht4 [26]. Кроме того, в выравнивании представлены последовательности из двух патогенов - Mycobacterium tuberculosis (MycDAAO) и Pseudomonas aeruginosa (PaeGOX), также найденные нами в результате поиска по гомологии. Белок P aeruginosa в базе NCBI аннотирован как DAAO.

Множественное выравнивание отобранных последовательностей проводили с помощью программы Clustal X 1.83 (рис. 1). Использование этой программы обусловлено тем, что она сама выстраивает иерархию в гомологии заданных последовательностей. Результаты такого выравнивания дали достаточно ожидаемые результаты. Как следует из рис. 1, в зависимости от источника ферменты четко разделены на две группы - вверху находятся бактериальные DAAO, за ними следуют ферменты дрожжей и грибов, сразу за ними - DAAO из архей, а затем глици-ноксидазы. Вторым интересным моментом является то, что наиболее высокую гомологию с бактериальными DAAO имеет широко применяемая и хорошо изученная TvaDAAO, в то время как вторая, даже более полно изученная RtoDAAO, находится в самом конце списка перед археями.

Как уже отмечалось, при поиске генов целевых ферментов в новых источниках используют подход, основанный на гомологии белков, выполняющих одинаковую функцию (например, катализируют одну и ту же реакцию). В ряде случаев такие фермен-

ты обладают очень высокой гомологией в области субстратсвязывающих и каталитического доменов, и тогда решение такой задачи не представляет особого труда. В качестве примера можно привести NAD(P)+-зависимую формиатдегидрогеназу (ФДГ), состоящую из двух идентичных субъединиц и не содержащую в активном центре кофакторов. Степень гомологии между ФДГ даже из эволюционно удаленных источников (например, бактерии и высшие растения) составляет не менее 55%, а при множественном выравнивании наблюдается большое количество достаточно протяженных (до 10-15 аминокислотных остатков) консервативных последовательностей во всех участках активного центра [27-29]. В DAAO уровень гомологии не превышает 30%, что намного ниже. В этом случае информация о консервативных и каталитически важных аминокислотных остатках могла бы помочь аннотации гена. Однако в случае DAAO этот подход малоэффективен. Характерной особенностью механизма действия FAD-содержащих ферментов является перенос гидрид-иона с субстрата на изоаллоксазиновое кольцо кофактора без значимого участия аминокислотных остатков фермента, основная роль которых сводится к формированию необходимой для катализа конформации активного центра и участию ряда остатков в связывании FAD и D-аминокислот. В случае кофактора обязательно наличие на N-конце фермента характеристической (fingerprint) последовательности GxGxxG [30]. Для связывания карбоксильной группы аминокислоты считалось обязательным наличие в активном центре остатков аргинина и тирозина (R285 и Y223 в RtoDAAO и R302 и Y243 в TvaDAAO). Аналогичные остатки присутствуют и в ферментах млекопитающих [1, 2]. Однако расширение выборки сравниваемых последовательностей свидетельствует, что консервативными остаются только характеристическая последовательность в FAD-связывающем домене и остаток аргинина, участвующий в связывании субстрата за счет взаимодействия с карбоксильной группой. Отметим, что подвижность этого остатка Arg сильно ограничивает соседний консервативный остаток пролина (пара ArgPro, рис. 1 , четвертый ряд выравнивания). Остаток тирозина (рис. 1, третий ряд выравнивания, середина) консервативным не является - в двух из шести оксидаз OpaDAAO, а также в двух бактериальных ферментах - MycDAAO и GthDAAO, в этом положении находятся отличающиеся по своим свойствам остатки Met, Phe, Ala и Cys. Кроме того, указанная пара признаков не может использоваться для аннотации фермента в качестве DAAO, поскольку эта же пара (характеристическая последовательность и пара консервативных остатков ArgPro) присутствует во всех глицинок-

CLUSTAL X (1.83) multiple sequence alignment

NhyDAAO GthDAAO MycDAAO SavDAAO ScoDAAO CthDAAO RhoDAAO RtaDAAO RxyDAAO RraDAAO AprDAAO TvaDAAO OpaDAAO2 NcrDAAO FsoDAAO RemDAAO CboDAAO OpaDAAO4 OpaDAAOl PpaDAAOl SpoDAAO OpaDAAO3 OpaDAAO5 OpaDASPO RtoDAAO NhaDAAO NhaGOX PaeGOX NalGOX

----------------maevdvlvv

-------------------mdvlvl

--------------maigeqqvivi

-------------metgrsgevivv

---------meteldderdgevvvv

---------------mvtsrsalvi

---------------------mivl

-------------------mdalvi

---------------mrdcgravvv

mrkeetasvrrasggsaapfdvavv

--------------mptaplritvi

------------------makivvi

------------------makiivi

-----------------ms-tivvv

-----------------msntivvv

----------------matnnivvl

-----------------mgdqivvl

-----------------msdtyvvv

-------------------mtfaiv

----------------mtdskyvii

------------mtkenkprdiviv

-------------------mkivvv

-----------------mkerivvi

-----------------mtksivvv

---------------mhsqkrvvvl

-----------------mqpditvl

---------------maerfdavvv

-----------------------mv

jlttavclaetg----rrvtvr tat epar-------ttsavagalwmpylvrpvd-kvtawgaatltelrtladqp---ttgvrrtngvvl

jltvavalaeag----havlvraaeppha-------t ts aaagalwg pwlaqpra-rvlrwae rslsalte laahp---dtgvhlasgkgv

jltsaiclaeag----wpvrvwaaalpqq-------ttsavagavwgprpkepva- kvrgwieqslhvfrd lakdp---atgvrmtpalsv

jlttaivlaesg----rrvrvwtrepver-------ttsavagalwwpyriepaa- sarawaltsfdvyee latrpg—rtgvrmveg-vq

jlttavvlaerg----rrvrlwtre paer-------ttsvvagglwwpyriepva-laqawalrsldvyee laarpg—qtgvrmleg-vl

slacarrlqaag----yhvtiitreqpks-------ttsnvaaalwypyrcapre-kalpwskatfeellrqhrdg---vpgvtpttfiel

sltaairlqeag----faprlltrdrpea-------ttsavaaavwypyray pah-rvlpwsrrtlevcydlaadp---tsgvslipfvdl

jlstaiclqeag----levevwaaempre-------stsgvaaavwypykaypqn-rvlkwggqtyaafeklagdg---qtgvrmgegvel

lsaalvlrerg----f gvrvvare pper-------ttsavaaavwypyrayped-rvlrwgartyevfrglaadp---rsgvrlregvel

lstavrlleig----rsvcvlsadppqk-------ttsnlaaavwyptefgrqd-gvlawarraydvfrelsgte---gsgvvmretlml

lsaahelaaag----hqvtvaydqelae-------cvssvaaaiwf pyhsensp-aadklladslarfeqlsehp---etgidlrrglnv

jlttalqllrk----ghevtivseftpgd---lsigytspwaganwltfydgg---kladydavsypilrelarss peagirlinqrshvl

^ittalelaqr----ghnvqivarhlpgd---vdveytspfaganwssfaqdgdy-emkewdklgyyrfmdlaenvp---------gssvv

sltcalqlakqg—gntitvvakhmpgd---ydpeytspfaganvlpmap------eynrwegetwplkrlaetcpeagihfq—kavlye

jltsalllsknk---gnkitvvakhmpgd---ydveyas pfaganhspmate----essewerrtwyefkrlveevpeagvhfq—ksriq

jlttawllskdp---snkitvaakhmpgd---ydieycspwaganylpvgaens— rvgqwe ratwphlrdiaqnhpeagihfq—dtvvy

slyttycliyeagcapakitivaeflpgd---qstlytspwaggnfscis padd—ttlaydkftylnlfkihkklggpecgldnkpstey

slytayslvyeagvspkhitiaaahipgd---qsinytspwaggnfscispgdk—kslsydrytythlaeiqkklggpscgldmrpatdy

jlytalnlv-esgvkgseitivaeylpgd---qsinytspwaggnfscispdda—qtlnfdkttythlaaiqkllg-pgcgldrrpstef

jlytawsli-dkgtgpsdikvvaeflpgd---qstlytspwaggnfslitstde—rsmkfdkftytnlhriqellggpecgldmlpstem

jlttawils-dlglap-rikviakytped---rsveytspwaganfcsisatdd—nalrwdkityhrfaylaktr—peagirfadlrel

jlttalilkrkln---cdvvvvskeipgd---adpiytstkagaqws s s pgnkr—aefsyrifdelskvpeawvtkip----------ly

jlttalelsrrg----ylvsivakelpgd---earfytspyagaffyhldslas — kgwlaqlqdiasyyeflrvaqepgsgvae rvaevy

jltcayqlaeeg----ydvtivakhlpstsi-adsqytspwagahfrpf paktpe-eyrdskltrstfqvfkklattfpe s sirfmpgtdf

.ssalilarkg----ysvhilardlped-v-ssqtfas pwaganwtpfmtltdgprqakweestfkkwvelvptg----hamwlkgtrrf

tstalaltllg----yntqivadqfayeeqhrdprf s saygagailpysvgmds — ldetfeesqtvfrlleels---vlgvrkndhywi

ssvgyhlarag----v e tavidradagr-------atdagagivspptssltggdeqfefatnaaayypelvdrlrgdgveetsyervgi

jlltarelalag----lrvtlvergesgr----easwagggivsplypwryspavtalahwsqdfypalgqrlldetgldpevhtvglywl

slgiawraaqrg----advtvfdpdpgsg----asttaagmlaavteshfgeetladlatdsvtrwpsfaaelenasglnvgyrdiptllv

NhyDAAO

GthDAAO

MycDAAO

SavDAAO

ScoDAAO

CthDAAO

RhoDAAO

RtaDAAO

RxyDAAO

RraDAAO

AprDAAO

TvaDAAO

OpaDAAO2

NcrDAAO

FsoDAAO

RemDAAO

CboDAAO

OpaDAAO4

OpaDAAO1

PpaDAAO1

SpoDAAO

OpaDAAO3

OpaDAAO5

OpaDASPO

RtoDAAO

NhaDAAO

NhaGOX

PaeGOX

NalGOX

aptaia------

savkhe------

gdrietga----

ggatleet----

getgldev----

fdhdrp------

fdrptp------

wrrevp------

lrrtstg-----

lrtpdeg-----

dhlpga------

krdlpklega--rrteriln----

--------ppawtetv-aavpcppadlphg---

--------ppewfrllpdarpctaddlpag---

--------mppglelipdvrpadpadvpgg---

--------eawalgralglraataeecpg----

--------dgwaaarlpglraasaaeyag----

--------tpwwaeatggvtrltgndlp------

--------ppawrtavrafrrarpderp-----

--------dpwwkdavsrfrrceehelp-----

--------epwwrgavsgfrrcrreelp-----

--------spwwaeaiggvervgagdlrsewg-

--------drswtrivagteeaspadlpdg---

-msaicqrnpwfkntvds feiiedrsrivhdd-------skrlpwfkdfvqdfrllskeelpdg----

rraqdeaagfagplsdglfvrnpwykdlvpdyvdlpasevpeg--rrnvdtekaqrsgf pdalfske pwfknmfedfreqhpsevipg--nrtkdqgsttgqwfs-elvkpnpwygkvlpnfrelskdelppg--

wdfypgde------------kvnslkqylkdfkvipkselpeg--

fhkyppak------------kmeslkeyvkdfrildksalpkg-

wdylpdqr------------kidslssylqdfaiipssqlpqg--

feqeldha------------kldsisqylkeyrpmtkeempeg--

weyepkhd------------kirswntyvrdfkvipekdlpge--

kgeidpkrp--------ate pdlksfvdnyewigedqqkf pg---

---yevgwrfgsvlvempiylgyladrlraa-ggriep---

---hlhgirytaplvnmpvhlaylvdrlrsa-ggavei----

---fragfhatlpmidmpqyldcltqrlaat-gceiet----

-----gglwarlplidmpahlrwlrerftaa-ggtvet---

-----tglwarlplidmsthlpwlrerllaa-ggtved---

-pgyavgfaatvpvvetplylpylveqf saa-ggtlql----

-agyvdgfvaevplietpvhlpylvarfeag-ggtievvp-

-pgyrdgyvftvpviemprylqyllerfaga-ggrltr----

-pgcrggyrfvapvaempaylayllgrfrea-ggelel----sgyaggyrfevplvempvylpwllkrfirs-ggvfee------ahagvwatvpiitmstylgwlrgrveel-gadfak---

---vaylvefasvcihtgvylnwlmsqclsl-gatvvk----

---veygheyttvaitvpiylhyllqkllsl-gvklhr----

---ms sassftsvcintaiylpwlvgqcrar-gvvfkr----

---ydsgceftsvcintaiylpwllgqcikn-gvivkr----

---idnanrftsvcintavylpwlvgqcrkn-gvvfkr----

---veygisyttwnfncpvflqnmanflnkr-nvtiir----

---ivfgisyttwnfncplflqnlasflekl-gvtiik----

---vafgikyiswnfncpkflevlkeylast-givfvr----

---vvsgvkfltwnfncplflanfqkhlaai-gvtfer----

---ciyghkattflinaphylnymyklliea-gvefek----

---vshiykfdtftisppqylaylanellkl-gvaiqr----

--apl --api --api --apv --apv --ypl --agl --spl --adv --agm --adl srpdv

vprismmetg-ierddplyen--

aqnedgllg---

deegrg-----

-ydgpwfkdvvrnyevidpreypagaa---gddivfafrytgftinpvqylhyllyrcaqs-ginyvr--

—vsagyaegienfkvlpksalpng--------ikfgatynawcmnspmyiqflerrlemyykvkivq--

-----hwykditpnyrplpssecppg---------aigvtydtlsvhapkycqylarelqkl-gatfer--

----psnapkyldgfrkve s pnalprrtg---sehvtdftaemlfadmptymeglyrlyqaaggsirkr--

-glvtdladaltv------

--gavttldqaaes------

-rplrslaeaaea------

-rtvtdlaeak--------

-ravtdlaead--------

-geltsldeacaa------

-ggvtdlaalaas------

-rvvrsleeaaea------

-revssleevagg------

-rrieslreagar------

--gtvtdlaqlkgg------

--rrvnhikdanllhssg--

-ahlhhikdaasyftdg----kvdv

-avlkhisdaaklshtg---rkpdi

--ailndiseakklshag---ktpni

--avfkhvaeaanahhsg---qkadl

--khlthisqaylt-------vntkv

--kklehlsqafls-------pntki

--rkiqnvdemfef-------art—

--skidhis svf s--------psvda

-kelshiketveet------peasv

--gvvrnfed-----------vaady

-rtvgsleeaktlfldgddfveadl

--eslgslqqvaelfp-------gat

--rtvtsleqafdg---------adl

Рис 1. Выравнивание аминокислотных последовательностей оксидаз D-аминокислот из дрожжей, бактерий и ар-хей (названия указаны зеленым, синим и черным соответственно). Соответствие названий смотри в табл. 1. Новые последовательности DAAO, проанализированные в данной работе, выделены полужирным курсивом. Зеленым фоном в выравнивании указаны остатки, которые ранее считались консервативными для связывания D-аминокислоты в активном центре DAAO. Зеленым фоном в выравнивании выделен остаток Tyr, который ранее считался консервативным для связывания D-аминокислот в активном центре

----tvtrtdltemp----------gl

vgvavdddeiep----yderlervsarnfdrldeiepdearerf pal-ae pkrafhyadaaridgrvftdslltaarthglttydgdvdri — ridrgrvtgvetaggkr------idaet

dlddqtea-------------lqwarnhtrplkevpieeayaavpglgagfqravymsgvanvrnprlarslraslqqfanlelheqtevrgwlrdgdrvvgvatsrge-------irgdk

gieegdrdnvtr--------yaglyrklgfevenltgrtarkaeplls-qrarggvrvradhevdpravhaalltaahragvhivr--------------dkvtdptag--------dadv

NhyDAAO vvnca igarelvpdp— — glr

GthDAAO vvnct lgarvlvgdr— --qly

MycDAAO vinca lgarelagda— — tvw

SavDAAO vvnct lgardlvpdt— — svr

ScoDAAO vvnct lgarelvpdp— —avr

CthDAAO vincs lgartlandp— — evf

RhoDAAO vvnct lgarrlvpdp— — sly

RtaDAAO vfnct lgarelvgdr— — lls

RxyDAAO avncs agarklvgdp— —avf

RraDAAO vvncs igarelcgdr— — evr

AprDAAO vvlaa lrggellgddd- — tvy

TvaDAAO ivncs lfarflggved- -kkmy

OpaDAAO2 tvncs llssklggvmd- -qdvf

NcrDAAO iinat llscrlggvmd- -kkvm

FsoDAAO ivnat lgsyklggved- -ktma

RemDAAO vvnct lssrklggvqd- -ntll

CboDAAO vfnct igaadlggvkd- -ekvy

OpaDAAO4 vfnct igaitlggvkd- -tnvy

OpaDAAO1 ifnct igaralg gae d- -kniy

PpaDAAO1 vfnct igaaslggvkd- -envf

SpoDAAO vfnct lwasklggved- - pdvy

OpaDAAO3 vinct iqynnidgchd- -aalr

OpaDAAO5 vvnca ihgfdlntkdk- -enrl

OpaDASPO ivncs rgltyygg-yd- -paty

RtoDAAO vvnat lgaksiagidd- -qaae

NhaDAAO linct lrspelfeds— -apyha

NhaGOX vvlag vwssafegqlgvelple

PaeGOX vllaa awsgellkplglelpvv

NalGOX vilaa cgsaafdlpvr-

?qvvvve---npg-idefvsehpgasp—wlkqvlphr---dtvvlggtae pdr sdpt--

gqqvvvt---npg-ideflevdtgdst—dliaiyphg---dhailggtaqpyswqre--

gqhvvlt---npg-leqlfiertggs---ewicyfahp---qrvvcggisipgrwdpt--

jqlvvve---npg-irtwlvstgad-g—ei

kqlvvve--kqvvrvs--kqvvrvt--jqivrvr--kqvlrva--

-npg-1hnwlvaadads g—ett

-npg-vrraltdddgpr---risi

-npg-lthaladdtgpl---aisi

-npg-lerfvldeehpe---epti

-npg-lerfmldeenpe---glti

gqvvrve---npg-lsvsvrdeenpg---grti

jqvvrla---ntknltqwlcddnypd---gvsi

|qvvlvr---nslpfmasfsstpekenedeali

gqvihar---nscpymlsvknipg-askdelli

ffpqp---grlllggtavedewslv--

flpqp--tiprq--viprr-ivprt-ivprt-

Sqvvlvr

gqivvvr---ne:

gqivvvr---nd

|qvvvvr---ap

gqvvvik---ap

gqvvvik---ap

|qvvvvr---ap

khvvlvk---ap

neatpnmvctsgtddgngdelc nessp-mlltsgvedg-gadvmy ndpgl-mcsisgtddg-ddevt?

grlllggtaeedawste--tdvilggtalphvwdtt--gdvilggtaqdgvwdrt--edcvlggtaqerrwdie--edcvlggtaeegswstr--

ihprt---edcilggtfesgnwdtt--

iiprr---ediivggtdtandwnre--

imtrf-dgt-siiggcfqpnnwsse--ifprk-egg-tiiggcfrvndwtpd--imqra-agggtilggtymkgnwdgv--lmqra-agggtilggtydvgnwesq--mmtra-agggtilggtyqkhnwdsl--

iiprpysngelvlggflqkdnwtgn---

-tYiiprpnsngelvmggflqkgistgd---

-tyiiprpdsqs qvvlggylqannwcad---

-ty viprpfsdgsivmggffqegnwsgn---

-ty iiprplngg-vicggfmqpgnwdre---

Jhtllie—ntlpyqvmfkennpve-egeflMlfprk-egcavlggiydahspafdts—

qtllve---nvarkliiveamdaah-atesl0vvpragygtlltgtylyhddsvd-----

qtllvk---spkdcpynsetvtyqledgsfcfviprpldgg-vivggtkqvgdlypq---

qtvlvk---s pckrctmdssdpasp-----aHiiprp—ggevicggtygvgdwdls---

jhlvtaqrapipkldgtmisysysvagdrkgvscf prm---dgivmggthqsvpyrpdekpcfpplne pttkiggtevpkrivelnaellaql-

qiarln---vpdtdtsswpivtgfr----hhwlvplp—dgtlvcgatleadagfdpr----------ptasgveevlaeaqrlvpdlad---

qmilyk---caadflprmvlakg-------ryaiprr—dghiligstlehsgfdkt-----------ptdealeslrasaaellpelad---

jvvlrlradqhqlqpdnivrafvrgn----pvwivpran—geivigatse-ergfdattg---------tagatwdllrnaidvvpeiaey—

-pdpsitariladsvelvpalag---

--adkattksillrcivlqpklka---

--pe peiterilqrcrriqprlae---

-pdpavaeaivrrcaawrpeiag----pdpevaaaivrrcaalrpeiag----pdaatterilrhcrelepalas----pdpettreilrkarlleprlad----pdpetaaailrrcvsleprlad---

--pdpvtaysilhrctale prlqg---

-pdpetarrilarcselvpelag---

--ve pqtsidileraaklvpeleg---

-pdpslthrilsraldrfpeltk---

--vdeglfertvararqycpelfe---

--pdpniatrimkraveacpaltg---

--pdpnianrimqrivevrpeian---

--pdpnlavrimkrcielcpslvap—

-tfgfetddivsrttsllpkil----

--tfkhetediikratemapqil----

--twktetddiirrtsqlf peig----

-tygyetedilkrglelypeigk----ihpedtldilkrtsalmpelfh---

■vhadyverlqakatkhlpelqg----

--vdagltqrikeralryapelvdsdf --vrdadtqkliengkkwf pellid— --vnpetvqrilkhclrldptissd—

NhyDAAO

GthDAAO

MycDAAO

SavDAAO

ScoDAAO

CthDAAO

RhoDAAO

RtaDAAO

RxyDAAO

RraDAAO

AprDAAO

TvaDAAO

OpaDAAO2

NcrDAAO

FsoDAAO

RemDAAO

CboDAAO

OpaDAAO4

OpaDAAO1

PpaDAAO1

SpoDAAO

OpaDAAO3

OpaDAAO5

OpaDASPO

RtoDAAO

NhaDAAO

NhaGOX

PaeGOX

NalGOX

------apvlaerv

------aeiigerv

------aavietit

------arvlehrt

------arvlahlv

------aqvlevrv

------aavlearv

------aevlehrv

------apvlehra

------arvlehhv

------levlehkv

---dgpldivrecv

---hgdldvvkvhc

gkgiealdvirhav gkgvkglsvirhav gqgiegldiirhgv

---deplhiirvaa

---dkpldvvrvaa

---nep-eilrvac

---rnelkiireaa

gkgpegaeiiqecv

----eirvlkhn-i

mknpgqlvevrqfv

----gefqikrinv

-gtiegievlrhnv -gvdversdlevsi

------atvadlrv

------mqpvahwa

-------hlaevdvnf

arpe----vrlaved--

trpt----vrleeqr--

drps----vrveaep--

argt----vrlerep--

arda----vrlergt--

grta----vrlereh--

rpt----vrleaer--

rpe----vrleree--

rpe----vrlertt--

vrrgg---vrlerd---

aret----irlehva--

gregg---prvele---grkgg---prieke---

yregg---vridke---

wrkdg---vrieee---

vredg---prieke---

srhgg---prieae---srhgg---prieve---srkgg---vrvere---

srkgg--srkgg--hrdgg--gregg--arhgg--

-vrievehfdq---arveld---v-

-vriefd-----

-vnvsrd------

-vriere-----

• — rpag-riihny

• — gpgntriihny ----igralcihny

• — lsdgrvlvhny

• — lpdgrrlvhny

• — r-gvgvvihny

• — lpgggtvihny

• — lgsgalcvhny

• — lpdgtpcihny ----perpatvhny

• — g-hplpviaay --kipgvgfvvhny --vipgvgrvvhny •-nin-gtwvvhny --klddetwivhny •-lid-gvwvvhny --vceegkltihny --evedeklvihny --prakg-llihvs --vngkdryivhny --vpgtsvplvhdy

----penpklihny

----gwr---ihny

•—vvdgtevvhcy

arrgg---prveaerivlpldrtksplslgrgsaraakekevtlvhay

lrdpegdgvrvelae-----------------------escgpvvhny

isgdg-----lpiig---------------------av petd gayvat

3speg-----ipyig---------------------pvpgfdglwlnt

3tpdn-----lpilg------------------------wkddllvat

hggg hgga hggd hgga hgga hgga hgga hgga hggs hgga hgga aaga aaga hggw hsgw hggy asgy asgy lsgy asgy asgt 'snl sahs fggs fssa hgga hgss hyrn hyrq

aelasgt------------------------------

ltlidsgaq----------------------------

vnlvggg------------------------------

aglaasw------------------------------

arlas--------------------------------

lhlarat------------------------------

valvrahharpa-------------------------

calvlerig----------------------------

aelaaaaldrnp-------------------------

velvesaerelrl------------------------

ae laaqlage pas------------------------

vsyveraltrpnl------------------------

vmlvesflrehkl------------------------

qelvdeikselklg---skl-----------------

vqlvdkvgkaak-----skl-----------------

vevvrealqqqkqrrdkarl-----------------

vkllvdnqk-vkakl----------------------

vrllikaqrgsmaal----------------------

vrlaqsykl----------------------------

tdmyfeaak----------------------------

vmlalpkikla--------------------------

fdlik--------------------------------

arlvqeralksrl------------------------

velvksakskl--------------------------

aqlvdeafqryhgaareskl-----------------

arlvreaigdrevppapvsrpapllplyrtltkhice

aelvsgerttvpdplsvdrladv--------------

adlmsgrepiidpapyapagrl---------------

aaaafgetvdslapfdparfadrhage----------

CLUSTAL X (1.83) multiple sequence alignment

NhyDAAO GthDAAO MycDAAO SavDAAO ScoDAAO CthDAAO RhoDAAO RtaDAAO RxyDAAO RraDAAO AprDAAO NhaDAAO

NhyDAAO GthDAAO MycDAAO SavDAAO ScoDAAO CthDAAO RhoDAAO RtaDAAO RxyDAAO RraDAAO AprDAAO NhaDAAO

--------maevdvlVv

-----------mdv]

------maigeqqvivi

-----metgrsgeviVv

-meteldderdgevvVv -------mvtsrsalVi

-m:

iVLGi

-------------------mdaLVi

---------------mrdcgravVv

mrkeetasvrrasggsaapfdvaVv --------------mptaplritVi

-----------------mqpditV]

:*AG

3lttAvcLaetGrrvtvrtatep--GltvAvaIaeaGhavlvraaepp--3ltsAicLaeaGwpvrvwaaalp--¡lttAivLaesGrrvrvwtrepv--ltt AvvLaerGrrv rlwtre pa--

Glac ArrLqaaGyhv tiitreqp--

3ltaAirIqeaGfaprlltrdrp--JlstAicLqeaGlevevwaaemp--GlsaAlvLre rGfgvrvvare pp--3lstAvrLleiGrsvcvlsadpp--¡lsaAheLaaaGhqvtvaydqel-

-arttSavagalwmPylvrpvdkvtawgaatltelrtladqp-ttGvrrtngvvlaptaia—ppawtetv-aavpce -hattSaaagalwgPwlaqprarvlrwaerslsaltelaahp-dtGvhlasgkgvsavkhe— ppewfrllpdarpct

-qqttSavagavwgPrpkepvakvrgwieqslhvfrdlakdp-atGvrmtpalsvgdrietgamppglelipdvrpad -erttSavagalwwPyriepaasarawaltsfdvyeelatrpgrtGvrmveg-vqggatleeteawalgralglraat -erttSvvagglwwPyriepvalaqawalrsldvyeelaarpgqtGvrmleg-vlgetgldevdgwaaarlpglraas

-ksttSnvaaalwyPyrcaprekalpwskatfeellrqhrdg-vpGvtpttfielfdhdrp—tpwwaeatggvtrlt -eattSavaaavwyPyraypahrvlpwsrrtlevcydlaadp-tsGvslipfvdlfdrptp—ppawr t av raf rrar -restSgvaaavwyPykaypqnrvlkwggqtyaafeklagdg-qtGvrmgegvelwrrevp—dpwwkdav s rf rrce

-erttSavaaavwyPyraypedrvlrwgartyevfrglaadp-rsGvrlregvellrrtstg-epwwrgavsgfrrcr -qkttSnlaaavwyPtefgrqdgvlawarraydvfrelsgte-gsGvvmretlmllrtpdeg-spwwaeaiggvervg

-aecvSsvaaaiwfPyhsenspaadklladslarfeqlsehp-etGidlrrglnvdhlpga—drswtrivagteeas

tstAlaLtllGyntqivadqfayeeqhrdprfsSaygagailPysvg-mdsldetfeesqtvfrlleels-vlGvrkndhywideegrg—psnapkyldgfrkve

-padlphg----YEVGWREGSVLVEMPIYLGYIiadrlraaGgriep

-addlpag----hlhgirytaplvnmpvhlayIvdrlrsaGgavei

- padvpgg----fragfhatlpmidmpqyldcLtqrlaatGceiet

-aeecpg-------gglwarlplidmpahlrwLrerftaaGgtvet

-aaeyag-------tglwarlplidmsthlpwIrerllaaGgtved

-gndlp----pgyavgfaatvpvvetplylpyLveqfsaaGgtlql

-glvtdladaltvaplvvncaGigarelvpDp-glrpvrGqvvvvenpg--gavttldqaaesapivvnctGlgarvlvgDr-qlypvrGqqvvvtnpg--rplrslaeaaeaapivincaGlgarelagDa-tvwprfGqhvvltnpg-

-rtvtdlaeak—apvvvnctGlgardlvpDt-svrpvrGqlvvvenpg--ravtdlaead—apvvvnctGlgarelvpDp-avrpvrGqlvvvenpg-

-geltsldeacaayplvincsGlgartlanDp-evfpirGqvvrvsnpg-

-idefvsehpgasp--ideflevdtgdst--leqlfiertggs---irtwlvstgad-g-• ihnwlvaadadsg-•vrraltdddgpr—

pderp----agyvdgfvaevplietpvhlpyLvarfeagGgtievvpggvtdlaalaasaglvvnctGlgarrlvpDp-slypirGqvvrvtnpg---lthaladdtgpl —

ehelp----pgyrdgyvftvpviemprylqyIlerfagaGgrltr—rvvrsleeaaeasplvfnctGlgarelvgDr-llspirGqivrvrnpg---lerfvldeehpe —

reelp----pgcrggyrfvapvaempaylayIlgrfreaGgelel — revssleevaggadvavncsGagarklvgDp-avfpirGqvlrvanpg---lerfmldeenpe--

-agdlrsewgsgyaggyrfevplvempvylpwLlkrfirsGgvfee-

-padlpdg----ahagvwatvpiitmstylgwLrgrveelGadfak-

spnalprrtgsehvtdftaemlfadmptymegLyrlyqaaGgsirk-

-rrieslreagaragmvvncsGigarelcgDr-evrparGqvvrvenpg---lsvsvrdeenpg----grt

-gtvtdlaqlkggadlvvlaaGlrggellgDddtvypirGqvvrlantkn—ltqwlcddnypd----gvs

--rtvtrtdltempgllinctGlrspelfeDsapyhaarGhlvtaqrapipkldgtmisysysvagdrkgv

-wlkyvlphrdtvvlGGtaepdr -dliaiyphgdhailGGtaqpys -ewicyfahpqrvvcGGisipgr ffpqpgrlllGGtavede flpqpgrlllGGtaeeda

tiprqtdvilGGtalphv

vi prrgdvilGGtaqdgv ivprtedcvlGGtaqerr ivprtedcvlGGtaeegs ihprtedcilGGtfesgn ii prrediivGGtd tand cfprmdgivmGGthqsve

-ema -ett -ris -ais -ept -glt

NhyDAAO sdptpdp---------------si tarIladsvelv pal---aga pvlae rvgl

GthDAAO wqreadk---------------attkslllrcivlqpkl---kaaeiigervgl

MycDAAO wdptpep---------------eiterIlqrcrriqprl---aeaavietitgl

SavDAAO wslvpdp---------------avaealvrrcaawrpei---agarv lehrtgl

SCODAAO wstepdp---------------evaaalvrrcaalrpei---agarv lah lvgl

CthDAAO wdttpda---------------at terIlrhcrele pal---asaqvlevrvgl

RhoDAAO wdrtpdp---------------ettrellrkarlleprl---adaavlearvgl

RtaDAAO wdiepdp---------------etaaaIlrrcvsleprl---adaevlehrvgl

RxyDAAO wstrpdp---------------vtaysIlhrctale prl---qga pvlehragl

RraDAAO wdttpdp---------------etarrIlarcselvpel---agarvlehhvgl

AprDAAO wnrevep---------------qtsidlleraaklvpel---eglevlehkvgl

NhaDAAO yrpdekpcfpplnepttkiggtevpkrIvelnaellaqlgvdversdlevsigy

iarpe----vRlavedrpag-riihnYGHGGgGvtlsWGcAreaaeLasgt------------------------------

tRpt----vRleeqrgpgntriihnYGHGGaGislsWGcAeevltLidsgaq----------------------------

dRps----vRveaep-igralcihnYGHGGdGvtlsWGcArevvnLvggg------------------------------

aRgt----vRlereplsdgrvlvhnYGHGGaGvtvaWGcAqeaagLaasw------------------------------

aRda----vRlergtlpdgrrlvhnYGHGGaGvtvaWGcAqeaarIas--------------------------------

gRta----vRlerehr-gvgvvihnYGHGGaGftlaWGcAdevlhLarat------------------------------

gRpt----vRleaerlpgggtvihnYGHGGaGft laWGcAdevvaIvrahharpa-------------------------

gRpe----vRlereelgsgalcvhnYGHGGaGvtlsWGcAreacaLvlerig----------------------------

gRpe----vRlerttlpdgtpcihnYGHGGsGvtlsWGcAeeaaeLaaaaldrnp-------------------------

vRrgg—vRlerd—perpatvhnYGHGGaGvtlsWGcAeraveLvesaerelrl------------------------

aRet----iRlehvag-hplpviaaYGHGGaGvtlsWGtAqrvaeLaaqlagepas------------------------

lRdpegdgvRvelaeescg-pvvhnYGHGGaGisvsWGcAisvarIvreaigdrevppapvsrpapllplyrtltkhice ** * .*. . ***** *...** * *

Рис. 2. Выравнивание аминокислотных последовательностей оксидаз D-аминокислот из бактерий и архей после отсеивания последовательностей глициноксидаз. Соответствие названий смотри в табл. 1. Новые последовательности DAAO, проанализированные в данной работе, выделены полужирным курсивом. Зеленым фоном в выравнивании выделен остаток Tyr, который ранее считался консервативными для связывания D-аминокислоты в активном центре

сидазах. При выравнивании последовательностей только бактериальных DAAO (рис. 2) ситуация более оптимистична. Как следует из рис. 2, в присутствии консервативной для всех оксидаз пары ArgPro в бактериальных ферментах она расширяется до последовательности GxRPxR, а также появляется новая консервативная последовательность YGHGGxG. Однако некоторые глициноксидазы также имеют такие последовательности (на рис. 2 не показано).

Одна из найденных последовательностей принадлежит DAAO из археи N. halalkaliphilus AArcht4 (NhaDAAO). Из рис. 2 хорошо видно, что аминокислотная последовательность этого фермента длиннее, чем у бактериальных DAAO. В выравнивании четко выделяются три большие вставки в районе FAD- и субстратсвязывающих доменов, а также на С-конце. Тем не менее, NhaDAAO содержит тот же набор консервативных остатков, что и в DAAO бактерий. Во втором проанализированном ферменте из N. halalkaliphilus AArcht4 - глициноксидазы NhaGOX - положение вставок и делеций очень хорошо совпадает с их положением в GOX из P. aeruginosa (рис. 1) и других глициноксидазах (не показано).

По результатам сравнения аминокислотных последовательностей можно сделать некоторое предположение о типе субстратной специфичности. При сильном различии в размерах субстрата можно легко заметить разницу в длине участков, формирующих субстратсвязывающий домен, уже на стадии

выравнивания аминокислотных последовательностей. Например, TvaDAAO, RemDAAO и FsoDAAO имеют более длинные последовательности в районе остатков 100-108 (рис. 1, левая часть второго ряда выравнивания). Это обусловлено тем, что эти ферменты способны окислять объемный цефалоспо-рин С, в то время как остальные DAAO, имеющие в этой части выравнивания делеции, цефалоспорин С не окисляют. Например, CboDAAO специфична к небольшим аминокислотам, в первую очередь к D-Ala [17]. Однако следует отметить, что поиск по гомологии не позволяет отличить классическую DAAO с широким спектром субстратной специфичности от оксидазы D-аминокислот DASPO, специфичной только к D-Asp и D-Glu. Например, OpaDAAOl (табл. 1) в аннотации генома O. parapoly-morpha DL-1 указана как D-аспартатоксидаза (DASPO), хотя наши экспериментальные данные свидетельствуют, что это абсолютно не так. Результаты наших исследований показали, что фермент имеет широкий спектр субстратной специфичности и по рН-профилям активности и стабильности он идентичен RtoDAAO и TvaDAAO. Аналогичная ситуация наблюдается и при аннотации генома Pichia pastoris. PpaDAAO1, аннотированная в геноме как окси-даза D-аминокислот, в действительности является DASPO, a PpaDAAO2, аннотированная как «гипотетический белок с низкой гомологией с оксидазой D-аминокислот» (hypothetical protein with low similarity to D-amino acid oxidase), это именно DAAO [14].

Таблица 1. Оксидазы D-аминокислот и глициноксидазы и их источники*

№ Обозначение Источник Код белка в базах данных

NCBI (GeneBank, UniProt)

Бактерии

1 GthDAAO Gandjariella thermophila WP 137812914.1

2 CthDAAO Chloracidobacterium thermophilum B WP 014099936.1

3 RtaDAAO Rubrobacter taiwanensis WP 132692836.1

4 RraDAAO Rubrobacter radiotolerans DSM 5868 WP 084263988.1

5 RbaDAAO Rhodothermaceae bacterium RA ARA94025.1

6 RxyDAAO Rubrobacter xylanophilus BAP18969.1

7 MycDAAO Mycobacterium tuberculosis WP 003899072

8 SavDAAO Streptomyces avermitilis MA-4680 BAC69383

9 ScoDAAO Streptomyces coelicolor A3(2) CAB40690

10 AprDAAO Arthrobacter protophormiae AY306197

11 PaeGOX Pseudomonas aeruginosa AAP81270

Грибы и дрожжи

12 TvaDAAO Trigonopsis variabilis AY514426

13 NcrDAAO Neurospora crassa EAA33029

14 FsoDAAO Fusarium solani BAA00692

15 RemDAAO Rasamsonia emersonii BBH51408

16 CboDAAO Candida boidinii BAB12222

17 PpaDAAO Pichia pastoris CBS7435 SCV12162

18 SpoDAAO Schizosaccharomyces pombe NP 001342883

19 RtoDAAO Rhodosporidium toruloides (Rhodotorula gracilis) U60066

20 OpaDAAO1 Ogataea parapolymorpha DL-1 XP 013932717

21 OpaDAAO2 Ogataea parapolymorpha DL-1 XP 013937260

22 OpaDAAO3 Ogataea parapolymorpha DL-1 XP 013934816

23 OpaDAAO4 Ogataea parapolymorpha DL-1 XP 013937224

24 OpaDAAO5 Ogataea parapolymorpha DL-1 XP 013937169

25 OpaDASPO Ogataea parapolymorpha DL-1 XP 013932178

База геномов МГУ имени М.В. Ломоносова и ФИЦ Биотехнологии РАН

Бактерии

26 NhyDAAO Natronosporangium hydrolyticum ACPA39 lcl|CP070499.1_prot_QSB16697.1_2115

27 NalGOX Natroglycomyces albus ACPA22 lcl|CP070496.1_prot_QSB06127.1_824

Археи

28 NhaDAAO Natrarchaeobius halalkaliphilus AArcht4 2642575300

29 NhaGOX Natrarchaeobius halalkaliphilus AArcht4 2642575587

*Новые последовательности DAAO из экстремофильных микроорганизмов, проанализированные в данной работе, выделены полужирным курсивом.

Построение модельных 3D-структур и их сравнительный анализ с известными структурами

Как уже отмечалось во «Введении», целью поиска и клонирования новых генов является не просто получение рекомбинантного фермента, а создание биокатализатора с заданными свойствами с использованием в качестве исходного фермента, наиболее

близкого к целевому. В случае DAAO сделать вывод о свойствах (в первую очередь о субстратной специфичности и оптимальном рН-профиле активности) на основе выравнивания просто невозможно. В связи с этим требуется использование дополнительных методов. Для решения поставленной задачи нами предложен подход, основанный на построении модельных трехмерных структур. На первом этапе

модельные структуры новых ферментов сравнивают с экспериментальными и модельными структурами известных оксидаз D-аминокислот и глициноксидаз.

Опубликовано много примеров, когда ферменты с низкой гомологией имеют очень близкую пространственную структуру. Наглядным примером является супервторичная структура, называемая укладкой по Россману (Rossman fold), универсальной для связывания адениновой части различных кофакторов и коферментов - NAD(P)+, FAD, ATP, SAM и др. [31]. Использование такого подхода к DAAO до недавнего времени было невозможно в силу отсутствия репрезентативного набора структур. Экспериментальные структуры получены всего для четырех ферментов - RtoDAAO и RemDAAO дрожжей и ферментов из почки свиньи (pkDAAO) и человека (hDAAO). Построена модельная структура TvaDAAO [32]. Однако этот фермент как по первичной (рис. 1), так и по третичной (табл. 2) структуре очень близок к RemDAAO. Кроме того, использованные ранее методы моделирования давали неплохие результаты только при высокой гомологии последовательностей изучаемого фермента и фермента, структура которого используется в качестве основы (template) для построения модельной 3D-структуры. Высокая точность достигалась при гомологии не менее 50-60%, что не соблюдается в случае DAAO. Ситуация кардинально изменилась, когда в 2021 году предложили новый алгоритм построения модельных структур AlphaFold [33]. В 2022 году точность предсказания была существенно улучшена [19]. Использование AlphaFold2 позволяет получить достоверную информацию о структуре как новых ферментов, так и уже описанных DAAO. Такие модельные структуры и построены в нашей работе. Всего выполнено моделирование структур 18 белков (в том числе восьми новых). В табл. 2 представлены результаты попарного сравнения модельных и экспериментальных структур оксидаз D-аминокислот и глициноксидаз. В данном случае набор анализируемых структур DAAO дополнен двумя экспериментальными структурами DAAO млекопитающих - из почки свиньи и человека, и структурами двух глициноксидаз. Кроме того, для сравнения использовали и собственные предварительные данные рентгеноструктурного анализа TvaDAAO и OpaDAAO1. Такой расширенный набор позволяет более точно провести сравнение и повысить достоверность отнесения новых белков к DAAO или GOX. Для удобства восприятия результаты сравнения, приведенные в табл. 2, выделены цветом. Зеленым фоном показаны результаты сравнения структур с RMSD до 1 А, светло-зеленым -с RMSD от 1 до 2 А, светло-оранжевыми - с RMSD

от 2 до 6 А и оранжевым - с RMSD выше 6 А. Можно отметить несколько важных и интересных результатов анализа данных табл. 2.

1. Последняя модификация алгоритма AlphaFold в версии 2022 года [19] действительно позволяет получить модельные структуры с очень высокой точностью. Это хорошо видно при сравнении модельной и экспериментальной структур OpaDAAO1. Среднеквадратичное отклонение между этими структурами составляет всего 0.38 А. RMSD между модельной и экспериментальной структурами TvaDAAO немного больше - 0.56 А (в табл. 2 не показано), но следует учитывать, что эти ферменты имеют разную олигомерную структуру (OpaDAAO1 - мономер, TvaDAAO - ди-мер). Высокая точность предсказания структуры OpaDAAO1 приводит к тому, что попарное сравнение модельной и экспериментальной структур OpaDAAO1 с модельными и экспериментальными структурами других ферментов дает практически одинаковые значения RMSD (табл. 2, строки 1 и 8).

2. Наблюдается четкая корреляция между функцией и общей структурой оксидаз D-аминокислот и глициноксидаз. Величина отклонения RMSD между структурами DAAO не превышает 2 А, в то время как при сравнении структур DAAO и ООХ значение RMSD составляет 3 А и более (до 15-18 А). Из общей картины выпадают результаты с NhaDAAO из архей - отклонение модельной структуры от структур других DAAO составляет 2.0-3.5 А (в случае OpaDAAO3 отклонение достигает даже 4.69 А). В то же время разница в структуре NhaDAAO с глициноксидазами намного больше - от 9 до 17 А. Также отметим, что этот фермент имеет общую структуру, близкую к DAAO человека (RMSD всего 1.96 А). Такие результаты показывают, что для корректного подтверждения, что данный фермент является DAAO, следует использовать как можно более широкую выборку структур известных оксидаз D-аминокислот. Тем не менее, несмотря на то что результаты общего сравнения структуры NhaDAAO со структурами других DAAO в целом немного выходят за пределы граничного значения 2 А, анализ гомологии и сравнение общей структуры позволили отнести этот фермент к оксидазам D-аминокислот. Этот вывод полностью подтверждает результаты сравнения структуры активных центров.

Сравнительный анализ структур активных центров DAAO

На следующем этапе мы сравнили структуры активных центров новых DAAO с известными оксида-зами D-аминокислот. Совпадение структуры нового фермента со структурой активного центра другой

п га Ч х

и *

О X X

и с

о с

и *

о

X

га

п га Ч х

и *

О X

га

а >•

н

а

•

<и

<и

х

<и х о

с

*

н

О

а)

0 х т

н га а ч

га

ш *

<и

1

Ч

ш а

и

га и

с

уо га

2 ю сь 5 0 со 5 сь 5 2 со 5 0 0 0 со со 4 4 0

огнвААО ю сь с-- о о о с-- с^ со с^ с--

^ о ^^ ^^ со 10

2 сь 2 ю 4 ю со со 2 5 4 1 1 с^ 1 5 5 со 0 4

ЯгаВААО съ с-- со с^ сь

о о ^ о ^ ю со со с; о

0 ю со 2 со 1 со 2 1 со 1 ю сь 1 со 2 с^ ю 0 со 4

сгнвААО со со со 1-й с^ со со с^ с^ ю с

о о о ^^ ^ о ^ с

со 0 1 со 4 со со ю 0 с^ 0 0 1 2 1 0 ю 5 со

ЯЬаВААО со со ю с^ со сь с^ со

1 о 1 1 1 1 1 1 1 о 1 11 со с; о

1 ю ю ю 5 [г-- 5 со ю 1 5 со 4 ю со 0 1 5 ю

РаеООХ р с^ со с^ со со с^

^ Ю ы с^^ со 11 сб со ю 1 1 10 2 1 1 с; сб со

5 0 2 с^ 4 0 4 4 ю со ю со 5 со ю с^ 5 0 со 2 1 1

ЯгаВААО о со со со со с-- со с^

^ о ^ ^ о со с; о

со 1 1 со 0 5 0 1 со 1 1 ю 1 0 5 2 со

таООХ со с-- ю о с^ со ^

со 11 со сь 1 о 1 с; 1 11

сь 2 1 4 2 1 2 4 со со со ю 4 со со 5 0 1 с^ 4 1 со с^ 0

шгоох С-- с-- сь со с^ с^

Ы со ы 11 сб 1 1 с^ 1 с; 1 с^^ 1 1 со ю

со 1 0 0 4 5 5 4 сь 1 с^ 5 1 со сь 0 5 ю 0 1 ю 0

туВААО съ сь с^ 1-й о со о о с ю

о о ^^ ^^ ^^ с

0 2 сь 1 0 4 4 5 со со ю 0 ю со со 1 0

таВААО ю ся о с^ с^ ы ю

со с^ со 1 с; 1 10 1

2 сь 4 со 4 [г-- со 5 2 2 2 со 0 ю со со 1 с-- 5 0 сь 1 5

IDA_OX_6PXS с-- сь ю со с^ с^ о со

Ы 10 12 21 с^ со 15 1 о с^ 1 1 ю со

2 1 0 0 1 5 со 5 ю 1 0 со 0 со со 1 4 1 5 1 с^ ю 4 со

GOX 1NG4 Ю с^ с^ со со с^ с^

5.0 Ю со с^ тн со с ^^ ^ ^^ со

со 4 4 со ю 0 4 5 2 4 1 0 со 2 со 5 ю со 1 5 с--

pkDAAO_1KIF со со со сь с^ со ю сь о со о с^ с^

^ ^ ^^ ^^ о со тн тн ^^

0 со 0 с^ со со 5 0 1 0 со ю со со со 0 со 2 со

hDAAO_2DU8 ю с^ сь с сь с^

1 1 1 1 1 1 1 1 с ^ 1 1 сб 1 со 1 1 1 1

0 сь со со с-- 5 со 2 со 0 ю 4 1 0 1 со 1 со с^ с^ 1 ю 5

RemDAAO_7CT4 р С-- о со со с-- о

1 о 1 1 1 с 1 1 14 12 сб 1 1

со 4 5 0 1 со со 0 со 2 ю 5 5 сь со 0 5 ю 2 со

RtoDAAO_1C0P съ со с? со со ю со со со ю со со сь

о о 1 1 1 1 о с; ^ 1 1 со со ^ ю о о ^ 1

со 2 со 1 ю со 0 со 2 5 5 1 со ю 4 4 5 4 [г-- со со со

OpaDAAO1_RSA со со с^ сь с^ со со с^

о о ^^ ^^ с; о ^^ с^ ^^ о о

сь ю 1 сь 0 со со со со 4 со с-- 4 5 2 0 4 5 со 1 ю 5

TvaDAAO_RSA 00 р о с с-- с^ с^ с^ сь с^ сь

о о 1 1 с; 1 1 ^ со 11 1 1

ю со 0 5 0 1 5 со 0 5 4 4 5 5 со 0 ю 4 со 4 со

OpaDASPO со о с^ с^ о ю с^ со сь о

^ ^ ^^ ^ ^ ^^ ^ ^^ с^^ ^^ со

4 4 2 ю 0 5 0 0 1 со 0 4 2 ю 4 ю со 2 0

OpaDAAO5 С-- с^ с^ . Т—1- с-- ю с--

^ о о ^ сб сб сб 11 ^^ ^^

сь 1 4 0 ю 0 1 1 со 0 со 0 4 1 0 4 сь 1 5

OpaDAAO4 со Т—1- с^ 1-й о с^ 1-й сь с^ с^

^ о с; о ^^ ^ ^^ 21 ы ^ со ^^ ^^ ^

со 1 0 4 2 со с^ со 5 со со 4 0 ОЪ 0 1 2 ю 0 со 2

OpaDAAO3 С-- Т—1- со со <ю со со со 1-й

о о с; ^ ^ ^ 2 ю со ^ о ^ ^

сь 0 1 1 4 2 4 сь 4 1 5 1 2 1 0 ю ю

OpaDAAO2 с-- р с-- со с^ с^ с^ С\1 сь со со с^ с^

о с о о о ^^ ю 10 ы [Г^ ^ о ю о

0 сь со 4 с^ со со 0 0 со 2 2 0 со с^ со 5 1 со 0 2 2

OpaDAAO1 р С-- с^ со с^ с^ со ю с^ ю

с о сб со ^^

< < сл с* 4 н 8 сл

о 2 0 3 0 4 0 5 0 о - сл о о 7 1 р 0 4 ^ О О Х Х О Х О О О О

к 0> 2 & 0> е < < < < < сл _ _ _1 _ 2 _1 г 6 А А ХО О А ХО А А А А

< 0 я & о < 0 я & о < 0 я & о < 0 я & о < 0 я & о < 0 я & о и < < 0 я > н < < 0 я & о 0 < < © £ RemDAA( hDAAO_ 0 < < СОХ_1х IDA_Ox_ § а у о а ^ а - к а ^ а Р ^ а Ь к 2 е

5

О т X

и

о. •

X X

о.

56

•

с

о □

х

<и

с

ф

д

.0 т

О УО га

.

> х О х х га Ч

.о X X

га т

О

.

х т х С га х га О

.

о" <

< о

и О X .0 с <и

о ч ш с

и

о □

а) .0 т

0

1

Л NhaDAAO Б 0paDAA02

Рис. 3. Модельные структуры активных центров NhaDAAO из архей N. halalkaliphilus AArcht4 (Л) и OpaDAAO2 из метилотрофных дрожжей O. parapolymorpha DL-1 (Б)

описанной ранее оксидазы D-аминокислот однозначно доказывает принадлежность новой DAAO к семейству оксидаз. Структура FAD-связывающего домена должна быть очень близкой во всех DAAO, однако из-за различной специфичности структура субстратсвязывающих доменов должна отличаться достаточно значительно как по объему, так и по типу остатков, участвующих в связывании конкретной D-аминокислоты. Поэтому совпадение структур субстратсвязывающих доменов активного центра позволяет однозначно доказать, что новый фермент относится к семейству DAAO и сделать достаточно достоверный вывод о возможном спектре субстратной специфичности. В этом случае особенно полезно сравнение со структурами активных центров DAAO из дрожжей O. parapolymorpha DL-1, поскольку эти ферменты сильно отличаются друг от друга как по профилю субстратной специфичности, так и по рН-зависимостям активности и стабильности. Наиболее наглядно эффективность такого сравнения видна на примере NhaDAAO из архей. Как отмечено выше, этот фермент имеет заметные отличия от других DAAO как по длине аминокислотной последовательности, так и по общей структуре. Однако результаты сравнения структуры именно активных центров свидетельствуют, что NhaDAAO и OpaDAAO2 имеют практически идентичные активные центры (рис. 3). При выравнивании общих структур по кофактору FAD видно,

что в субстратсвязывающем домене помимо консервативного остатка Arg (см. выше) имеются еще два участвующих в связывании субстрата остатка - Tyr и Phe, расположение которых в активных центрах NhaDAAO и OpaDAAO2 практически идентично. Кроме того, результаты моделирования структуры активного центра самой OpaDAAO2 полностью согласуются с экспериментальными данными, согласно которым наилучшими субстратами являются D-аминокислоты с гидрофобными боковыми группами - D-Phe (самая высокая активность), D-Tyr и D-Leu. Поэтому вполне логично предположить, что таким же спектром субстратной специфичности должна обладать и NhaDAAO. По результатам сравнения с активным центром OpaDAAO3 предсказана также высокая специфичность к D-Leu и D-Phe и фермента из N. hydrolyticum ACPA39 (NhyDAAO) (на рис. не показано). В настоящее время ген этого фермента клонирован в нашей лаборатории, проводятся работы по его экспрессии в клетках E. coli. Предварительные эксперименты подтвердили, что наилучшим субстратом NhyDAAO являются именно D-Leu и D-Phe (детальное описание получения и изучение свойств NhyDAAO будет представлено в отдельной публикации).

Сравнение структур DAAO показало, что активные центры ферментов из G. thermophila (GthDAAO) и из R. radiotolerans DSM 5868 (RraDAAO) достаточно уникальны. В GthDAAO в связывании боковых

Рис. 4. Докинг D-Ala, D-Asp и D-Lys в активный центр DAAO из G. thermophila (Л) и докинг D-Ala, D-Glu и D-Lys в активный центр DAAO из R. radiotolerans DSM 5868 (Б)

групп субстратов должны принимать участие карбоксильные группы боковых групп остатков Glu202 и Asp204 (рис. 4А). Это предполагает, что данный фермент может быть специфичен к D-Lys и D-Arg, однако докинг различных D-аминокислот свидетельствует, что обе карбоксильные группы остатков Glu202 и Asp204 расположены на довольно большом расстоянии (более 3 А) от молекулы субстрата. Более интересная картина наблюдается в случае RraDAAO (рис. 4Б). В связывании боковых групп субстрата могут участвовать положительно заряженный остаток Arg226 и отрицательно заряженный остаток Glu228. Докинг в активный центр различных D-аминокислот позволяет предположить, что RraDAAO должна быть специфичной к положительно заряженному D-Lys и потенциально активной с D-Glu. Клонирование гена этого фермента представляет интерес, так как D-Lys является плохим субстратом для всех описанных DAAO.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты проведенных экспериментов позволяют сделать несколько выводов.

Введение второго этапа - структурного анализа - при идентификации генов новых оксидаз D-аминокислот, после проведения поиска в геномах по гомологии является высокоэффективной и необходимой процедурой. На этом этапе удается не только однозначно подтвердить принадлежность нового фермента к DAAO, но и предсказать возможный спектр его субстратной специфичности. Достоверность такого предсказания для новой DAAO из бактерий R. radiotolerans DSM 5868 высокой активности с D-Leu и D-Phe подтверждена экспериментально.

Аминокислотные последовательности оксидаз D-аминокислот из бактерий имеют низкую гомологию (не более 30%). В ходе анализа последовательностей бактериальных DAAO выявлены новые характерные консервативные участки, которые могут быть использованы для идентификации данных ферментов при их поиске в геномах. Присутствие новых консервативных участков показано и в последовательности DAAO из археи N. halalkaliphilus AArcht4 (NhaDAAO).

Впервые ген оксидазы D-аминокислот найден в геноме архей. По сравнению с бактериальными DAAO фермент NhaDAAO из архей имеет более длинную аминокислотную последовательность и меньшее сходство общей трехмерной структуры, но результаты структурного анализа однозначно показали, что активный центр NhaDAAO практически идентичен активному центру OpaDAAO2 из метило-трофных дрожжей O. parapolymorpha DL-1. Также в геноме N. halalkaliphilus AArcht4 идентифицирована глициноксидаза, которая по своей гомологии наиболее близка к GOX из P. aeruginosa.

Оксидазы D-аминокислот играют важную роль в функционировании микроорганизмов и млекопитающих. Именно поэтому поиск ингибиторов hDAAO человека является одним из самых активных и актуальных направлений исследований этого фермента [34]. Достоверная идентификация в геноме возбудителя туберкулеза гена оксидазы D-аминокислот (MycDAAO) позволяет рассматривать этот фермент в качестве мишени для разработки нового типа лекарств против туберкулеза. В силу редкой встречаемости DAAO в бактериях и благодаря существенным отличиям этого фермента от других DAAO (в первую очередь от hDAAO) специфические инги-

биторы, связывающиеся именно с MycDAAO, могут быть использованы в качестве противотуберкулезных средств. •

Авторы декларируют отсутствие конфликта интересов. Поиск генов новых оксидаз Б-аминокислот в геномах экстремофильных бактерий и архей выполнен в рамках Соглашения № 075-15-2021-1396 от 26.10.2021 о предоставлении из федерального бюджета грантов в форме субсидий на реализацию

отдельных мероприятий Федеральной научно-технической программы развития генетических технологий на 2019—2027 годы. Клонирование генов, экспрессия, выделение, характеристика и построение модельных структур ферментов из дрожжей О. parapolymorpha БЬ-1 выполнены в рамках гранта Российского фонда фундаментальных исследований (РФФИ № 21-34-70040 мол_а_мос.). Анализ последовательностей ферментов из патогенных микроорганизмов выполнен в рамках государственного задания.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Tishkov V.I., Khoronenkova S.V. // Biochemistry (Moscow). 2005. V. 70. № 1. P. 40-54. doi: 10.1007/s10541-005-0050-2

2. Pollegioni L., Piubelli L., Sacchi S., Pilone M.S., Molla G. // Cell Mol. Life Sci. 2007. V. 64. P. 1373-1394. doi: 10.1007/ s00018-007-6558-4

3. Chumakov I., Blumenfeld M., Guerassimenko O., Cavarec L., Palicio M., Abderrahim H., Bougueleret L., Barry C., Tanaka H., La R.P., et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. V. 99.

P. 13675-13680. doi: 10.1073/pnas.182412499

4. Cheng Y.J., Lin C.H., Lane H.Y. // Int. J. Mol. Sci. 2021. V. 22(20). P. 10917. doi: 10.3390/ijms222010917

5. Pernot P., Mothet J.P., Schuvailo O., Soldatkin A., Pollegioni L., Pilone M., Adeline M.T., Cespuglio R., Marinesco S. // Anal. Chem. 2008. V. 80. P. 1589-1597. doi: 10.1021/ac702230w

6. Khoronenkova S.V., Tishkov V.I. // Biochemistry (Moscow). 2008. V. 73. P. 1511-1518. doi: 10.1134/s0006297908130105

7. Pollegioni L., Molla G., Sacchi S., Rosini E., Verga R., Pilone M.S. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2008. V. 78. P. 1-16. doi: 10.1007/s00253-007-1282-4

8. Pollegioni L., Molla G. // Trends Biotechnol. 2011. V. 29. P. 276-283. doi: 10.1016/j.tibtech.2011.01.010

9. Takahashi S., Abe K., Kera Y. // Bioengineered. 2015. V. 6. P. 237-241. doi: 10.1080/21655979.2015.1052917

10. Pollegioni L., Caldinelli L., Molla G., Sacchi S., Pilone M.S. // Biotechnol. Prog. 2004. V. 20. P. 467-473. doi: 10.1021/ bp034206q

11. Atroshenko D.L., Shelomov M.D., Zarubina S.A., Negru N.Y., Golubev I.V., Savin S.S., Tishkov V.I. // Int. J. Mol. Sci. 2019. V. 20. P. 4412. doi: 10.3390/ijms20184412

12. Isogai T., Ono H., Ishitani Y., Kojo H., Ueda Y., Kohsaka M. // J. Biochem. 1990. V. 108. P. 1063-1069. doi: 10.1093/oxford-journals.jbchem.a123306

13. Gonzalez F.J., Montes J., Martin F., Lopez M.C., Ferminan E., Catalan J., Galan M.A., Dominguez A. // Yeast. 1997. V. 13. P. 1399-1408. doi: 10.1002/(SICI)1097-0061(199712)13:15<1399

14. Pollegioni L., Molla G., Campaner S., Martegani E., Pilone M.S. // J. Biotechnol. 1997. V. 58. P. 115-123. doi: 10.1016/s0168-1656(97)00142-9

15. Klompmaker S.H., Kilic A., Baerends R.J., Veenhuis M., van der Klei I.J. // FEMS Yeast Res. 2010. V. 10. P. 708-716. doi: 10.1111/j.1567-1364.2010.00647.x

16. Yurimoto H., Hasegawa T., Sakai Y., Kato N. // Biosci. Biotechnol. Biochem. 2001. V. 65. P. 627-633. doi: 10.1271/ bbb.65.627

17. Shimekake Y., Furuichi T., Abe K., Kera Y., Takahashi S. // Sci. Rep. 2019. V. 9. P. 11948. doi: 10.1038/s41598-019-48480-y

18. Atroshenko D., Shelomov M., Zhgun A., Avdanina D., Elda-

rov M., Pometun A., Chubar T., Savin S., Tishkov V. // FEBS Open Bio. 2018. V. 8(S1). P. 190. doi: 10.1002/2211-5463.12453

19. Jumper J., Hassabis D. // Nat. Methods. 2022. V. 19. P. 1112. doi: 10.1038/s41592-021-01362-6

20. Mirdita M., Schutze K., Moriwaki Y., Heo L., Ovchinnikov S., Steinegger M. // Nat. Methods. 2022. V. 19. P. 679-682. doi: 10.1038/s41592-022-01488-1

21. Emsley P., Lohkamp B., Scott W.G., Cowtan K. // Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 2010. V. 66. P. 486-501. doi: 10.1107/S0907444910007493

22. Morris G.M., Huey R., Lindstrom W., Sanner M.F., Belew R.K., Goodsell D.S., Olson A.J. // J. Comput. Chem. 2009.

V. 30. P. 2785-2791. doi: 10.1002/jcc.21256

23. Santos-Martins D., Solis-Vasquez L., Tillack A.F. // J. Chem. Theory. Comput. 2021. V. 17. P. 1060-1073. doi: 10.1021/ acs.jctc.0c01006

24. Sorokin D.Y., Elcheninov A.G., Khijniak T.V., Zaharycheva A.P., Boueva O.V., Ariskina E.V., Bunk B., Sproer C., Evtush-enko L.I., Kublanov I.V., Hahnke R.L. // Appl. Microbiol. 2022. V. 45. P. 126307. doi: 0.1128/AEM.02193-14

25. Sorokin D.Y., Khijniak T.V., Zakharycheva A.P., Elcheni-nov A.G., Hahnke R.L., Boueva O.V., Ariskina E.V., Bunk B., Kublanov I.V., Evtushenko L.I. // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2021. V. 71. P. 04804. doi: 10.1099/ijsem.0.004804

26. Sorokin D.Y., Elcheninov A.G., Toshchakov S.V., Bale N.J., Sinninghe Damste J.S., Khijniak T.V., Kublanov I.V. // Appl. Microbiol. 2019. V. 42. P. 309-318. doi: 10.1016/j.sy-apm.2019.01.001

27. Alekseeva A.A., Savin S.S., Tishkov V.I. // Acta Naturae. 2011. V. 3. P. 38-54. PMID: 22649703

28. Tishkov V.I., Popov V.O. // Biochemistry (Moscow). 2004. V. 69. P. 1252-1267. doi: 10.1007/s10541-005-0071-x.

29. Tishkov V.I., Popov V.O. // Biomol. Eng. 2006. V. 23. P. 89110. doi: 10.1016/j.bioeng.2006.02.003

30. Baker P.J., Britton K.L., Rice D.W., Rob A., Stillman T.J. // J. Mol. Biol. 1992. V. 228. P. 662-671. doi: 10.1016/0022-2836(92)90848-e

31. Rao S.T. Rossmann M.G. // J. Mol. Biol. 1973. V. 76. P. 241256. doi: 10.1016/0022-2836(73)90388-4

32. Tishkov V.I., Khoronenkova S.V., Cherskova, N.V., Savin S.S., Uporov I.V. // Moscow Univ. Chem. Bull. 2010. V. 65. № 3. P. 121-126. doi: 10.3103/S0027131410030028

33. Jumper J., Evans R., Pritzel A., Green T., Figurnov M., Ronneberger O., Tunyasuvunakool K., Bates R., Zidek A., Potapenko A., et al. // Nature. 2021. V. 596. P. 583-589. doi: 10.1038/s41586-021-03819-2

34. Pollegioni L., Sacchi S., Murtas G. // Front. Mol. Biosci. 2018. V. 5. P. 107. doi: 10.3389/fmolb.2018.00107