CC BY
18
НАУЧНЫЙ ОБЗОР УДК 577.15.1
ФИЗИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ Б-АМИНОКИСЛОТ И БИОАНАЛИТИЧЕСКИЙ ПОТЕНЦИАЛ ОКСИДАЗ Б-АМИНОКИСЛОТ
Владимир Иванович Тишков1, Михаил Дмитриевич Шеломов2, Анастасия Александровна Пометун3, Святослав Сергеевич Савин4, Денис Леонидович Атрошенко5
1 5 Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, химический факультет, Москва, Россия
13 5
' ' Институт биохимии им. А.Н. Баха, Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» Российской академии наук, Москва, Россия
Автор, ответственный за переписку: Владимир Иванович Тишков, vitishkov@gmail.com
Аннотация. Оксидаза Б-аминокислот (БААО) играет важную роль в функционировании как прокариот, так и эукариот. БААО все более активно используется на практике, в том числе и для определения Б-аминокислот в сложных образцах, включая ткани и жидкости человека. Во всех организмах, как правило, имеются два типа БААО. Первый тип - это фермент, высокоспецифичный к Б-аспартату, он имеет собственное название Б-аспартатоксидаза (БА8-РО). БААО второго типа характеризуется широким спектром субстратной специфичности, при этом предпочтение к той или иной Б-аминокислоте варьирует от источника к источнику. Активность БААО с большим числом субстратов сильно затрудняет селективное определения конкретной Б-аминокислоты. Проблема часто решается выбором фермента, у которого в условиях анализа активность с другими Б-аминокислотами, находящимися в образце, низкая или отсутствует. Нами для удобства процедуры выбора конкретного фермента собраны и проанализированы литературные данные о каталитических параметрах известных БААО с наиболее важными Б-аминокислотами. Кроме того, представлены аналогичные данные для новых рекомбинантных БААО из метилотрофных дрожжей Ogataea рагаро1утогрка БЬ-1. Анализ данных показал, что с некоторыми Б-аминокислотами новые ОраБА8РО и ОраБААО имеют самые высокие каталитические параметры.
Ключевые слова: оксидаза Б-аминокислот, физиологическая роль, каталитические параметры, субстратная специфичность, Ogataea рагаро1утогрка БЬ-1
БО1: 10.55959/М8Ш579-9384-2-2023-64-2-72-84
Список сокращений: БААО - оксидаза Б-аминокислот, БА8РО -Б-аспартатоксидаза.
Финансирование. Поиск, сбор и анализ данных по каталитическим свойствам оксидаз Б-аминокислоит выполнен в рамках Соглашения № 075-15-2021-1396 от 26/10/2021 о предоставлении из федерального бюджета грантов в форме субсидий на реализацию отдельных мероприятий Федеральной научно-технической программы развития генетических технологий на 2019-2027 годы. Определение кинетических параметров новых БААО и БА8РО из дрожжей О. рагаро1утогрка БЬ-1 выполнены в рамках гранта Российского фонда фундаментальных исследо-
© Тишков В.И., Шеломов Д.М., Пометун А.А., Савин С.С, Атрошенко Д.Л., 2023
ваний РФФИ 21-34-70040 мол_а_мос. Сбор и анализ литературных источников по физиологической роли оксидаз D-аминокислот выполнен в рамках государственного задания.
Для цитирования: Тишков В.И., Шеломов Д.М., Пометун А.А., Савин С.С., Атрошенко Д.Л. Физиологическая роль D-аминокислот и биоаналитический потенциал оксидаз D-аминокислот // Вестн. Моск. ун-та. Сер. 2. Химия. Т. 64. № 2. С. 72-84.
SCIENTIFIC REVIEW
PHYSIOLOGICAL ROLE OF D-AMINO ACIDS AND BIOANALYTICAL POTENTIAL OF D-AMINO ACID OXIDASES
12 3
Vladimir I. Tishkov , Michail D. Shelomov , Anastaiya A. Pometun , Svyatoslav S. Savin4, Denis L. Atroshenko5
1-5 Department of Chemistry, Lomonosov Moscow State University, Moscow, Russian Federation
1 3' 5 Bach Institute of Biochemistry, Federal Research Centre "Fundamentals of Biotechnology" of the Russian Academy of Sciences, Moscow, Russian Federation Author for correspondence: Vladimir I. Tishkov, vitishkov@gmail.com
Abstract. D-amino acid oxidase (DAAO) plays an important role in the functioning of both prokaryotes and eukaryotes. DAAO is increasingly being used in practice, including for the determination of D-amino acids in complex samples, including human tissues and fluids. There are generally two types of DAAO in all organisms. The first type is an enzyme highly specific for D-aspartate and has its own name D-aspartate oxidase (DASPO). DAAO of the second type is characterized by a wide spectrum of substrate specificity, with preference for one or another D-amino acid varying from source to source. The activity of DAAO with a large number of substrates greatly complicates the selective determination of a particular D-amino acid. The problem is often solved by choosing an enzyme that, under the conditions of analysis, has low or no activity with other D-amino acids present in the sample. For the convenience of selecting a particular enzyme, we have collected and analyzed literature data on the catalytic parameters of known DAAOs with the most important D-amino acids. In addition, similar data are presented for novel recombinant DAAOs from the methylotrophic yeast Ogataea parapolymorpha DL-1. Analysis of the data shows that, with the D-amino acid series, the new OpaDASPO and OpaDAAO have the highest catalytic parameters.
Keywords: D-amino acid oxidase, physiological role, catalytic parameters, substrate specificity, Ogataea parapolymorpha DL-1
List of abbreviations: DAAO - D-amino acid oxidase, DASPO - D-aspartate oxidase
Financial support. Search, collection and analysis of kinetic data for D-amino acids oxiddases was don under financial support of State agreement № 075-152021-1396 оf 26/10/2021 for grants from Federal budget in the frame of Federal sintific-research program for development of of genetic technologies in 2019-2027. Determination of kinetic parameters of new DAAO and DASPO from the O. parapolymorpha DL-1 yeast was done under financial support of Russian Foundation for Basic Research, grant RFBR 21-34-70040 mol_a_mos. Search of literature about physiological role of D-amino acids was done within state research programme.
For citation: Tishkov V.I., Shelomov M.D., Pometun A.A., Savin S.S., Atroshenko D.L. Physiological Role of D-Amino Acids and Bioanalytical Potential of D-Amino Acid Oxidases // Vestn. Mosk. un-ta. Ser. 2. Chemistry. T. 64. № 2. P. 72-84.
Оксидаза D-аминокислот (DAAO, КФ 1.4.3.3) - фермент класса флавопротеинов, специфично окисляющий D-аминокислоты в соответствующие а-кетокислоты с образованием пероксида водорода и иона аммония. Впервые оксидаза D-аминокислот была обнаружена и первично охарактеризована Хансом Кребсом в 1935 г. в ходе экспериментов по изучению экстрактов из почек свиньи [1]. С тех пор DAAO стала важным модельным объектом для ферментов класса флавопротеинов и активно используется на практике. Данный фермент содержит флавина-дениндинуклеотид (FAD) в активном центре в качестве кофактора, а также имеет кислородный канал, по которому молекулы кислорода попадают в активный центр. Отличительной структурной особенностью этого фермента является наличие укладки по Россману в FAD-связывающем домене [2]. Ферменты класса флавопротеинов объединяют следующие свойства: они используют кислород в окислительно-восстановительной реакции и окисляют субстрат с помощью молекулы FAD или альтернативных кофакторов [3].
Гены, кодирующие оксидазы D-аминокислот, были обнаружены в геноме прокариот и эука-риот. Наиболее изучены DAAO из дрожжей, поскольку они обладают наилучшими каталитическими параметрами и находят непосредственное практическое применение. Активно изучается DAAO человека (hDAAO) [4], так как она играет важную роль в метаболизме нейромедиато-ра D-серина - коагониста Н-метил^-аспартат (NMDA) рецепторов [5]. Регуляция ее активности имеет медицинское значение, поэтому поиск соответствующих ингибиторов представляет собой важную задачу для фармацевтики. Было установлено, что пониженный уровень D-серина кор-релирует с развитием шизофрении [6, 7], а повышенный уровень D-серина наблюдается при боковом амиотрофическом склерозе (БАС) [8]. Схожую роль выполняют DAAO из почек свиньи (pkDAAO) [9]. Также были охарактеризованы оксидазы из гепатопанкреаса карпа (ChDAAO) [10], нематоды Caenorhabditis elegans (ceDAAO) [11].
Особое внимание стоит уделить оксидазам D-аминокислот из микроорганизмов. DAAO были найдены как в бактериях, так и в дрожжах. В геномах бактерий с помощью биоинформатического анализа было найдено более 200 генов, предположительно кодирующих оксидазы D-аминокислот, однако только 11 из них обладают значительной идентичностью аминокислотных последовательностей с дрожжевыми DAAO (в диапазоне от 25
до 31%) [12, 13]. DAAO имеют достаточно высокую гомологию с другим функционально схожим ферментом глициноксидазой (GOX). Вследствие этого большое число генов DAAO аннотированы в геномах как GOX и наоборот. В основном найденные гены находятся в грамположитель-ных актинобактериях, так как клеточная стенка бактерий содержит производные D-аланина и D-глутамата, которые DAAO способна окислять, разрушая тем самым клеточную стенку. Кроме того, пероксид водорода (один из продуктов реакции, катализируемой DAAO) является токсичным для бактерий из-за отсутствия у них пероксисом для безопасной утилизации высокоактивных форм кислорода (ROS). Поэтому в бактериях чаще всего встречается FAD-содержащая дегидрогеназа D-аминокислот, которая способна метаболизировать D-аминокислоты без участия кислорода. До 2022 г. были выделены и изучены всего три DAAO из бактерий Arthrobacter protophormiae (ApDAAO) [14], Rubrobacter xylanophilus (RxDAAO) [15] и Streptomyces coelicolor (ScDAAO) [16]. Нами с помощью разработанного в нашей лаборатории биоинформационно-структурного подхода в геномах экстре-мофильных бактерий были найдены еще 6 генов потенциальных DAAO, а также впервые в мире был найден ген DAAO в археях [17]. Были построены модельные структуры. Их сравнение со структурами известных DAAO, а также детальный анализ структуры активных центров показали, что все семь ферментов относят именно к DAAO, а не к близкородственным глициноксида-зам. Достоверность предсказания была подтверждена на примере DAAO из Natronosporangium hydrolyticum ACPA39 (NhDAAO). Ген этого фермента был клонирован и экспрессирован в клетках E. coli. Рекомбинантная NhDAAO была активна с рядом D-аминокислот и не активна с глицином [17].
В эукариотах DAAO встречается намного чаще. Гены, предположительно кодирующие оксидазы D-аминокислот, были найдены почти во всех сек-венированных геномах дрожжей. Ферментативная активность DAAO была обнаружена и описана в следующих видах дрожжей: Rhodotorula gracilis [18], Trigonopsis variabilis [19], Pichia pastoris [20], Fusarium solani [21], Candida boidinii [22], Fusarium oxysporum [23] и Rasamsonia.emersonii [24]. В нашей лаборатории были глонированы шесть генов (пять DAAO и одна DASPO) из дрожжей Ogataea parapolymoerha DL-1 (ранее известные как Hansenula polymorpha). В настоящее
время эти гены экспрессированы в клетках E. coli и начато изучение свойств рекомбинантных ферментов [25].
Обширное присутствие DAAO в дрожжах объясняется наличием у них особой органел-лы - пероксисомы, в которой могут происходить окислительные процессы с образованием высокоактивных форм кислорода без ущерба для микроорганизма. В структуре дрожжевых DAAO часто присутствует специальная сигнальная последовательность PTS1 (Ser-(Lys/His/ Arg)-Leu), которая связывается с рецепторами, отвечающими за доставку ферментов в пероксисомы. При экспрессии оксидазы D-аминокислот количество и размер пероксисом в дрожжах увеличивается. Это было показано на примере дрожжей Rhodotorula gracilis [20] и Candida boidinii [27]. Однако не все дрожжевые оксидазы D-аминокислот обладают пероксисомальной сигнальной последовательностью. Было показано (на примере дрожжей Candida boidinii и Hansenula polymorpha), что DAAO могут проявлять активность и в цитозоле [53]. Экспрессия DAAO индуцируется D-аминокислотами, причем для разных генов наилучшими являются разные индукторы. Например, для DAAO из дрожжей T. variabilis лучшие индукторы -D,L-Met; D,L-Ala; D,L-Leu и D,L-Val. Индукция может быть вызвана также синтетическими D-аминокислотами, которые не метаболизиру-ются [29].
Биологические роли оксидаз D-аминокислот очень разнообразны и различаются в разных организмах. Чем сложнее организм, тем более разнообразны роли DAAO. Считается, что в микроорганизмах DAAO участвует в метаболизме D-аминокислот, используя их в качестве источника азота и иногда углерода. У млекопитающих DAAO выполняет чаще регуляторную функцию, отвечая за метаболизм гормонов и нейромедиаторов, которые представляют собой D-аминокислоты.
Изменение уровня D-аминокислот имеет большое влияние на организм в целом. Например, было показано, что выключение гена daao и повышение концентрации D-аминокислот в тканях мозга мышей улучшают пространственное обучение. Был проведен эксперимент по сравнению скорости обучения мышей с нокаутом гена daao и обычных мышей в лабиринте Морриса, который является тестом на пространственное мышление и память у грызунов. Было обнаружено, что мыши с нокаутом гена daao имеют
преимущество в этом тесте по сравнению с обычными мышами, что свидетельствует о более высокой скорости пространственного обучения [30].
Наиболее активно изучаемой функцией ЭЛЛО у млекопитающих является регуляция уровня Э-серина. Эта Э-аминокислота является нейромедиатором, нейромодулятором рецепторов Н-метил-Э-аспартат (НМЭЛ) в мозгу. Окси-даза Э-аминокислот у человека имеет белок-активатор 072, который регулирует ее активность. Было показано, что мутации в гене этого белка и в гене ЭЛЛО коррелируют с развитием шизофрении. Повышение уровня экспрессии белка-активатора 072 приводит к повышению активности ЭЛЛО, что в свою очередь приводит к понижению уровня Э-серина и, соответственно, активности НМЭЛ-рецепторов, которые выполняют множественные функции в нейронах [31]. Помимо шизофрении нарушения активности ЭЛЛО связывают с болезнью Альцгеймера, так как повышенный уровень Э-Л1а в сером веществе и спинномозговой жидкости коррелирует с развитием этой болезни [7].
Важной физиологической функцией ЭЛЛО является регуляция секреции гормонов. Одним из важнейших регуляторов секреции гормонов у млекопитающих является Э-аспартат. Эта Э-аминокислота регулирует секрецию мелато-нина, пролактина, тестостерона, лютеинизиру-ющего гормона и гормона роста. Соответственно, нарушение его метаболизма может приводить к большому числу разнообразных заболеваний. Также было показано, что Э-аспартат накапливается с возрастом в хрящевой ткани, дентине и белом веществе, что может быть использовано в качестве возрастного маркёра [32-34].
Б-РИе является еще одной Э-аминокислотой, которая играет важную роль в поддержании го-меостаза. Возникновение и протекание многих заболеваний сопровождается изменением уровня Э-РИе. Эта Э-аминокислота была найдена в самых разных жидкостях человека - от плазмы и мочи до спинномозговой и амниотической жидкости [35]. В случае болезни Альцгеймера изменяется уровень не только Э-Л1а, но и Э-РИе [36]. Анализ образцов мочи беременных женщин с гестационным диабетом показал повышенный уровень этой Э-аминокислоты [37]. Э-РИе предлагается использовать в качестве компонента лекарственных средств, например, при снятии синдрома похмелья [38].
БААО способна метаболизировать неканоничные Б-аминокислоты в живых организмах. Одним из примеров служит нитроаргинин. Это соединение является ингибитором НО-синтетазы - регулятора артериальной гипертен-зии. Нитроаргинин существует в клетке в виде смеси Ь- и Б-изомеров: изначально синтезируется нитро-Б-аргинин, который затем превращается в биологически активный Ь-изомер. Этот процесс обеспечивается в том числе и с помощью оксидазы Б-аминокислот [39].
БААО, вероятно, является компонентом антибактериальной системы в нейтрофилах, метабо-лизирует экзогенные Б-аминокислоты в печени и участвует в синтезе пептидных гормонов. Предполагается, что БААО участвует в метаболизме Б-тиазолин-2-карбоксиловой кислоты в печени млекопитающих, которая является частью внутриклеточной сигнальной системы для различных гормонов [40].
В случае немлекопитающих одна из интересных функций БААО заключается в регуляции осмотического давления у ракообразных и двустворчатых моллюсков. Показано, что в условиях солевого стресса эти типы организмов накапливают в тканях Б-аланин [41].
В связи с вышесказанным совершенно очевидно, что селективная детекция Б-аминокислот в сложных биологических образцах является актуальной и важной научной задачей. В последние два десятилетия активно разрабатываются различные ферментные и неферментные методы анализа. Преимущество БААО заключается в ее практически абсолютной стереоспецифич-ности именно к Б-изомерам аминокислот. Это свойство очень важно, поскольку концентрация Ь-аминокислот в образцах намного выше. По этой причине БААО активно используется для детекции и определения концентрации Б-аминокислот в разных условиях. Можно выделить две основные сферы применения БААО для анализа: пищевая промышленность и медицина. В пищевой промышленности БААО используется для контроля процесса ферментации и детекции бактериального заражения. Так как клеточная стенка бактерий состоит из пептидогликанов, включающих в себя Б-аминокислоты, определение свободных Б-аминокислот, в первую очередь Б-аланина, может являться маркёром бактериального лизиса. Одним из примеров биосенсора на основе БААО, который применяют в пищевом производстве, является биосенсор, использующий двухферментную систему БААО пируватоксида-
за для специфичного определения Б-аланина при мониторинге процесса ферментации.
Определение концентрации Б-аланина осуществляется путем определения изменения концентрации кислорода в реакционной смеси с помощью кислородного электрода, так как и окси-даза Б-аминокислот и пируватоксидаза используют молекулярный кислород в качестве второго субстрата [42].
В медицине оксидаза Б-аминокислот в основном используется для двух целей: контроль энантиомерной чистоты стереоселективных лекарственных препаратов и определения уровня Б-аминокислот в физиологических жидкостях. Контроль за энантиомерной чистотой препаратов очень важен, так как часто только один из изомеров обладает терапевтическими свойствами, а второй стереоизомер (например, талидо-мид) может вызывать сильный отрицательный эффект. Одним из примеров применения оксида-зы Б-аминокислот в этой области является контроль за энантиомерной чистотой препарата для лечения нарушений функций щитовидной железы - Ь-Т4 ((+)-3,3',5,5'-тетрадиодо-Ь-тиронин). Этот препарат выполняет роль прогормона для Ь-Т3, в то время как его энантиомер Б-Т4, ко -торый является побочным продуктом реакции синтеза Ь-Т4, не проявляет никакой активности в щитовидной железе. Поэтому для контроля чистоты получаемого препарата используют биосенсоры на основе оксидазы Б-аминокислот
[43]. Биосенсоры на основе БААО используют также для детектирования Б-пипеколовой кислоты, которая является маркёром цирроза печени и хронической печеночной энцефалопатии
[44].
Любой метод анализа должен обеспечивать селективное определение целевого анали-та. В случае определения Б-аминокислот с помощью БААО эта проблема легко решается при определении Б-аспартата, поскольку во всех организмах имеется высокоспецифичная оксидаза Б-Asp. В этом случае БААО второго типа с широкой субстратной специфичностью не является идеальным ферментом. Например, Я^БААО имеет сравнимые каталитические параметры с Б-8ег и Б-А1а, в общем случае их селективная детекция при сравнимых значениях концентрации просто невозможна. Однако на основе этого фермента был предложен биосенсор для детекции Б-8ег в спинномозговой жидкости [45]. Это стало возможным потому, что в спинномозговой жидкости при норме уровень Б-8ег в 10 раз выше такового
П р и м е ч а н и е: с.д. - собственные данные.
Т а б л и ц а 2
Каталитические параметры оксидаз D-аминокислот с D-аланином
Т а б л и ц а 1
Каталитические параметры оксидаз D-аминокислот с D-серином
DAAO Условия измерения kcat., с-1 Km, мМ kcat. / Km, мМ-1с-1 Источник
OpaDAAOl рН 8,0; 30 °С 93,6 20,6 4,54 с.д.
CbDAAO рН 8,0; 30 °С 77,3 33,7 2,29 [22]
TvDAAO рН 8,0; 30 °С 20 37 0,54 [50]
pkDAAO рН 8,3; 25 °С 3,0 3,3 0,909 [52]
hDAAO рН 8,3; 25 °С 2,83 3,6 0,787 [53]
ceDAAO рН 8,3; 37 °С 1,51 20 0,075 [51]
hDAAO рН 8,3; 37 °С 1,23 6,42 0,191 [51]
DAAO Условия измерения k t, с 1 cat.' Km мМ kcat. / KM, мМ-1с-1 Источник
OpaDAAO1 рН 8,0; 30 °С 240 6,3 38,1 с.д.
ReDAAO рН 8,0; 55 °С 189 2,7 69,9 [19]
CboDAAO рН 8,0; 30 °С 117 4,28 27,4 [22]
TvDAAO рН 8,0; 30 °С 109 17 6,54 [50]
RgDAAO рН 8,5; 25 °С 83,3 0,8 102 [46]
RgDAAO рН 8,5; 25 °С 81,3 1 81,3 [53]
ceDAAO рН 8,3; 37 °С 14,9 6,89 2,17 [51]
pkDAAO рН 8,5; 25 °С 7,33 1,7 4,33 [53]
pkDAAO рН 8,3; 25 °С 6,5 0,77 8,44 [52]
hDAAO рН 8,3; 25 °С 5,5 0,9 6,11 [53]
hDAAO рН 8,3; 37 °С 3,66 1,08 3,39 [51]
П р и м е ч а н и е: с.д. - собственные данные.
для Э-Л1а. Проблема получения ЭЛЛО с необходимым спектром субстратной специфичности может быть решена с помощью методов белковой инженерии. Однако, несмотря на большие успехи современной науки в этой области, такой подход достаточно трудоемок и не всегда гарантирует успех. Например, эксперименты по получению мутантных Я^ЭЛЛО для селективного определения Б-8ег и Э-Л1а были начаты в 2002 г. [46] и завершились только в 2021 г. [47]. В нашей лаборатории в 2012 г. также были получены мутант-ные варианты ТуЭЛЛО, активные с Э-8ег и не активные с Э-Л1а и наоборот [48]. Однако такие
мутанты были получены нецеленаправленно, поскольку основной целью настоящей работы было улучшение каталитических параметров ТуЭЛЛО с цефалоспорином С.
Вторым более быстрым подходом является выбор на основании литературных данных фермента с каталитическими свойствами, наиболее подходящими для анализа. На практике такая процедура оказывается не очень простой задачей, поскольку определение параметров разными авторами проводилось в разных условиях. Кроме того, для разных субстратов данные приведены в разных статьях. В связи с этим мы про-
вели поиск по публикациям, в результате которого собрали и проанализировали каталитические параметры для наиболее изученных БААО. Данные представлены для Б-аминокислот, определение которых наиболее востребовано на практике. Это Б-серин, Б-аланин, Б-аспартат, Б-глутамат, Б-метионин, Б-пролин, Б-фенилаланин и Б-тирозин. Для удобстве также приведены данные по окислению цефаоспо-рина С с помощью как БААО дикого типа, так и ее мутантов. Максимальная скорость была преобразована в наблюдаемую каталитическую константу с использованием молекулярной массы 40 кДа как средней для большинства БААО. Если в анализируемой статье не были представлены значения каталитической эффективности, мы пересчитывали их из констант Михаэлиса и наблюдаемых каталитических констант. Кроме того, в дополнение к известным ферментам для каждой Б-аминокислоты приведены данные для новых ОраБААО и ОраБА8РО, которые были недавно получены в нашей лаборатории. Особо отметим, что для БААО из термофильных дрожжей Rasamsonia emersonii [24] и бактерий Rubrobacter xylanophilus [15] параметры были определены при повышенной температуре (55 и 60 оС соответственно). То же самое относиться и к БА8РО из Thermomyces dupontii (TdБASPO) [49]. В таблицах условия проведения эксперимента для этих ферментов выделены полужирным курсивом. Во всех таблицах данные отсортированы по уменьшению каталитической кон -станты. Наиболее высокие значения каталитической эффективности выделены полужирным шрифтом.
На основании представленных данных можно заключить, что дрожжевые оксидазы с большинством из изученных субстратов в среднем обладают большей каталитической эффективностью, чем БААО из млекопитающих, Исходя из спектров субстратной специфичности, БААО можно разделить на две группы - одни ферменты проявляют наилучшую активность с небольшими неполярными субстратами, такими как Б-серин и Б-аланин (табл. 1, 2), другие более активны с Б-аминокислотами с большими гидрофобными боковыми радикалами. К первой группе относятся СЬБААО и новая ОраБААО1, ко второй можно отнести ^БААО, Я^БААО и ЯеБААО. Отметим, что новая ОраБААО1 имеет самую высокую каталитическую константу с Б-А1а, однако лидером по каталитической эффективности с этим субстратом является RgБAAO.
Отдельно стоит выделить D-аспартатоксидазы, которые проявляют активность исключительно с D-аминокислотами с отрицательно заряженными боковыми радикалами - D-аспартатом и D-глутаматом. Наилучше каталитичекие характеристики с D-Asp показывает новая DASPO из дрожжей O. parapolymorpha DL-1 (OpaDASPO) (табл. 3). Однако высокие каталитические параметры и с D-Glu (табл. 4) не позволяют ее использовать в качестве универсального фермента для детекции D-Asp в присутствии сравнимых концентраций D-Glu. D-Met является «хорошим» субстратом для большинства DAAO (табл. 5), что, вероятно, служит причиной использования этой D-аминокислоты для определения активности. Однако при использовании этого субстрата наблюдается сильное различие между ферментами с высокими каталитическими константами и высокой каталитической эффективностью. Похожая ситуация наблюдается и в случае D-Pro (табл. 6).
Интересная ситуация с активностью наблюдается в случае DAAO с D-Phe и D-Tyr (табл. 7, 8). До недавнего времени фактически отсутствовали DAAO c D-Phe, обладающие хорошими характеристиками. Особенно это заметно по каталитической эффективности. Однако клонирование и экспрессия гена OpaDAAO3 в клетках E. coli позволили получить высокоэффективный катализатор с этим субстратом. Здесь следует отметить высокое значение каталитической эффективности, поскольку этот параметр играет важную роль при создании биосенсоров.
В случае с D-Tyr в дополнение к ферменту из C. boidinii высокие показатели демонстрирует DAAO из бактерий Rubrobacter xylanophilus [15] (табл. 8). RxDAAO имеет самую низкую константу Михаэлиса после OpaDAAO2, что и обеспечивает высокое значение каталитической эффективности.
Стоит также отметить, что многие оксидазы D-аминокислот проявляют активность и с неканоническими D-аминокислотами. Одним из самых известных неканонических субстратов DAAO является цефалоспорин С, из которого с помощью двустадийного биокаталитического процесса получают 7-аминоцефалоспорановую кислоту (7-АЦК), которая используется в качестве исходного синтона для производства полусинтетических цефалоспориновых антибиотиков разных поколений. В данном случае безусловным лидером является TvDAAO (табл. 9). В силу практической важности и востребованности
Т а б л и ц а 3
Каталитические параметры оксидаз D-аминокислот с D-аспартатом
DAAO Условия измерения k t, с 1 cat.' Km мм kcat. / KM м^с4 Источник
OpaDASPO pH 8,0; 30 °C 81,5 0,44 184 с.д.
hDASPO pH 8,3; 37 °C 70,6 2,14 33 [51]
TdDASPO pH 7,5; 60 °C 123 8,77 14 [49]
ceDASPO-1 pH 8,3; 37 °C 26,1 5,54 4,71 [51]
ceDASPO-2 pH 8,3; 37 °C 9,49 4,2 2,26 [51]
ceDASPO-3 pH 8,3; 37 °C 2,51 3,81 0,658 [51]
RgDAAO pH 8,5; 25 °С 0,48 18 0,0267 [46]
П р и м е ч а н и е: с.д. - собственные данные.
Т а б л и ц а 4
Каталитические параметры оксидаз D-аминокислот с D-глутаматом
DAAO Условия измерения k t, с-1 cat.' Кш мм kcat. / KM, мМ-1с-1 Источник
OpaDASPO pH 8,0; 30 °C 47,8 0,61 78,4 с.д.
TdDASPO pH 7,5; 60 °C 217 2,16 100 [49]
ceDASPO-1 pH 8,3; 37 °C 35,4 1,06 33,4 [51]
ReDAAO pH 8,0; 55 °C 90,7 12,1 7,49 [19]
hDASPO pH 8,3; 37 °C 5,54 40 0,139 [51]
ceDASPO-2 pH 8,3; 37 °C 3,01 0,8 3,76 [51]
RgDAAO pH 8,5; 25 °С 1,0 77,3 0,0133 [46]
ceDASPO-3 pH 8,3; 37 °C 0,76 0,68 1,12 [51]
П р и м е ч а н и е: с.д. - собственные данные.
Т а б л и ц а 5
Каталитические параметры оксидаз D-аминокислот с D-метионином
DAAO Условия измерения k t, с-1 cat.' Km мМ kcat. / KM, мМ-1с-1 Источник
OpaDAAO3 pH 8,0; 30 °C 141 1,98 71,2 с.д.
CbDAAO pH 8,0; 30 °C 127 27,4 4,65 [22]
ReDAAO pH 8,0; 55 °C 120 0,213 562 [19]
TvDAAO pH 8,0; 30 °C 81,0 0,46 176 [50]
RgDAAO pH 8,5; 25 °С 76,7 0,20 425 [46]
pkDAAO pH 8,3; 25 °C 6,83 0,65 10,5 [52]
П р и м е ч а н и е: с.д. - собственные данные.
Т а б л и ц а 6
Каталитические параметры оксидаз Б-аминокислот с Б-пролином
DAAO Условия измерения *cat> С-1 Km, мМ kcat. / Km, мМ-V Источник
RgDAAO рН 8,5; 25 °С 77,3 21,5 3,6 [46]
hDAAO рН 8,3; 25 °С 15 1,7 8,82 [53]
pkDAAO рН 8,3; 25 °С 10,3 0,56 18,5 [52]
OpaDAAO3 рН 8,0; 30 °С 14 46,9 0,3 с.д.
П р и м е ч а н и е: с. д. - собственные данные.
Т а б л и ц а 7
Каталитические параметры оксидаз Б-аминокислот с Б-фенилаланином
DAAO Условия измерения ^ с-1 Km, мМ kcat. / Km, мМ-V Источник
OpaDAAO3 рН 8,0; 30 °С 104 0,249 417,7 с.д.
TvDAAO рН 8,0; 30 °С 27 0,37 73 [50]
ceDAAO рН 8,3; 37 °С 25,1 2,72 9,21 [51]
pkDAAO рН 8,3; 25 °С 16,7 1,4 11,9 [52]
hDAAO рН 8,3; 37 °С 9,89 2,59 3,82 [51]
П р и м е ч а н и е: с. д. - собственные данные.
Т а б л и ц а 8
Каталитические параметры оксидаз Б-аминокислот с Б-тирозином
DAAO Условия измерения k t, с 1 cat.' Km мМ kcat. / ^ м^с4 Источник
CbDAAO рН 8,0; 30 °С 77,3 33,7 2,29 [22]
OpaDAAO2 рН 8,0; 30 °С 12,4 0,08 155 с.д.
RxDAAO рН 8,0; 60 °С 53 0,197 269 [15]
ceDAAO рН 8,3; 37 °С 1,51 20 0,075 [51]
hDAAO рН 8,3; 25 °С 2,83 3,6 0,787 [53]
hDAAO рН 8,3; 37 °С 1,23 6,42 0,191 [51]
pkDAAO рН 8,3; 25 °С 3 3,3 0,909 [52]
TvDAAO рН 8,0; 30 °С 20 37 0,54 [50]
П р и м е ч а н и е: с. д. - собственные данные.
этого фермента для получения 7-АЦК разными исследователями были выполнены эксперименты по белковой инженерии для увеличения температурной и химической стабильности и каталитической активности. В настоящее время самыми высокими показателями обладает мутантная ТуБЛЛО с шестью аминокислотными заменами [50].
При подведении итогов анализа каталитических свойств БЛЛО и БЛ8РО из разных источников следует отметить три важных момента.
1. Поиск генов новых оксидаз в геномах является высокоэффективным и продуктивным подходом для получения ферментов с нужными свойствами. Наглядным примером является клонирование в нашей лаборатории генов пяти БЛЛО
Т а б л и ц а 9
Каталитические параметры оксидаз D-аминокислот с цефалоспорином С
Фермент Условия измерения kcat., с-1 Km, мМ kcat. / Km, мМ-1с-1 Источник
CbDAAO рН 8,0; 30 °с n.a. n.a. n.a. [53]
pkDAAO рН 8,5; 25 °С 0,65 2,3 0,283 [53]
TvDAAO рН 8,5; 25 °С 71,7 2,4 29,8 [53]
RgDAAO рН 8,5; 25 °С 73,3 4 18,3 [53]
TvDAAO рН 8,0; 30 °с 36 1,4 18 [50]
TvDAAO E32R/F33D/C108F рН 8,0; 30 °с 1,15 25,5 22 [50]
TvDAAO E32R/F33D/F54S/C108F рН 8,0; 30 °с 1,9 88 45 [50]
TvDAAO F54S/C108F/M156L рН 8,0; 30 °с 1,9 119 60 [50]
TvDAAO E32R/F33D/F54S/C108F/ M156L рН 8,0; 30 °с 1,6 106 66 [50]
TvDAAO E32R/F33D/F54S/C108F/ M156L/C298G рН 8,0; 30 °с 0,8 65 79 [50]
TvDAAO E32R/F33D/F54S/C108F/ M156L/C298N рН 8,0; 30 °с 2,9 121 42 [50]
TvDAAO E32R/F33D/F54S/C108F/ M156L/C298Q рН 8,0; 30 °с 1,4 68 50 [50]
TvDAAO рН 8,0; 30 °с 19 2,6 7,2 [54]
TvDAAO C108F рН 8,0; 30 °с 21 0,99 21,3 [54]
TvDAAO C108A рН 8,0; 30 °с 23 0,71 31,8 [54]
TvDAAO C108S рН 8,0; 30 °с 10,8 5,6 1,9 [54]
П р и м е ч а н и е: п.а. - активность отсутствует.
и одной БЛ8РО из дрожжей O. parapolymorpha ЭЬ-1. Предложенный нами биоинформационно-структурный подход отбора подходящих генов [17] позволяет повысить эффективность выбора, снизить число скринируемых генов для получения нужного результата, снижая таким образом трудоемкость и сокращая время поиска новых ферментов.
2. В литературе почти не обсуждается проблема того, что у большинства эукариотических оксидаз Э-аминокислот максимум активности наблюдается при рН 8,0 и выше, в то время как оптимум стабильности находится при значении рН, равном приблизительно 7. Поэтому при поиске новых оксидаз следует уделять особое внимание получению ферментов с одинаковыми рН-
профилями стабильности и активности. В этом случае возможно длительное непрерывное измерение концентрации целевой D-аминокислоты с помощью биосенсора. Результаты предварительных экспериментов показали, что некоторые новые OpaDAAO имеют одинаковые рН-оптимумы активности и стабильности.
3. В настоящее время становится популярным поиск генов новых DAAO и DASPO в тер-
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Krebs H.A. // Biochem. J. 1935. Vol. 29. N 7. P. 1620-44.
2. Tishkov V.I., Khoronenkova S.V. // Biochemistry (Moscow). 2005. Vol. 70. N 1. P. 40-54 (DOI: 10.1007/ s10541-005-0050-2).
3. Massey V., Hemmerich P. // Biochem. Soc. Trans. 1980. Vol. 8. N 3. P. 246-57.
4. Fukui K., Miyake Y. // J. Biol. Chem. 1992. Vol. 267. P. 18631-18638 (DOI: S0021-9258(19)37007-3).
5. Pollegioni L., Molla G. // Trends Biotechnol. 2011. Vol. 29. P. 276-283 (DOI: 10.1016/j.tibtech.2011.01.010).
6. Chumakov I., Blumenfeld M., Guerassimenko O., Ca-varec L., Palicio M., Abderrahim H., Bougueleret L., Barry C., Tanaka H., La R.P., et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2002. Vol. 99. P. 13675-13680 (DOI: 10.1073/pnas.182412499).
7. Cheng Y.J., Lin C.H., Lane H.Y. // Int. J. Mol. Sci. 2021. Vol. 22. N 20. P. 10917 (DOI: 10.3390/ ijms222010917).
8. Sacchi S., Cappelletti P., Murtas G. // Front Mol Bios-ci. 2018. Vol. 5. P. 55.
9. Fukui K., Watanabe F., Shibata T., & Miyake Y. // Biochemistry. 1987. Vol. 26. P. 3612-3618 (DOI: 10.1021/ bi00386a054).
10. Sarower M.G., Okada S., Abe H. // Arch. Biochem. Biophys.. 2003. Vol. 420. N 1. P. 121-129.
11. Katane M., Seida Y., Sekine M., Furuchi T., Hom-ma H. // FEBS J. 2007. Vol. 274. P. 137-149 (DOI: 10.1111/j.1742-4658.2006.05571.x).
12. Pollegioni L., Molla G., Sacchi S., Rosini E., Verga R., Pilone M.S. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2008. Vol. 78. P. 1-16 (DOI: 10.1007/s00253-007-1282-4).
13. Takahashi S., Abe K., Kera Y. // Bioengineered. 2015. Vol. 6. P. 237-241 (DOI:10.1080/21655979.2015.105 2917).
14. Geueke B., Weckbecker A., Hummel W. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2007. Vol. 74. P. 1240-1247 (DOI: 10.1007/s00253-006-0776-9).
15. Takahashi S., Furukawara M., Omae K., Tado-koro N., Saito Y., Abe K., Kera Y. // Appl. Environ. Microbiol. 2014. Vol. 80. P. 7219-7229 (DOI: 10.1128/ AEM.02193-14).
16. Saito Y., Takahashi S., Kobayashi M., Abe K., Kera Y. // Ann. Microbiol. 2014. Vol. 64. P. 1167-1177 (DOI. org/10.1007/s13213-013-0756-0).
мофильных микроорганизмах. Однако ферменты термофилов в обычных условиях (25-30 оС), как правило, уступают по активности ферментам из мезофилов. В то же время ферменты из мезофилов часто имеют достаточно высокую термостабильность. Например, новая БА8РО из дрожжей O. parapolymorpha БЬ-1 по своей термостабильности превосходит все известные БА8РО.
17. Атрошенко Д.Л., Головина Д.И., Сергеев Е.П., Шеломов М.Д., Ельченинов А.Г., Кубланов И.В., Чубарь Т.А., Пометун А.А., Савин С.С., Тишков В.И. // Acta Naturae. 2022. Vol. 14. № 4. С. 55.
18. Pollegioni L., Molla G., Campaner S., Martegani E., Pilone M.S. // J. Biotechnol. 1997. Vol. 58. P. 115-123 (DOI: 10.1016/s0168-1656(97)00142-9).
19. Gonzalez F.J., Montes J., Martin F., Lopez M.C., Ferminan E., Catalan J., Galan M.A., Dominguez A. // Yeast. 1997. Vol. 13. P. 1399-1408 (DOI: 10.1002/ (SICI)1097-0061(199712)13:15<1399).
20. Klompmaker S.H., Kilic A., Baerends R.J., Veenhuis M., van der Klei I.J. //FEMS Yeast Res. 2010. Vol. 10. P. 708-716 (DOI: 10.1111/j.1567-1364.2010.00647.x).
21. Isogai T., Ono H., Ishitani Y., Kojo H., Ueda Y., Koh-saka M. // J. Biochem. 1990. Vol. 108. P. 1063-1069 (DOI: 10.1093/oxfordjournals.jbchem.a123306).
22. Yurimoto H., Hasegawa T., Sakai Y., Kato N. // Bios-ci. Biotechnol. Biochem. 2001. Vol. 65. P. 627-633 (DOI: 10.1271/bbb.65.627).
23. Gabler M. Fischer L. // Appl. Environ. Microbiol. 1999. Vol. 65. P. 3750-3753 (DOI: 10.1128/ AEM.65.8.3750-3753.1999).
24. Shimekake Y., Furuichi T., Abe K., Kera Y., Takahashi S. // Sci. Rep. 2019. Vol. 9. P. 11948 (DOI: 10.1038/s41598-019-48480-y).
25. Atroshenko D., Shelomov M., Zhgun A., Avdanina D., Eldarov M.. Pometun A., ChubarT., Savin S., Tishkov V. // FEBS Open Bio. 2018. Vol. 8(S1). P. 190 (DOI: 10.1002/2211-5463.12453).
26. Perotti M.E., Pollegioni L., Pilone M.S. // Eur. J. Cell Biol. 1991. Vol. 55. P. 104-113.
27. Sulter G.J., Waterham H.R., Goodman J.M., Veenhuis M. // Arch. Microbiol. 1990. Vol. 153, 485-489 (DOI: 10.1007/BF00248431).
28. Yurimoto H., Hasegawa T., Sakai Y., Kato N. // Yeast. 2000. Vol. 16. P. 1217-1227 (DOI: 10.1002/1097-0061(20000930)16:13<1217).
29. Horner, R., Wagner, F., Fischer, L. // Appl. Environ. Microbiol. 1996. Vol. 62. P. 2106-2110 (DOI: 10.1128/ aem.62.6.2106-2110.1996).
30. Maekawa M., Watanabe M., Yamaguchi S., Konno R., Hori Y. // Neurosc. Res. 2005. Vol. 53. N 1. P. 34-38.
31. Korostishevsky M., Kaganovich M., Cholostoy A.,
Ashkenazi M., Ratner Y., Dahary D., Bernstein J., Be-ning-Abu-Shach U., Ben-Asher E., Lancet D. // Biol. Psych. 2004. Vol. 56. N 3. P. 169-176.
32. Man E.H., Sandhouse M.E., Burg J., Fisher G.H. // Science. 1983. Vol. 220. N 4604. P. 1407-1408.
33. Ohtani S., Matsushima Y., Ohhira H., Watanabe A. // Growth Dev. Aging. 1995. Vol. 59. N 1-2. P. 55-61.
34. Helfman P.M., Bada J.L. // Proc. Nat. Acad. Sci. 1975. T. 72. N 8. C. 2891-2894.
35. Armstrong D.W., Gasper M., Lee S.H., Zukowski J., Ercal N. // Chirality. 1993. Vol. 5. P. 375-378 (DOI: 10.1002/chir.530050519).
36. Xing Y., Li X., Guo X., Cui Y., // Anal. Bioanal. Chem. 2016. Vol. 408. P 141-150 (DOI: 10.1007/ s00216-015-9086-3).
37. Lorenzo M.P., Dudzik D., Varas E., Gibellini M., Skotnicki M., Zorawski M., Zarzycki W., Pellati F., Garcia A. // J. Pharm. Biomed. Anal. 2015. Vol. 107. P. 480-487 (DOI: 10.1016/j.jpba.2015.01.015).
38. Jukic T., Rojc B., Boben-Bardutzky D., Hafner M., Ihan A., // Coll. Antropol. 2011. Vol. 35. P. 1225-1230.
39. Poinar H.N., Hoss M., Bada J.L., Paabo S. // Science. 1996. Vol. 272. P. 864-866 (DOI: 10.1126/sci-ence.272.5263.864).
40. Fitzpatrick P. F., Massey V. // J. Biol. Chem. 1982. Vol. 257. N 3. P. 1166-1171.
41. Abe H., Yoshikawa N., Sarower M.G., Okada S. // Biol. Pharm. Bull. 2005. Vol. 28. N 9. P. 1571-1577.
42. Inaba Y., Mizukami K., Hamada-Sato N., Kobayas-hi T., Imada C., Watanabe E. // Biosens. Bioelectron. 2003. Vol. 19. P. 423-431 (DOI: 10.1016/s0956-5663(03)00200-8).
43. Stefan R.I., Bokretsion R.G., van Staden J.F., Aboul-En-ein H.Y. // Biosens. Bioelectron. 2003. Vol. 19. P. 261-267 (DOI: 10.1016/s0956-5663(03)00210-0).
44. Stefan R.-I., van Staden J.F., Aboul-Enein H.Y. // Sens.
Actuat. B: Chemical. 2003. Vol. 94. N 3. P. 271-275.
45. Pernot P., Mothet J.P., Schuvailo O., Soldatkin A., Pollegioni L., Pilone M., Adeline M.T., Cespuglio R., Marinesco S. // Anal. Chem. 2008. Vol. 80. P. 15891597 (DOI:10.1021/ac702230w).
46. Sacchi S., Lorenzi S., Molla G., Pilone M.S., Ros-setti C., Pollegioni L. // J. Biol. Chem. 2002. Vol. 277. P. 27510-27516 (DOI: 10.1074/jbc.M203946200).
47. Moussa S., Murtas G., Pollegioni L., Mauzeroll J. // ACS Appl. Bio Mater. 2021. Vol. 4. P. 5598-5604 (DOI: 10.1021/acsabm.1c00409).
48. Komarova N.V., Golubev I.V., Khoronenko-va S.V., Chubar' T.A., Tishkov V.I. // Biochemistry (Mosc.). 2012. Vol. 77. P. 1181-1189 (DOI: 10.1134/ S0006297912100100).
49. Takahashi S., Osugi K., Shimekake Y., Shinbo A., Abe K., Kera Y. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2019. Vol. 103. P. 4053-4064 (DOI: 10.1007/s00253-019-09787-y [pii];10.1007/s00253-019-09787-y).
50. Atroshenko D.L., Shelomov M.D., Zarubina S.A., Negru N.Y., Golubev I.V., Savin S.S., Tishkov V.I. // Int. J. Mol. Sci. 2019. Vol. 20. P. 4412 (DOI: 10.3390/ ijms20184412).
51. Katane M., Saitoh, Y., Seida Y., Sekine M., Furu-chi, T., Homma H. // Chem. Biodivers. 2010. Vol. 7. P. 1424-1434 (DOI: 10.1002/cbdv.200900294).
52. Setoyama C., Nishina Y., Mizutani H., Miyahara I., Hirotsu K., Kamiya N., Shiga K., Miura R. // J. Bio-chem. 2006. Vol. 139. P. 873-879 (DOI: 139/5/873 [pii];10.1093/jb/mvj094).
53. Pollegioni L., Caldinelli L., Molla G., Sacchi S., Pilone M.S. // Biotechnol. Prog. 2004. Vol. 20. P. 467-473 (DOI: 10.1021/bp034206q).
54. Хороненкова С.В. Рекомбинантная оксидаза D-аминокислот: получение и структрурно-функ-циональные исследования // Дис. ... канд. хим. наук. М., 2008. 162 c.
Информация об авторах
Тишков Владимир Иванович - профессор химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова; зав. лабораторией молекулярной инженерии Института биохимии им. А.Н. Баха, Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» Российской академии наук; докт. хим. наук, профессор, (vitishkov@gmail.com);
Шеломов Михаил Дмитриевич - аспирант химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова, scarshell@gmail.com;
Пометун Анастасия Александровна - ст. науч. сотр. лаборатории молекулярной инженерии Института биохимии им. А.Н. Баха, Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» Российской академии наук, ст. науч. сотр. кафедры химической энзимологии химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова, докт. хим. наук (aapometun@gmail.com);
Савин Святослав Сергеевич - ст. науч. сотр. кафедры химической энзимоло-гии химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова, канд. биол. наук (savinslava@gmail.com)
Атрошенко Денис Леонидович - мл. науч. сотр. лаборатории молекулярной инженерии Института биохимии им. А. Н. Баха, Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» Российской академии наук, науч. сотр. кафедры химической энзимологии химического факультета МГУ имени М .В. Ломоносова, канд. хим. наук (atrdenis@gmail.com).
Вклад авторов
Все авторы сделали эквивалентный вклад в подготовку публикации. Конфликт интересов
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Статья поступила в редакцию 25.11.2022; одобрена после рецензирования 29.11.2022; принята к публикации 14.12.2022.
