CC BY
8
НАУЧНАЯ СТАТЬЯ УДК 577.15.01
КИНЕТИКА ТЕРМОИНАКТИВАЦИИ ОКСИДАЗЫ D-АМИНОКИСЛОТ OPADAAO1 ИЗ ДРОЖЖЕЙ OGATAEA PARAPOL YMORPHA DL-1
Мария Константиновна Кошкина1, Егор Павлович Сергеев2, Тимофей Алексеевич Федоров3, Михаил Дмитриевич Шеломов4, Анастасия Александровна Пометун5, Святослав Сергеевич Савин6, Владимир Иванович
7 8
Тишков , Денис Леонидович Атрошенко
Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, химический факультет, Москва, Россия
5 7 8
' ' Институт биохимии им. А.Н. Баха, Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» Российской академии наук, Москва, Россия
Авторы, ответственные за переписку: Денис Леонидович Атрошенко, [email protected]; Владимир Иванович Тишков, [email protected]
Аннотация. Проведенная нами ранее аннотация генома дрожжей Ogataea parapolymorpha DL-1 позволила идентифицировать в нем пять генов потенциальных оксидаз D-аминокислот. Все гены opadaaol - opadaao5 были клонированы и экспрессированы в E. coli. Четыре фермента OpaDAAOl - OpaDAAO4 получены в высокоочищенном виде, изучены их каталитические свойства. Установлено, что среди всех описанных в литературе на данный момент DAAO фермент OpaDAAOl с D-Ala имеет наибольшую каталитическую константу £ что делает его перспективным для практического применения. Однако для эффективного применения фермента на практике кроме хороших каталитических параметров требуется высокая стабильность и знание механизма инактивации, в том числе и при повышенной температуре. В настоящей работе изучено влияние повышенной температуры на стабильность OpaDAAOl. Показано, что фермент имеет высокую для оксидаз D-аминокислот термостабильность. Изучена кинетика инактивации OpaDAAOl при разных значениях температуры, начальной концентрации фермента, и при добавлении экзогенного FAD. На основании полученных данных предложена возможная кинетическая схема инактивации.
Ключевые слова: температурная стабильность, кинетика термоинактивации, ок-сидаза D-аминокислот, Ogataea parapolymorpha DL-1
DOI: 10.55959/MSU0579-9384-2-2023-64-2-152-162
Список сокращений: DAAO - оксидаза D-аминокислот, OpaDAAO1 - оксидаза D-аминокислот из дрожжей Ogataea parapolymorpha DL-1, FAD - флавинаденин-динуклеотид.
Финансирование. Эсперименты по термоинакттивации выполнены при поддержке Гранта Президента Российской Федерации для государственной поддержки молодых российских ученых - кандидатов наук и докторов наук (МК-6239.2021.1.4). Вывод уравнения и анализ констант выполнены в рамках государственного задания.
© Кошкина М.А., Сергеев Е.П., Федоров Т.А., Шеломов М. Д., Пометун А.А., Савин С.С., Тишков В.И., Атрошенко Д.Л. Кинетика термоинактивации оксидазы Б-аминокислот ОраБААО1 из дрожжей Ogataea рагаро1ушогрка БЬ-1, 2023.
Для цитирования: Кошкина М.А., Сергеев Е.П., Федоров Т.А., Шеломов М.Д., По-метун А.А., Савин С.С., Тишков В.И., Атрошенко Д.Л. Кинетика термоинактивации ок-сидазы D-аминокислот OpaDAAOl из дрожжей Ogataea parapolymorpha DL-1 // Вестн. Моск. ун-та. Сер. 2. Химия. Т. 64. № 2. С. 152-162.
ORIGINAL ARTICLE
KINETICS OF THERMOINACTIVATION OF D-AMINO ACID OXIDASE OPADAAO1 FROM THE OGATAEA PARAPOLYMORPHA DL-1 YEAST
12 3
Maria K. Koshkina , Egor P. Sergeyev , Timofey A. Fedorov , Михаил D. Shelomov4, Anastasia A. Pometun5, Svyatoslav S. Savin6, Vladimir I. Tishkov7, Denis L. Atroshenko
1—8
Department of Chemistry, Lomonosov Moscow State University, Moscow, Russian Federation
5' 7' 8 Bach Institute of Biochemistry, Federal Research Centre "Fundamentals of Biotechnology" of the Russian Academy of Sciences, Moscow, Russian Federation
Authors for correspondence: Denis Leonidovich Atroshenko, [email protected]; Vladimir I. Tishkov, [email protected]
Abstract. Our earlier annotation of genome of the yeast Ogataea parapolymorpha DL-1 made it possible to identify five genes of potential D-amino acids oxidases. All opadaaol - opadaao5 genes were cloned and expressed in E. coli. Four OpaDAAO1-OpaDAAO4 enzymes were obtained in highly purified form and their catalytic properties were studied. It was found that among all DAAOs described in the literature so far, the enzyme OpaDAAO1 has the highest catalytic constant kcat with D-Ala, which makes it promising for practical applications. However, in addition to good catalytic parameters, effective application of the enzyme in practice requires high stability and knowledge of the inactivation mechanism, including at elevated temperatures. In this work we studied the effect of elevated temperatures on the stability of OpaDAAO1. The enzyme was shown to have high thermal stability in comparison with majority of other D-amino acid oxidases. The kinetics of OpaDAAO1 inactivation at different temperatures, initial concentrations of the enzyme, and in the presence of exogenous FAD were studied. A possible kinetic scheme of inactivation was proposed based on the data obtained.
Keywords: temperature stability, thermal inactivation kinetics, D-amino acid oxidase, Ogataea parapolymorpha DL-1
List of abbreviations: DAAO — D-amino acid oxidase, OpaDAAO1 — amino acid oxidase D from yeast Ogataea parapolymorpha DL-1, FAD — flavinadenindinucleotide
Financial support. Thermal inactivation experiments were carried out with financial support within Grant of the President of Russian Federation for state support of young Russian scientists — candidates and doctor fo sciences. Solution of equiation for inactivation scheme and constants analysis were done within state research programme.
For citation: Koshkina M.K., Sergeyev E.P., Fedorov T.A., Shelomov M.D, Pome-tun A.A., Savin S.S., Tishkov V.I., Atroshenko D.L. Kinetics of Thermoinactivation of D-Amino Acid Oxidase OpaDAAO1 from the Ogataea parapolymorpha DL-1 Yeast // Vestn. Mosk. un-ta. Ser. 2. Chemistry. T. 64. № 2. P. 152—162.
С каждым годом ферменты находят все более широкое применение в разных областях биотехнологии [1]. Стабильность ферментов является критическим фактором, определяющим возможность его практического применения. Проведено много исследований, нацеленных на получение
ферментов, обладающих высокой стабильностью, особенно к воздействию высоких температур. Получение термостабильных ферментов позволяет проводить каталитические реакции при высоких значениях температуры, что повышает активность фермента, снижает риск микробного
заражения, снижает вязкость и повышает растворимость субстратов. Кроме того, использование термо стабильных ферментов значительно упрощает процесс их очистки.
Оксидаза D-аминокислот (DAAO, КФ 1.4.3.3) - фермент, который катализирует селективное окисление D-аминокислот в соответствующие а-кетокислоты с образованием пероксида водорода и иона аммония [2-4]. Наиболее подробно термоинактивация DAAO была изучена на примере фермента из почек свиньи (pkDAAO), а также из дрожжей Trigonopsis variabilis (TvDAAO) и Rhodotorula gracilis (RgDAAO). Поскольку pkDAAO является мономером, скорость ее термоинактивации не зависит от концентрации фермента [5]. Олигомерное состояние RgDAAO и TvDAAO в большинстве случаев описывают как димерное [6-8]. Для RgDAAO увеличение концентрации с 0,1 до
3.5 мг/мл приводит к увеличению температуры Tm (температуры, при которой фермент теряет половину активности после 30 мин инкубации) с 48 до 57 °С [9]. В работе [10] было показано, что уменьшение концентрации RgDAAO в три раза (с 0,15 до 0,05 мг/мл) приводит к дестабилизации -при 48 °С период полуинактивации снижается с 8 ч до 45 мин. Наличие в растворе экзогенного FAD в концентрации 10 мкМ стабилизирует RgDAAO, в то время как на TvDAAO он не оказывает существенного влияния [8]. В работе [11] было показано, что наличие экзогенного FAD в концентрации 0,1 и 1,0 мМ при концентрации TvDAAO, равной 10 мкМ, приводит к увеличению времени полуинактивации при 50 °С примерно в
1.6 раз в обоих случаях. В отсутствие экзогенного FAD понижение концентрации TvDAAO вызывает снижение температурной стабильности, но добавление 100-кратного избытка FAD приводит к тому, что скорость инактивации перестает зависеть от концентрации фермента. Ранее в нашей лаборатории был подробно изучен процесс инактивации рекомбинантной TvDAAO дикого типа и ее различных мутантных форм при повышенных значениях температуры [12-14]. Установлено, что в диапазоне температур от 50 до 60 °C процесс термоинактивации протекает в две стадии в соответствии с диссоциативным механизмом. Этот механизм включает в себя стадию обратимой диссоциации фермента на субъединицы, которые затем необратимо инактивируются. В работах [15-17] подробно описан механизм диссоциативной термоинактивации олигомер-ных ферментов.
Ранее нами были клонированы гены, получены и охарактеризованы пять новых DAAO из дрожжей Ogataea parapolymorpha DL-1 (будет опубликовано). Оказалось, что среди всех описанных DAAO один из ферментов (OpaDAAO1) с D-Ala и D-Ser обладает наибольшими значениями kcat. Это свойство делает OpaDAAO1 интересным для биотехнологии, в том числе для детекции небольших D-аминокислот и для биокаталитических процессов тонкого органического синтеза. Однако для повышения эффективности практического применения необходимо повысить его температурную стабильность. Для понимания потенциальных путей стабилизации OpaDAAO1 необходимо знать, каким образом происходит его инактивация. Для этого нами было определено олигомерное состояние фермента, а также изучена кинетика инактивации при разных значениях температуры, концентрации фермента и концентрации экзогенного FAD.
Экспериментальная часть
Получение высокоочищенных препаратов OpaDAAOl
Ген opadaao1 был экспрессирован в клетках E. coli BL21(DE3), трансформированных плазмидой pOpaDAAO1. Плазмида была получена клонированием гена opadaao1 в плаз-миду pET24a(+) по сайтам рестрикции NdeI и XhoI. Условия культивирования и очистки были идентичны описанным для TvDAAO [13, 14]. Согласно данным аналитического электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсудьфата натрия, чистота полученных препаратов составляла не менее 98%.
Определение олигомерного состояния OpaDAAOl с помощью гель-фильтрации
Гель-фильтрацию проводили на колонке «TSK-G 2000 SW» 7,5x600 мм с использованием хроматографической системы фирмы «Knauer» (Германия). Хроматографию проводили в Na-фосфатном буфере (pH 8,0) при трех разных значениях концентрации NaCl: 0,1; 0,3 и 0,5 М. Объем наносимого на колонку образца составлял 0,1 мл. Детекцию проводили на длине волны 280 нм. В качестве стандартов молекулярной массы использовали ДНКазу-I (31 кДа), овальбумин (44 кДа), бычий сывороточный альбумин (66 кДа), овальбумин (75 кДа), аль-долазу (158 кДа) и ферретин (440 кДа).
Определение активности оксидазы D-аминокислот
Активность OpaDAAOl определяли c D-Ala спектрофотометрически на приборе «Shimadzu 1800» с термостатируемым отделением на элементах Пельтье по образованию пероксида водорода c помощью пероксидазы из корней хрена и ее субстрата о-фенилендиамина (OPD). В кювету спектрофотометра (рабочий объем 1 мл, оптический путь 1 см) добавляли 870 мкл 20 мМ раствора трис-хлоридного буфера (TrisHCl) (рН 8,0), 100 мкл 500 мМ раствора D-Ala в 20 мМ TrisHCl, 10 мкл раствора OPD (10 мг/мл) в воде и 10 мкл раствора пероксидазы из корней хрена (5 мг/мл) в 50 мМ натрий-фосфатном буфере (pH 6,5). Перед анализом кювету термостатировали не менее 10 мин при 30 °С. Затем в нее добавляли 30 мкл раствора фермента и измеряли изменение поглощения при 460 нм. Активность OpaDAAO1 рассчитывали, исходя из коэффициента экстинкции продукта окисления OPD 11600 М-1. см1.
Исследование термостабильности OpaDAAOl
Температурную стабильность OpaDAAO1 изучали в 20 мМ Na-фосфатный буфере (pH 6,5) с добавлением глицерина 10% (v/v), в температурном диапазоне 44-52 °С с шагом в два градуса. Концентрационную зависимость стабильности изучали при разных значениях начальной концентрации фермента и фиксированной температуре 48 °С. Для проведения экспериментов готовили серию из пластиковых пробирок объемом 500 мкл, содержащих по 50 мкл раствора фермента заданной концентрации. Пробирки помещали в предварительно нагретый до необходимой температуры водный термостат (точность термостатирования ±0,1 °С). Через определенные промежутки времени отбирали по одной пробирке. Каждую пробирку помещали в лед на 1-2 мин. Интервал между отбором проб выбирали таким образом, чтобы за время эксперимента активность фермента в образцах уменьшилась до 10-25% от исходной. Остаточную активность измеряли, как описано выше.
В экспериментах по реактивации измерения проводили схожим образом, с той лишь разницей, что пробирки инкубировали заданное время при температуре инактивации, а затем помещали в лед для реактивации, проводя измерения остаточной активности через заданные промежутки времени.
Математическая обработка результатов экспериментов
Для определения кинетических параметров процесса инактивации 0раЭАА01 строили зависимости остаточной активности от времени и проводили их анализ с помощью программы 0riginPro 2021Ь («0riginLab Согорогайоп», США).
Результаты и их обсуждение
Определение олигомерного состояния 0раБАА01
Для корректного установления механизма термоинактивации фермента необходимо знать его олигомерный состав. Для определения олигомерной формы 0раЭАА01 использовали гель-фильтрационную хроматографию на носителе Тоуорега1 HW55. Было установлено, что присутствие в буфере 0,3 М №С1 предотвращает неспецифические взаимодействия 0раЭАА01 с носителем. В результате хроматографического анализа установлено, что молекулярная масса 0раЭАА01 составляет 35 кДа, теоретическая молекулярная масса мономерной формы 0раЭАА01 - 36 659 кБа. Таким образом, на основании результатов гель-фильтрационной хроматографии можно сделать вывод, что в растворе 0раЭАА01 находится в виде мономера.
Инактивация 0раБАА01 при повышенной температуре
Влияние температуры на стабильность 0раЭАА01 было изучено в температурном диапазоне 44-60 °С (рис. 1, А). Поскольку концентрация фермента может влиять на кинетику термоинактивации, на этой стадии эксперимента начальная концентрация 0раЭАА01 в растворе была фиксирована и составляла 30 мкг/мл. Повышение температуры ожидаемо приводит к понижению температурной стабильности фермента. Как правило, для большинства мономерных ферментов термоденатурация проходит по мономолекулярному механизму и зависимость остаточной активности от времени описывается одноэкспоненциальной функцией
У = A • ехр(-^ • x).
Однако при термоинактивации 0раЭАА01 наблюдаемые зависимости в большинстве случаев плохо описываются моноэкспоненциальной функцией и гораздо лучше описываются
Рис. 1. Зависимости остаточной активности OpaDAAOl от времени инкубации при разной температуре, °С (1 - 44, 2 - 46, 3 - 48, 4 - 50, 5 - 52) представленные в обычных (А) и полулогарифмических (Б) координатах. 20 мМ Na-фосфатный буфер pH 6,5 с добавлением 10% (v/v) глицерина. Начальная концентрация фермента
[E]0 = 30 мкг/мл
суммой двух экспонент. Для подтверждения этого вывода мы провели проверку адекватности моделей аппроксимации кривых зависимости активности фермента от времени одной и двумя экспонентами в соответствие с критерием Фишера (табл. 1). Теоретический коэффициент ^теор взят из таблицы распределения Фишера для доверительной вероятности, равной 0,95. Предложенная для аппроксимации экспериментальных данных модель считается адекватной, если расчетное значение коэффициента Фишера (^эксп) меньше теоретического ) и соответственно отношение / < 1. Из
эксп. теор.
значений ^эксп / ^теор, представленных в табл. 1, видно, что двухэкспоненциальная функция у = = Аехр(-£^х) + (1 - А)-ехр(-£2-х) значительно лучше описывает полученные зависимости чем моноэкпоненциальная у = А-ехр(-Ьх). Это указывает на сложный характер процесса термоинактивации 0раВЛЛ01, включающего несколько стадий.
Зависимости остаточной активности от времени в полулогарифмических координатах представляют собой прямые (рис. 1, Б). При диссоциативном механизме инактивации зачастую наблюдаются изломы в координатах (?, 1п(А/А0)), связанные с установлением квазиравновесия. Для 0раЭЛЛ01 в полулогарифмических координатах наличие излома достоверно определить нельзя. Однако все прямые пересекают ось у не в нуле. Диапазон отсекаемых отрезков на оси у составлял 0,16-0,44. Это может быть связано с быстрым установ-
лением равновесия между разными формами фермента во время инактивации.
Влияние начальной концентрации OpaDAAOl на термостабильность
На рис. 2 представлены результаты исследования термоинактивации при 48 °C и разной концентрации OpaDAAOl. Оказалось, что повышение начальной концентрации фермента приводит к увеличению его стабильности. Это может свидетельствовать о наличии обратимой стадии второго порядка. Зависимости в полулогарифмических координатах представляют собой прямые, пересекающие ось y не в нуле.
Влияние экзогенного FAD на термостабильность OpaDAAOl
Как уже отмечалось, в некоторых случаях при термоинактивации RgDAAO и TvDAAO добавление в раствор FAD приводит к повышению стабильности фермента. Аналогичные эксперименты показали, что в случае OpaDAAOl добавление экзогенного FAD при его соотношении с ферментом от 1:1 до 10:1 приводит также к повышению температурной стабильности фермента (рис. 3). Из этого можно сделать предположение, что предложенная выше обратимая стадия второго порядка протекает с участием молекулы FAD. Отметим, что последующее увеличение концентрации FAD по отношению к концентрации фермента до соотношения 100:1, наоборот, вызывает
Тест на адекватность моделей аппроксимации зависимости остаточной активности от времени по критерию
Фишера*
T, °C F /F эксп. теор.
y = exp (-kx) y = A • exp (-k1 x) + (1 - A) • exp (-k2 x)
44 8,6 1,1
46 0,49 0,16
48 3,7 0,71
50 5,5 0,78
52 1,04 0,45
: Значения <1 выделены полужирным шрифтом.
дестабилизацию фермента. Это может быть вызвано наличием дополнительных FAD-ассоциированных стадий инактивации, наблюдаемых при высокой концентрации FAD в растворе. Зависимости в полулогарифмических координатах представляют собой прямые, пересекающие ось y не в нуле в отсутствие FAD и при соотношении [FAD] : [OpaDAAO1] = 1:1. Однако при соотношении [FAD] : [OpaDAAO1] = 10:1 отсекаемый на оси y отрезок достоверно нельзя отличить от нуля с учетом ошибки эксперимента. Это может свидетельствовать о смещении равновесной стадии в сторону активной формы OpaDAAO1.
Реактивация OpaDAAOl
На основании предположения о наличии при инактивации равновесной стадии диссоциации FAD можно ожидать, что при остановке воздействия повышенной температуры активность OpaDAAO1 при снижении температуры будет восстанавливаться вследствие смещения равновесия в сторону исходного состояния фермента. Нами была изучена реактивация фермента (рис. 4). Для этого фермент после инкубации при повышенной температуре переносили в лед и проводили определение его активности через определенные промежутки времени (0, 20, 40, 60 мин реактивации).
Рис. 2. Зависимости остаточной активности OpaDAAO1 от времени при разных значениях начальной концентрациии фермента, мкг/мл (1 - 10, 2 - 20, 3 - 30, 4 - 50) в обычных (А) и полулогарифмических (Б) координатах. 20 мМ Na-фосфатный буфер pH 6,5 с добавлением 10% (v/v) глицерина.
T = 48 °C
Рис. 3. Зависимости остаточной активности OpaDAAOl от времени при разных значениях начальной концентрациии FAD в обычных (А) и полулогарифмических (Б) координатах (20 мМ Na-фосфатный буфер pH 6,5 с добавлением 10% (v/v) глицерина; T = 48 °C; начальная концентрация фермента [Е]0 = 30 мкг/мл): 1 - без добавления FAD, 2 - [FAD]ex : [OpaDAAO1]0 =1:1,
3 - [FAD]ex : [OpaDAAO1]0 = 10:1
A/A0
t, мин
1 мин
-о- 3 мин
-Д- 5 мин
-V- 10 мин
20 мин
-<- 40 мин
Рис. 4. Исследование реактивации препаратов OpaDAAO1, отобранных после заданного значения времени на стадии термоинактивации при 48 °С (20 мМ Na-фосфатный буфер pH 6,5 с добавлением 10% (v/v) глицерина; начальная концентрация фермента
[E]0 = 30 мкг/мл)
Оказалось, что фермент склонен к частичному восстановлению своей активности.
Возможная схема термоинактивации OpaDAAOl
По результатам проведенных экспериментов можно сделать следующие выводы.
1. OpaDAAO1 в растворе находится в виде мономера.
2. Схема термоинактивации OpaDAAO1 включает в себя обратимую стадию второго порядка.
3. Эта обратимая стадия протекает с участием FAD.
На основании этих выводов мы сделали предположение, что инактивация OpaDAAO1 протекает по механизму, представленному на схеме, где EF и E - холо- и апоформы OpaDAAO1 соответственно; I - денатурированная форма OpaDAAO1; F - молекула FAD.
С х е м а
- = k2 KD ——jSL- + кз 3 ].
* D [E 1o +[F L -tEF 1 3
Решая это уравнение, получаем следующее:
[E 1о +[F lex _ln IEF ],
к2KD + къ ((E]o +) [E]o
+_k^Ko_x
+ (k2Kd + кз [EF]o + кз [F] )кзХ
-[EF ]+ kf KD +[E ]o +[F L
x ln--= t.
k.
KD +[F L
В большинстве случаев холоформы ферментов стабильнее их апоформ. Кроме того, по результатам эксперимента наблюдается стабилизация фермента при добавлении дополнительного количества FAD, что может служить указанием на большую стабильность холоформы фермента. При k2 > k3 (холоформа стабильнее апоформы) и значение KD сравнимо с [E]0 (что верно для большинства белков), одно из слагаемых уравнения можно считать константой:
-[EF ] + к2 Kd +[E ]о +[F ]
Холоформа фермента EF содержит связанный FAD и представляет собой активную форму OpaDAAO1. Если принять, что [E]0 - это общая начальная концентрация OpaDAAO1, то отношение [EF] / [E]0 будет определять значение остаточной активности A/A0. Эта схема инактивации также объясняет процесс реактивации фермента, который заключается в переходе апоформы фермента в холоформу при остановке термоинактивации. Это происходит в следствие существенного уменьшения значений констант k1, k2, k3 при охлаждении, что приводит к смещению равновесия в сторону исходной холоформы OpaDAAO1.
Вывод уравнений
Уравнения материального баланса: [E]0 = [E] + [EF] + [I], [E]0 = [E]ex + [F + [EF].
где [E]0 - начальная концентрация OpaDAAO1, [F]ex - концентрация FAD, дополнительно добавленного в систему. В условиях квазистационарного приближения:
ln-
= const.
KD +[F ]
Тогда уравнение приобретет вид:
IEF ] ([E ]0 +IF ]ex )k3 + k2 K1
ln
+
[E ]o
[E ]o +[F L
t +
к2 Kd
(к2KD + к3 [E]o + к3 [FL )к3
const.
Следовательно, угол наклона прямой в полулогарифмических координатах (1n([FF]/[F]0) - ^, будет равен наблюдаемой эффективной константе скорости инактивации
. ЦЕ1, + ^ I ) + к2 КР к . кЖр [Е10 +[F 1„ " 3 [Е№I
С помощью полученного уравнения можно провести оценку констант отдельных стадий, построив зависимость ке^ от 1/([Е]0 + [F]ex) (рис. 5). На основании этой зависимости по
2
2
к
3
Рис. 5. Зависимость наблюдаемой константы скорости инактивации к ~
от 1/([E]0 + [Flex)
углу наклона можно определить значение k2KD = (3,1±0,3)10-8 М-мин-1. С учетом того, что константа диссоциации FAD из активного центра многих оксидаз D-аминокислот составляет порядка (1-5)10 М, значения к2 должны находиться в диапазоне 0,6-3,0 мин1. Значение к3, определенное по величине отсекаемого от-
3 _3 _1
резка (рис. 5), составляет 5,610 мин , но точность определения этой величины низкая, поскольку ошибка определения превышает само значение. Тем не менее, сравнение оценочных значений к2 и к3 хорошо подтверждает факт более высокой стабильности холоформы по сравнению с апоформой OpaDAAO1.
Таким образом, в ходе настоящей работы подробно изучена кинетика термоинактивации OpaDAAO1 в разных условиях. Показано, что повышение начальной концентрации фермента в диапазоне 10-50 мкг/мл приводит к повышению температурной стабильности. При добавлении экзогенного количества FAD в отношении 1:1 и 10:1 к начальной концентрации OpaDAAO1 наблюдается эффект стабилизации, в то время как
при отношении 100:1 экзогенный FAD, наоборот, вызывает дестабилизацию. Предложена кинетическая схема, описывающая термоинактивацию в исследуемых условиях. Она включает в себя обратимую стадию диссоциации FAD из активного центра фермента и необратимые стадии инактивации холо- и апоформ OpaDAAO1. Получено аналитическое решение этой схемы в условиях квазиравновесного приближения. Объединив экспериментальные данные, мы оценили величины констант скорости инактивации апо- и холоформ фермента. Результаты сравнения этих констант свидетельствуют о большой разнице в стабильности апо- и холо-OpaDAAO! в пользу последней. Предложенный нами подход для дискриминации механизма термоинактивации и оценки стабильности можно использовать при анализе других FAD-содержащих ферментов. Кроме того, предложенная кинетическая схема температурной инактивации OpaDAAO1 может быть использована для количественной оценки экспериментов по рациональному дизайну этого фермента в целях повышения его температурной стабильности.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Tishkov V.I., Pometun A.A., Stepashkina A.V., Fedor-chuk V.V., Zarubina S.A., Kargov I.S., Atroshenko D.L., Parshin P.D., Shelomov M.D., Kovalevski R.P., Boi-ko K.M., Eldarov M.A., D'Oronzo E., Facheris S., Secundo F., Savin S.S. // Moscow Univ. Chem. Bull. 2018.
Vol. 73. N 1. P. 1-6 (DOI: 10.3103/S0027131418020153).
2. Khoronenkova S. V., Tishkov V. I. // Biochemistry (Moscow). 2008. Vol. 73. N 13. P. 1511 (DOI: 10.1134/ S0006297908130105).
3. Pollegioni L., Diederichs K., Molla G., Um-
hau S., Welte W., Ghisla S., Pilone M.S. // J. Mol. Biol. 2002. Vol. 324. N 3. P. 535 (DOI: 10.1016/S0022-2836(02)01062-8).
4. Tishkov V.I., Khoronenkova S.V. // Biochemistry (Moscow). 2005. Vol. 70. N 1. P. 40-54 (DOI: 10.1007/s10541-005-0050-2).
5. Bakke M., Setoyama C., Miura R., Kajiyama N. // Bio-technol. Bioeng. 2006. Vol. 93. N 5. P. 1023-1027 (DOI: 10.1002/bit.20754).
6. Kubicek-Pranz E.M., Röhr M. // Appl. Biochem. Biotech-nol. 1985. Vol. 7. N 2. P. 104.
7. Szwajcer E., Mosbach K. // Biotechnol. Lett. 1985. Vol. 7. N 1. P. 1 (DOI: 10.1007/Bf01032410).
8. Pollegioni L., Caldinelli L., Molla G., Sacchi S., Pilone M.S. // Biotechnol. Prog. 2004. Vol. 20. N 2. P. 467 (DOI: 10.1021/bp034206q).
9. Pollegioni L., Iametti S., Fessas D., Caldinelli L., Pi-ubelli L., Barbiroli A., Pilone M.S., Bonomi F. // Protein Sci. 2003. Vol. 12. N 5. P. 1018 (DOI: 10.1110/ ps.0234603).
10. Betancor L., Hidalgo A., Fernandez-Lorente G., Mateo C., Rodriguez V, Fuentes M., Lopez-Gallego F.,
Fernandez-Lafuente R., Guisan J.M. // Biotechnol. Prog. 2003. Vol. 19. N 3. P. 784 (DOI: 10.1021/bp025761f).
11. Dib I., Slavica A., Riethorst W., Nidetzky B. // Biotechnol. Bioeng. 2006. Vol. 94. N 4. P. 645-654 (DOI: 10.1002/bit.20854).
12. Хороненкова С. В. Рекомбинантная оксидаза D-амино -кислот: получение и структрурно-функциональные исследования: Дис. ... канд. хим. наук. М., 2008. 162 с.
13. Atroshenko D.L., Golubev I.V., Savin S.S., Tishkov V.I. // Moscow Univ. Chem. Bull. 2016. Vol. 71. N 4. P. 243 (DOI: 10.3103/S0027131416040039).
14. Atroshenko D.L., Shelomov M.D., Zarubina S.A., Ne-gru N.Y., Golubev I.V., Savin S.S., Tishkov VI. // Int. J. Mol. Sci. 2019. Vol. 20. N 18. Paper 4412 (DOI: 10.3390/ ijms20184412).
15. Poltorak O.M., Chukhray E.S., Torshin I.Y. // Biochemistry (Mosc). 1998. Vol. 63. N 3. P. 303.
16. Полторак О.М., Чухрай Е.С., Ташлицкий В.Н., Сванидзе Р.С. // Вестн. Моск. ун-та. Сер. 2. Химия. 1980. Т. 21. № 3. P. 224.
17. Полторак О.М., Чухрай Е.С. // Вестн. Моск. ун-та. Сер. 2. Химия. 1979. Т. 20. № 3. P. 195.
Информация об авторах
Кошкина Мария Константиновна - студентка химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова, [email protected];
Сергеев Егор Павлович - студент химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова, [email protected];
Федоров Тимофей Алексеевич - студент химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова, [email protected];
Шеломов Михаил Дмитриевич - аспирант химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова, [email protected];
Пометун Анастасия Александровна - ст. науч. сотр. лаборатории молекулярной инженерии Института биохимии им. А.Н. Баха, Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» Российской академии наук, ст. науч. сотр. кафедры химической энзимологии химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова, докт. хим. наук, aapometun@gmail. com;
Савин Святослав Сергеевич - ст. науч. сотр. кафедры химической энзимологии химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова, канд. биол. наук, [email protected];
Тишков Владимир Иванович - профессор химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова; зав. лабораторией молекулярной инженерии Института биохимии им. А.Н. Баха, Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» Российской академии наук; докт. хим. наук, профессор, [email protected];
Атрошенко Денис Леонидович - мл. науч. сотр. лаборатории молекулярной инженерии Института биохимии им. А.Н. Баха, Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» Российской академии наук, науч. сотр. кафедры химической энзимологии химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова, канд. хим. наук, [email protected].
Вклад авторов
Все авторы сделали эквивалентный вклад в подготовку публикации. Конфликт интересов
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Статья поступила в редакцию 05.09.2022; одобрена после рецензирования 12.10.2022; принята к публикации 14.10.2022.
