CC BY
169
581.1, 634.8, 633.11
БИОХИМИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ИЗМЕНЕНИЯ БЕЛКОВОГО И ФЕРМЕНТНОГО КОМПЛЕКСОВ И КЛЕЙКОВИНЫ ЗЕРНА ТРИТИКАЛЕ ПРИ ПРОРАСТАНИИ
Л.В. ЧУМИКИНА, ЛИ. АРАБОВА, А.Ф. ТОПУНОВ
Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН,
119071, г. Москва, Ленинский пр., 33; факс: (495) 954-27-32, электронная почта: тЫ@тЫ.ras.ru
В обзоре рассмотрено современное состояние исследований в области изменений белкового комплекса тритикале при прорастании. Большое внимание уделено вопросу изменения активности ключевых ферментов, участвующих в про -цессе распада запасных веществ в прорастающих семенах. Детально рассмотрены отличительные черты компонентного состава клейковинных белков тритикале по сравнению с пшеницей и рожью.
Ключевые слова: тритикале, пшеница, рожь, запасные белки, глутамин, глутаминсинтетаза (ГС), глутаминдегидроге-наза (ГДГ), малатдегидрогеназа (МДГ), клейковина.
Сравнительный анализ состава полипептидов из зародышей и эндосперма покоящихся сухих семян (продолжительность прорастания 0 ч) пшеницы, ржи и тритикале, проведенный методом одномерного электрофореза в ПААГ с 8Б8, показал, что по молекулярной массе они находятся в пределах от 6 до 100 кД (рис. 1) [1, 2]. В белках зародышей, взятых в различное время от начала набухания - от 0 до 72 ч, происходят значительные изменения только ко времени интенсивного роста зародышевого корешка и формирования стебля, т. е. через 48 ч; причем эти изменения у изученных трех культур не совпадали по молекулярным массам. Через 72 ч, когда отмечался интенсивный рост стебля и хорошо развитый корень в зародышах пшеницы и ржи, картина распределения полипептидов практически не изменялась по сравнению с наблюдаемой к 48 ч. А в зародышах тритикале оставались только низкомолекулярные белки.
Опыты с изолированными зародышами, т. е. отделенными от сухого эндосперма, показали, что они на-
бухают в первые 10-12 ч, но в дальнейшем не растут. Полипептидный состав изолированных зародышей, взятых через 6, 12, 18, 24, 48 и 72 ч набухания, практически не изменялся, что свидетельствует об отсутствии мобилизации запасных белков. Заметная мобилизация комплекса запасных белков эндосперма происходит значительно позже - через 5 сут набухания семян. Вероятно, распад запасных белков в эндосперме компенсировался синтезом новых полипептидов, начинающимся с первых часов набухания [1].
При набухании зерна тритикале при повышенной температуре изменений в составе белков зародыша не наблюдалось, что, возможно, связано с блокировкой ферментативных систем. Это может быть одной из причин низкого прорастания семян при высоких температурах.
Таким образом, начальный рост зародыша всех трех зерновых культур происходит на фоне заметного снижения количества многих белковых компонентов. На этом основании можно отнести белки зародыша к
Тритикале
Пшеница
Рис. 1
Рожь
белкам, выполняющим функцию запасных отложений, которые расходуются в период набухания и лаг-фазы прорастания. Характер качественных и количественных изменений в полипептидном составе в прорастающих семенах тритикале, ржи и пшеницы свидетельствует, что на начальных стадиях прорастания в первую очередь происходит катаболизм белков зародышей, как это было установлено ранее для зародышевых осей семян бобовых [3]. Мобилизация комплекса запасных белков эндосперма семян тритикале, как и семядолей бобовых растений, происходит значительно позже.
Ключевые ферменты, участвующие в процессах распада запасных веществ в прорастающих семенах до соединений, использующихся в активно идущих процессах синтеза de novo биологических молекул и их метаболизма на ранних этапах прорастания, мало изучены, за исключением амилолитических и протеолити-ческих ферментов [4]. Особый интерес представляет изучение активности ключевых ферментов метаболизма глутамина и глутаминовой кислоты в процессе прорастания, так как зародыш на ранних этапах прорастания получает a-аминный азот в виде глутаминовой кислоты и неорганический азот в виде аммония, который используется для синтеза de novo биологических молекул
В сухих семенах тритикале была обнаружена глута-миназа [2]. Ее активность сосредоточена большей частью в зародыше, и она увеличивается на ранних этапах прорастания семян. Вместе с глутаминазной активностью резко увеличивается активность глутамин-синтетазы (ГС) (рис. 2: кривые 1 и 2 соответственно). По-видимому, глутаминаза играет важную роль в развитии зародыша на стадии его гетеротрофного питания за счет собственных резервов и запасных веществ эндосперма. Глутамин, содержащийся в запасных белках эндосперма, освобождается при их протеолизе и поступает через щиток в зародыш. Под действием глута-миназы он гидролизуется с образованием глутаминовой кислоты и аммиака, которые используются для синтеза аминокислот и далее белков. В то же время
происходит ресинтез глутамина, который является донором азота для синтеза многих важнейших биологических молекул клетки. Таким образом, имеет место «глутаминовый цикл», обеспечивающий зародыш а-аминным азотом и аммонием, необходимыми для его развития.
В процессе прорастания увеличиваются также активности глутаматсинтетазы (ГСТ) и глутаматдегидро-геназы (ГДГ) (рис. 2: кривые 3 и 4 соответственно), однако их величины и степень возрастания на 1,5-2 порядка ниже по сравнению с активностью ГС, которая является главным ферментом первичной ассимиляции аммония в процессе усвоения растениями неорганического азота [2].
Результаты определения активностей малатдегид-рогеназы (МДГ) (кривые 1 и 2) и аспартатаминотранс-феразы (ААТ) (кривые 3 и 4) в зародышах и эндосперме соответственно представлены на рис. 3. Характерно, что их активность, как и активность других ферментов, обнаруживается большей частью в зародышах (кривые 1 и 3). Однако отличительной чертой является быстрое и пока необъяснимое уменьшение их активности на ранних этапах прорастания [2].
Изучение относительного содержания отдельных аминокислот показало, что для целого зерна тритикале характерно высокое содержание аспарагина, глутаминовой кислоты и аланина. А в зародышах и эндосперме в процессе прорастания наблюдается выраженное увеличение содержания глутаминовой кислоты через 18 ч прорастания и уменьшение затем почти вдвое через 72 ч. Содержание аспарагиновой кислоты многократно увеличивается в зародыше и мало изменяется в эндосперме.
Тот факт, что в зародышах в отличие от эндосперма на фоне уменьшения содержания глутаминовой кислоты происходило многократное увеличение содержания аспарагиновой кислоты, которое изначально было очень низким, может указывать на сопряженное функционирование МДГ и ААТ, находящихся, возможно, в виде бинарного комплекса.
Очевидно, что источником азотистых соединений для метаболических потребностей клеток зародыша в ходе начальных стадий прорастания могут служить его собственные растворимые белки, деструкция которых
Рис. 2
Рис. 3
создает фонд низкомолекулярных азотсодержащих соединений - аминокислот и аммиака, являющихся строительным материалом в переходные периоды от состояния покоя к прорастанию, к интенсивному росту и развитию, приводящему в конечном счете к образованию растения с присущим ему автотрофным питанием.
Таким образом, несмотря на значительное число исследований по контролю за процессом прорастания и расширение наших знаний в этом направлении, данный аспект физиологии семян по-прежнему ставит ряд вопросов, ответы на которые еще не найдены.
Известно, что хлебопекарные качества любой муки зависят главным образом от физико-химических и реологических свойств ее белков. Так, низкое качество ржаного хлеба взаимосвязано с высокой растворимостью белков, а хлебопекарные свойства пшеницы - с уникальными особенностями пространственной структуры и свойств клейковинного комплекса, состоящего из спирторастворимого глиадина и щелочерастворимого - глютенина [5].
Различают два периода существования клейковины: при формировании зерновки в поле на растении и после того, как зерновка отделена от растения и в ней происходят процессы послеуборочного дозревания, завершающие синтез, межмолекулярное агрегирование компонентов и приобретение характерного для зерна технологического качества.
Тритикале, содержащие 2 или 3 генома пшеницы в соответствии с уровнем плоидности, по количеству клейковинных белков приближается, а иногда и идентично, к пшенице. Это свидетельствует о способности зерна амфидиплоидов в количественном выражении образовывать клейковину по пшеничному типу. Характеризуя качество клейковины тритикале, следует отметить, что она хорошо отмывается в теплой воде, но по физическим свойствам (растяжимость, упругость, на-бухаемость в 2%-й уксусной кислоте и др.) уступает пшеничной. При этом на ее свойствах отражаются низкие физические качества белков клейковины ржи.
Исследование 5 лучших образцов гексаплоидных тритикале [6] показало, что 4 из них по содержанию альбумина, глобулина и глиадина превосходили пшеницу, а по количеству глютенина занимали промежуточное положение между пшеницей и рожью. Однако по хлебопекарным качествам они уступали пшенице. Сделан вывод, что хлебопекарные свойства тритикале обусловлены благоприятным соотношением глиадина и глютенина: чем оно ближе к 1 : 1, тем лучше качество хлеба.
Иное сочетание компонентного состава клейковинных белков тритикале по сравнению с пшеницей и рожью установлено в работе [7]. По количеству глютенина тритикале приближалось к твердой пшенице и ржи, а по содержанию глиадина было близким к мягкой пшенице. В то же время, при близких количественных показателях фракций глиадина характер их электрофоретических спектров был различным. Таким образом, снижение доли клейковинных компонентов в общем содержании белка и несбалансированность этих фракций приводили к тому, что при высоком процентном содержании белка в зерне тритикале количество и ка-
чество клейковины, а также хлебопекарные свойства у этой культуры были ниже, чем у мягкой пшеницы.
Эти выводы подтверждены данными [8, 9], в которых среднее содержание клейковинных белков у тритикале также было ниже, чем у мягкой пшеницы, несмотря на то, что у 5 линий обнаружено высокое содержание клейковины (40-42,9%). Однако ввиду недостаточной упругости клейковины и низких реологических свойств теста хлеб был неудовлетворительного качества [8, 9].
В среднем количество сырой клейковины у тритикале колеблется от 28 до 38%, но для каждого района выращивания, несмотря на более высокое содержание общего белка, оно ниже, чем у стандартного сорта пшеницы [10]. Аналогичные результаты получены при изучении гексаплоидных форм тритикале [11]. Пониженное содержание клейковины у тритикале по сравнению с пшеницей может быть взаимосвязано с более высокой массовой долей в зерне зародыша и алейронового слоя.
Важным фактором зерна тритикале, несущего набор хромосом ржи, является наличие в нем водорастворимых слизей, на 78-94% состоящих из пентозанов [12]. По содержанию водорастворимых пентозанов и вязкости водных вытяжек зерно тритикале превосходит пшеницу, занимая промежуточное положение между данной культурой и зерном ржи. Важно отметить, что тритикале, содержащее наименьшее количество клейковины, содержит наибольшее количество водорастворимых пентозанов.
Известно, что синтез химических соединений зер -на, в том числе и клейковины, в период его развития находится под контролем генетической конституции, т. е. сортовых особенностей. Однако при неблагоприятных условиях выращивания зерна сорт (генотип) отодвигается на второй план и примат остается за внешней средой [13]. Еще Н.И. Вавилов писал, что при неблагоприятных условиях «внешняя среда доминирует над генотипом, тогда как в условиях очень благоприятных для проявления признака генотип доминирует над внешней средой».
Изучение аминокислотного состава клейковины в рамках данного аспекта не обнаружило существенных различий для тритикале разных сортов и районов произрастания [14-16]. Количество серина, пролина, валина, тирозина и фенилаланина было несколько ниже в клейковине тритикале, чем в клейковине ржи и пшеницы; количество треонина, глютаминовой кислоты, лейцина и глицина содержалось на уровне пшеницы, а аспарагиновой кислоты, гистидина и изолейцина - на уровне ржи. В клейковине тритикале значительно больше содержалось лизина, аргинина и аланина.
Важным вопросом является природа и количество связей, возникающих между отдельными белками, образующими клейковину. Неодинаковая структура пшеничного клейковинного белка разного качества объясняется тем, что в крепкой клейковине больше дисуль-фидных и водородных связей, чем в слабой [5]. Прямое определение количества дисульфидных связей в клейковине тритикале [15] показало, что последняя находилась на уровне слабой пшеничной клейковины.
О роли водородных связей свидетельствуют результаты опытов по обработке клейковины тяжелой водой (Б2о) [5]. Сравнительное исследование влияния тяжелой воды на клейковину пшеницы, ржи и тритикале показало, что первая укрепилась в среднем в 22 раза, вторая - в 8,2 раза, а клейковина тритикале - в 8,5 раз [17]. Очевидно, что пшеничная клейковина содержит гораз -до больше водородных связей, чем клейковина тритикале, а последняя несколько больше, чем клейковина ржи.
Таким образом, в целом компонентный состав клейковинных белков тритикале отличается иным сочетанием фракций глютенина и глиадина по сравнению с рожью и пшеницей. По количеству водородных связей, которые, наряду с гидрофобными взаимодействиями, играют важнейшую роль в соединении глиади-новой и глютениновой фракций в единый комплекс, клейковина тритикале приближается ко ржи, уступая клейковине пшеницы; по количеству дисульфидных связей она находится на уровне слабой пшеничной клейковины. Данные согласуются и с характерными реологическими особенностями нативной клейковины пшеницы, тритикале и ржи. Первая - наиболее упругая и наименее растяжимая, вторая наименее упругая и более растяжимая, а третья - совсем слабая.
Презентация научных достижений по тритикале и обмен опытом регулярно осуществляются последние два-три 10- летия. Под эгидой Европейского общества селекционеров и генетиков БиСЛКР1Л проведен ряд научных форумов. Первый Международный симпозиум мирового уровня по проблематике тритикале состоялся в Австралии в 1986 г. В 1988 г. создан орган, координирующий исследования по культуре тритикале во всем мире - Международная Ассоциация Тритикале (1ТЛ). Цель 1ТЛ - быть полномочным представителем отрасли в мире. В рамках деятельности 1ТЛ развернута программа международного сотрудничества по различным аспектам качества тритикале для содействия обмену информацией и развития совместных проектов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Чумикина Л.В., Арабова Л.И., Мартынова И.В., Кол -пакова В.В. Изменение белкового комплекса семян тритикале при
прорастании // Изв. вузов. Пищевая технология. - 2005. - № 2-3. -С. 51-54.
2. Изменение состава белков, свободных аминокислот, ак -тивности глутаминсинтетазы, глутаминазы, глутаматсинтазы, глу -тамат-, малатдегидрогеназ и аспартатаминотрансферазы в семенах тритикале в процессе прорастания / Л.В. Чумикина, Н.А. Соловьева, Л.И. Арабова и др. // Прикл. биохим. и микробиол. - 1999. - 35. -№ 6. -С. 695-703.
3. Чумикина Л .В., Арабова Л.И., Зимин М.В., Гумилев -ская Н.А. Действие повышенных температур на прорастание зародышей гороха Pisum Sativum L. // Физиология растений. - 1993. - 40.
- № 1. - С. 106-109.
4. Bewley J.D., Black M. Seeds: Physiology of development and germination. - N.Y., London, Plenum Press, 1994. - 445 p.
5. Вакар А.Б. Белковый комплекс клейковины // Растительные белки и их биосинтез. - М.: Наука, 1975. - С. 38-58.
6. Hristova J. Biochemical peculiarities of octoploid and hexaploid Triticale forms // Pflanzenzjcht. - 1974. - 73. - S. 71-78.
7. Кучумова Л .П., Пархоменко Р.Г., Бречко Е.Н. Особенности фракционного состава белка тритикале и электрофорети -ческих спектров растворимых фракций // Сб. науч. работ НИИ сел. хоз-ва Центрально-Черноземной полосы им. В.В. Докучаева. - 1976.
- 13. - № 1, ч. 2. - С. 123-126.
8. Naylor R.E.L. The effect of parent plant nutrition on seed size, viability and vigour and on germination of wheat and triticale at different temperatures // Ann. Appl. Biol. - 1993. - V. 123. -№ 2. -P. 379-390.
9. Мельников Н.И., Лымаренко З.П., Редько Д.Т. Техно -логические качества двух- и трехвидовых тритикале // Селекция и семеноводство. - 1974. - № 1. - С. 21-23.
10. Жмакина О.А., Кретович В.Л., Сахарова И.А. Некоторые биохимические особенности зерна тритикале // Прикл. биохим. и микробиол. - 1976. - 12. - № 6. - С. 909-913.
11. Шулындин А.Ф., Наумова Л.Н. // Генетика. - 1967. -№ 4. - C. 30.
12. Кретович В.Л., Петрова И .С. // Биохимия. - 1947. - 12.
- № 2. - C. 97-99.
13. Колпакова В .В., Молчанова Е. Н., Васильев А.В., Чу -микина Л.В. Физико-химические свойства белков пшеницы, выращенной в резко-контрастных климатических условиях // Прикл. био -хим. и микробиол. - 2007. - № 3. - С. 382-390.
14. Казьмина Н.П., Воронова А.Е., Хачатурян Э.Е. Новая зерновая культура - тритикале и ее технологические свойства. - М.: ЦНИИТЭН, 1976. - С. 46-48.
15. Жмакина О.А., Рядчиков В.Г., Кретович В.Л. Аминокислотный состав клейковины тритикале // Прикл. биохим. и микро -биол. - 1977. - 13. - № 6. - С. 915-916.
16. Тритикале России / Ред. А.И. Грабовец // Сб. материалов заседания секции тритикале РАСХН, 8-10 июля 1999 г. РАСХН.
- Ростов н/Д, 2000. - С. 115-117.
17. Зотова Н.Н., Катыхина Т.Н., Вакар А.П. // Прикладная биохим. и микробиол. - 1972. - 8. - № 2. - С. 141-144.
Поступила 09.07.08 г.
BIOCHEMICAL FEATURES OF CHANGE OF PROTEIN AND ENZYMES COMPLEXES AND GLUTEN OF GRAINS TRITICALE AT GERMINATION
L.V. CHUMIKINA, L.I. ARABOVA, A.F. TOPUNOV
Bach Institute of Biochemistry, Russian Academy of Sciences,
33, Leninskiipr., Moscow, 119071; fax: (495) 954-27-32, e-mail: inbi@inbi.ras.ru
The review examines the current developments in the research on changes in triticale protein complexes during germination. Special emphasis is laid on the change in the activity of the key enzymes involved in the mobilization of storage proteins in germinating seeds. The typical features of triticale gluten proteins in comparison with wheat and rye are given detailed consideration.
Key words: triticale, wheat, rye, storage proteins, glutamine, glutamine synthetase (GS), glutamine dehydrogenase (GDH), malate dehydrogenase (MDH), gluten.
