CC BY
69
УДК 618.3-008.9:616.1:612.273.2
БИОХИМИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ ПОВРЕЖДАЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА ПРИ БЕРЕМЕННОСТИ
Проведено клинико-биохимическое исследование женщин репродуктивного возраста для установления роли различных активных форм кислорода в процессах формирования окислительного стресса при беременности. Установлено, что физиологическое течение беременности сопровождается развитием выраженного оксидантного стресса вследствие избыточной продукции супероксидного анион-радикала, перекиси водорода на фоне усиленной продукции гипогалоидов и пероксинитрита, а также накопления органических пероксидов. Ведущая роль в защите организма беременной женщины от активных форм кислорода принадлежит 2-й линии антиоксидантной защиты, прежде всего глутатионпероксидазе и миелопероксидазе, что рассматривается как компенсаторно-приспособительный механизм.
© 2009 г. Е.В. Олемпиева
Ростовский государственный медицинский университет, Нахичеванский пер., 29, г. Ростов н/Д, 344022, okt@rostgmu.ru
Rostov State Medical University, Nakhichevanskiy Lane, 29, Rostov-on-Don, 344022, okt@rostgmu.ru
Ключевые слова: беременность, гипертоническая болезнь, антиоксидантная защита.
These clinical biochemical investigation decoted to estimation of antioxidant status ofpregnant and nonpregnant women at reproductive uge for establishing the role of different active oxygen species on process of oxidative stress formation at pregnancy. It was established that physiological course of pregnancy associated with developing of oxidative stress due to hyperproduction of superoxide anion radical, hydrogen peroxide in couple with hyperproduction of hypohaloides and peroxinitrites, and also with accumulation of organic peroxides. Leading role in the body ofpregnant woman defence adainst active oxygen species belongs to second line of antioxidant defense, especially to glutathione peroxidase and myeloperoxides, that is on our opinion, a compensator-adaptive mechanisms.
Keywords: pregnancy, hypertension, antioxidant defense.
Последние годы ознаменовались созданием сво-боднорадикальной медицины. Ведущая концепция современной патологии исходит из признания важнейшей роли структурно-функциональной дестабилизации клеточных мембран вследствие дисбаланса процессов липидной пероксидации (ПОЛ) и уровнем антиоксидантной защиты (АОЗ). Активацию процессов ПОЛ связывают с усилением образования свободных радикалов и активных форм кислорода (АФК).
Свободными радикалами называют молекулы или структурные фрагменты молекул, имеющие на внешней орбитали неспаренный электрон. Появление такого свободного электрона означает наличие у молекулы дополнительной валентности, что обусловливает высокую реакционную способность свободных радикалов. К АФК относят кислородсодержащие радикалы - супероксидный анион-радикал, гидропероксид-ный радикал, гидроксил-радикал, а также пероксид водорода, гипохлорную кислоту и др. [1]. Высокая реакционная способность АФК делает их чрезвычайно токсичными для биологических систем от молеку-лярно-клеточного до организменного уровня.
Синглетный кислород :02 представляет собой би-радикал с двумя неспаренными электронами, хотя и не несёт заряда [2, 3]. Бирадикальная форма :02 обусловливает его высокую реакционную способность и позволяет запускать ПОЛ в 1500 раз быстрее, чем О2. Специализированных систем генерации :02 не выявлено, он нарабатывается в небольших количествах во многих реакциях АФК в виде сопутствующего продукта (при спонтанной дисмутации супероксидных радикалов; при разложении перекиси водорода (Н2О2); в реакциях с участием миелопероксидазы (МПО) и простагландинсинтетазы). Эффективными ингибиторами синглетного кислорода являются фе-нольные антиоксиданты и каротиноиды [4].
Супероксидный анион-радикал (02~*) представляет собой продукт одноэлектронного восстановления молекулярного кислорода. Супероксид - весьма реакционно-способное соединение, время его жизни порядка 10-6 с и радиус диффузии 0,3 мкм [2]. Он является окислителем средней силы, эффективно окисляет ас-корбат, а-токоферол, водные растворы Си+ и Fe+2; легко окисляется люминолом, Cu2, Fe+3 и цитохро-мом С. При протонировании супероксида образуется пергидроксильный радикал НО:*, который является более стабильной молекулой (время жизни 10"3 с, радиус миграции 10 мкм) и более сильным окислителем, за счет отсутствия заряда способен сравнительно легко мигрировать через мембраны. Он может индуцировать ПОЛ, способен переходить в другие формы АФК, обладающие цитотоксическим действием [5, 6].
Гидроксильный радикал ОН является наиболее реакционным и вредным из активных кислородных метаболитов (АКМ). Он может разрывать любую С-Н- или С-С-связь. Время жизни гидроксильного радикала в биологических субстратах составляет 10-9 с. Образование ОН-радикала показано в реакциях окисления арахидоновой кислоты, микросомальном окислении, реакциях с флавиновыми ферментами, убихи-ноном и пероксинитритом [2, 7].
Перекись водорода Н2О2 представляет собой продукт двухэлектронного восстановления молекулярного кислорода, который стабилизируется протонирова-нием. В отличие от остальных АКМ Н2О2 не является радикалом, однако её относят к группе АКМ. Она достаточно стабильна и может легко проникать через мембраны и мигрировать из одних клеток и тканей в другие [7].
Общая особенность свободных радикалов делает их эффективным инструментом локального действия от «привязанного к месту» («ОН) и внутриклеточного (:02, 02~») до межклеточного (Н202, ЯО», ШЭ2*) и межтканевого (N0*, СО») уровней. Действие внешних прооксидантов и активация эндогенных механизмов генерации АКМ приводит к напряжению механизмов АОЗ и развитию окислительного стресса. Можно утверждать, что АКМ занимают ведущее место в патогенезе радиационного поражения, деструкции тканей, вызванной развитием воспалительной реакции, постишемических, реперфузионных и гипе-роксических повреждений, а также целого ряда брон-хо-лёгочных, сердечно-сосудистых и генетически обусловленных заболеваний [4]. Необходимо сказать, что некоторые авторы предполагают наличие окислительного стресса даже при физиологическом течении беременности [8, 9].
Считается, что антиоксидантные системы препятствуют дестабилизации структурно-функционального состояния мембран клеток и обеспечивают протекание свободнорадикальных процессов на стационарном уровне. При анализе процессов ПОЛ и эффективности механизмов АОЗ имеют значение не столько абсолютные величины показателей, сколько соотношение между ними [9].
В процессе эволюции в клетках для защиты от АКМ выработались специализированные системы ферментативных антиоксидантов, к которым относятся супероксиддисмутаза (СОД), каталаза, МПО, глу-татионпероксидаза (ГПО), глутатионредуктаза (ГР), целулоплазмин, глутатион и др. Ферментативные антиоксиданты характеризуются высокой специфичностью действия, направленного против определённых форм АКМ; специфичностью клеточной и органной локализации, а также использованием металлов в ка-
честве катализаторов. При этом уровень внутриклеточных ферментативных антиоксидантов находится под строгим генетическим контролем [10].
Для установления биохимических механизмов повреждающего действия различных АФК проведена оценка антиоксидантного статуса крови беременных и небеременных женщин.
Материалы и методы исследования
На основании данных осмотра, анамнеза жизни, ультразвукового и электрофизиологического исследования выделены 2 основные группы женщин. Контрольная представлена 30 практически здоровыми небеременными женщинами репродуктивного возраста (22,3±1,2 г.). В клиническую вошли 45 практически здоровых беременных женщин в сроке гестации 38-42 недели, средний возраст пациенток составил 25,4±2,6 г.
Материалом для исследования выбраны эритроциты и плазма венозной крови, взятая натощак из куби-тальной вены. В эритроцитах определяли активность СОД по H.P. Misra [11], каталазы по реакции с перекисью водорода и молибдатом аммония (МН^Мо^м методом Н.А. Королюк [12], ГПО - по скорости окисления восстановленного глутатиона в присутствии гидроперекиси третичного бутила по методу В.М. Моина [13], ГР - спектрофотометрически по скорости окисления НАДФ методом Л.Б. Юсуповой [14], а также концентрацию восстановленного глутатиона методом G.L. Ellman по реакции с 5,5-дитиобис(2-нитробен-зойной) кислотой [15]. В плазме крови определяли активность МПО по методу Klebanoff, описанному М.Г. Шафран и С.Н. Лызловой [16]. Для оценки ки-слородтранспортной функции крови в эритроцитах определяли концентрацию 2,3-дифосфоглицерата (2,3-ДФГ) неэнзиматическим методом в модификации И.С. Лугановой [17], а в плазме крови - активность цитохромоксидазы (ЦХО) по Р.С. Кривченковой в реакции с диметил-n-фенилендиамином [18].
Статистическую обработку экспериментальных данных проводили согласно общепринятым методам с определением средней арифметической ошибки с использованием программы STADIA версия 6.0 [19]. О достоверности отличий учитываемых показателей контрольной и опытной групп судили по величине t-критерия Стьюдента после проверки распределения на нормальность. Статистически достоверными считали отличия, соответствующие оценке ошибки вероятности р<0,05.
Результаты и обсуждение
Известно, что около 90 % потребляемого человеком молекулярного кислорода вовлекаются в процессы биологического окисления. В этой связи особый интерес представляет оценка кислородной емкости крови и интенсивность тканевого дыхания у женщин при физиологическом течении беременности. Нами установлено, что физиологическое течение беременности сопровождается значительным статистически достоверным ростом концентрации аллостерического модулятора сродства гемоглобина к кислороду 2,3-ДФГ на 283,8 % (р<0,05) относительно контрольной группы. Такие изменения концентрации 2,3-ДФГ свидетельствуют о формировании модуляционного типа
адаптации, направленного на оптимизацию процессов оксигенации органов и тканей беременных женщин (табл. 1). Однако улучшение доставки кислорода к тканям способствует лишь увеличению кислородной емкости крови и не отражает степени утилизации молекулярного кислорода в процессах тканевого дыхания.
Таблица 1
Показатели кислородтранспортной функции крови у беременных и небеременных женщин репродуктивного возраста (х±М)
Параметр Группа
контрольная, n=30 клиническая, n=45
2,3-ДФГ, моль/л 4,44±0,347 12,6±0,359 р<0,05
ЦХО, нм/мг белка 23,5±1,41 25,78±1,28 0,1<р<0,05
Примечание. р - степень достоверности относительно контрольной группы.
Косвенным показателем утилизации молекулярного кислорода при внутриклеточном метаболизме является активность ЦХО плазмы. Установлено, что ЦХО плазмы при физиологическом течении беременности имеет тенденцию к росту на 9,7 % (0,1>р>0,05) относительно контрольной группы. Такие изменения активности ЦХО возможно свидетельствуют о тенденции к активации тканевого дыхания в ответ на избыточное поступление молекулярного кислорода.
Усиление кислородного гомеостаза является стимулом для активации свободнорадикальных процессов. В ходе исследования нами выявлено неоднозначное повышение активности ферментов 1-й и 2-й линии АОЗ (табл. 2).
Таблица 2
Показатели АОЗ крови у беременных и небеременных женщин репродуктивного возраста (х±М)
Параметр Г руппа
контрольная, n=30 клиническая, n=45
СОД, усл. ед./г НЬ 4,68±0,23 12,8±3,72 р<0,05
Каталаза, мкат/г НЬ 2,43±0,097 3,44±0,101 р<0,05
Коэффициент СОД/каталаза, усл. ед. 1,93±0,16 3,72±0,26 р<0,05
Коэффициент СОД/ГпО, усл. ед. 2,32±0,225 0,780±0,052 р<0,05
ГПО, усл. ед./г НЬ 2,02±0,081 16,5±0,29 р<0,001
ГР, мкмоль/г НЬ 12,77±1,07 33,4±0,366 р<0,05
Восстановленный глутатион, мкмоль/г НЬ 5,82±0,349 13,2±0,309 р<0,05
МПО, мкмоль/мг белка 11,63±0,461 82,8±4,04 р<0,001
Примечание. р - степень достоверности относительно контрольной группы.
Зарегистрировано значительное статистически достоверное увеличение активности СОД у женщин с физиологическим течением беременности на 173,5 % (р<0,05) по сравнению с контрольной группой. Рост
активности СОД рассматривается нами как косвенное свидетельство избыточной продукции супероксидного анион-радикала, что инициирует развитие свобод-норадикальных процессов. Кроме того, данные изменения в активности СОД свидетельствуют о повышении продукции и перекиси водорода, обладающей неоднозначными биологическими эффектами. Однако изолированная оценка активности СОД не дает полноценной картины о развитии ПОЛ. Совместно с ней «на страже» работает и другой фермент - каталаза. В ходе исследования было отмечено менее выраженное увеличение активности каталазы у женщин с физиологическим течением беременности на 41,6 % (р<0,05) относительно контрольной группы.
Для более детальной характеристики состояния системы 1 -й линии АОЗ и уровня продукции Н2О2 целесообразно рассчитать коэффициент СОД/каталаза. Оказалось, что этот параметр статистически достоверно превышает значения контроля на 92,8 % (р<0,05), что свидетельствует о выраженной продукции Н2О2. Возможно, увеличение количества Н2О2 при физиологическом течении беременности способствует развитию компенсаторно-приспособительных реакций, обеспечивающих формирование эндотелий-независимой вазодилатации, и направлено на улучшение процессов циркуляции в маточно-плодовом круге кровообращения, так как перекись водорода является фактором гиперполяризации эндотелиоцитов.
При оценке направленности изменений активности ферментов 2-й линии АОЗ было установлено, что активность ГПО у беременных женщин при физиологическом течении беременности с большой долей достоверности увеличивается на 716,8 % (р<0,001) по сравнению с контролем. Такие изменения на фоне менее выраженного роста каталазы можно считать формированием компенсаторно-приспособительной реакции в ответ на избыточную продукцию АФК, с одной стороны, а с другой - учитывая различия в сродстве ферментов к субстрату, свидетельствуют о накоплении органических пероксидов.
Активность ГР, обеспечивающей процесс восстановления окисленного глутатиона, при физиологическом течении беременности также увеличивается на 161,6 % (р<0,05). Такие изменения в работе ферментов 2-й линии АОЗ позволяют считать, что ведущая роль в защите организма беременной женщины от оксидантного стресса принадлежит именно этой группе ферментов. При этом отмечается увеличение количества восстановленного глутатиона на 126,8 % (р<0,05) относительно той же группы. Увеличение концентрации восстановленного глутатиона при высокой активности ГПО и менее выраженной активности ГР является результатом усиления его синтеза за счёт активации работы у-глутамилцистеинсинтетазы и глутатионсинтетазы.
Некоторые исследователи [2, 10] предлагают в качестве показателя защитной эффективности антиок-сидантных ферментов определять соотношение СОД/ГПО. Рассчитав данный показатель, мы обнаружили, что у женщин с физиологическим течением беременности он оказался ниже значений контрольной группы на 66,4 % (р<0,05), что свидетельствует о значительном вкладе в АОЗ 2-й линии.
Интересной находкой оказалось выраженное статистически значимое увеличение МПО активности плазмы на 436,9 % (р<0,001) относительно контрольной группы. Такие изменения в активности МПО свидетельствуют об усиленной продукции гипогалоидов, а также могут способствовать избыточной продукции пероксинитрита, что обеспечивает участие данного фермента как энзима 2-й линии АОЗ. С другой стороны, такая значительная активность МПО плазмы свидетельствует о дегрануляции нейтрофильных лейкоцитов и, возможно, является результатом либо повышения микробиоцидного потенциала полиморфноя-дерных лейкоцитов, либо свидетельствует о выраженных деструктивных изменениях клеточных мембран лейкоцитов.
Полученный фактический материал свидетельствует о том, что при физиологическом течении беременности увеличивается кислородная ёмкость крови, усиливаются процессы диссоциации оксигемоглоби-на. Необходимо подчеркнуть, что ведущая роль принадлежит модуляционному механизму адаптации. Такой характер обменных процессов в красных клетках крови у данной группы пациенток, по-видимому, является одним из механизмов формирования компенсаторных реакций, предназначенных как для обеспечения адекватной работы основных энергопроду-цирующих циклов, так и для кислородного обеспечения плода. Очевидно, такая направленность обменных процессов эритроцитов является физиологически обоснованной, поскольку для родоразрешения требуются значительные энергетические ресурсы для непосредственного изгнания плода и адекватного функционирования всех жизненно важных органов беременной женщины. Выявленные изменения со стороны антиоксидантного статуса свидетельствуют о том, что физиологическое течение беременности сопровождается развитием выраженного оксидантного стресса вследствие избыточной продукции супероксидного анион-радикала, Н2О2 на фоне усиленной продукции гипогалоидов и пероксинитрита, а также накопления органических пероксидов. Ведущая роль в защите организма беременной женщины от АФК принадлежит 2-й линии АОЗ, прежде всего ГПО и МПО, что можно считать компенсаторно-приспособительным механизмом, позволяющим иметь доношенную беременность и срочное родоразрешение.
Литература
1. Ланкин В.З., Тихадзе А.К., Беленков Ю.Н. Свободно-радикальные процессы при заболеваниях сердечно-сосудистой системы // Кардиология. 2000. Т. 40, № 7. С. 48-58.
2. Меньщикова Е.Б. Окислительный стресс. Проокси-данты и антиоксиданты. М., 2006. 556 с.
3. Владимиров Ю.А., Азизова О.А., Деев А.И. Свободные радикалы в живых системах // Итоги науки и техники ВИНИТИ АН СССР. 1991. Т. 29. С. 252.
4. Фенольные биоантиоксиданты / Н.К. Зенков [и др.]. Новосибирск, 2003. 328 с.
5. Роль оксида азота и кислородных свободных радикалов в патогенезе артериальной гипертонии / Е.Б. Манухи-на [и др.] // Кардиология. 2002. Т. 42, № 11. С. 73-81.
6. Марков Х.М. Молекулярные механизмы дисфункции эндотелия // Кардиология. 2005. № 12. С. 62-72.
7. Дубинина Е.Е. Роль активных форм кислорода в качестве сигнальных молекул в метаболизме тканей при состояниях окислительного стресса. // Вопросы мед. химии. 2001. Т. 47, № 6. С. 561-581.
8. Показатели оксидантного и антиоксидантного статуса у беременных с гестозом / А.В. Аккер [и др.] // Акушерство и гинекология. 2000. № 4. С. 17-20.
9. Абрамченко В.В. Антиоксиданты и антигипоксанты в акушерстве. СПб., 2001. 400 с.
10. Зенков Н.К., Ланкин В.З., Меньщикова Е.Б. Окислительный стресс. Биохимический и патофизиологический аспекты. М., 2001. 340 с.
11. Misra H.P., Fridovich J. Superoxide radicals as precursos of mitochondrial gydrogen peroxide // The J. Biol. Chem. 1972. Vol. 247, № 1. P. 188-192.
12. Метод определения активности каталазы / Н.А. Ко-ролюк [и др.] // Лаб. дело. 1988. № 1. С. 16-19.
13. Моин В.М. Простой и специфический метод опреде-
ления активности глутатионпероксидазы в эритроцитах // Лаб. дело. 1986. № 12. С. 724-727.
14. Юсупова Л.Б. О повышении точности определения активности глутатионредуктазы эритроцитов // Лаб. дело. 1989. № 4. С. 19-21.
15. Ellman G.L. Tissue sulfhydryl groups // Arch. Biochem. Biophys. 1959. Vol. 82. Р. 70-77.
16. Шафран М.Г., Лызлова С.Н. Очистка и некоторые свойства миелопероксидазы лейкоцитов белых мышей // Вопросы мед. химии. 1975. № 6. С. 629-633.
17. Луганова И.С., Блинов М.Н. Определение 2,3-ДФГ неэнзиматическим методом и АТФ в эритроцитах больных хроническим лимфолейкозом // Лаб. дело. 1975. № 7. С. 652-654.
18. Кривченкова Р.С. Современные методы в биохимии. М., 1977. С. 47-49.
19. Кулайчёв А.П. Методы и средства анализа данных в среде Windows Stadia 6.0. М., 1996. 257 с.
Поступила в редакцию_28 октября 2008 г.
