CC BY
9
УДК 796.012.1:612.111 Корж В. П.
Б10Ф13ИЧН1 ПАРАМЕТРИ МЕМБРАН ЕРИТР0ЦИТ1В У СП0РТСМЕН1В
Харювський нацюнальний медичний ужверситет
За допомогою зондовог флюоресцентног спектроскопи гз використанням флюоресцентних зонд{в трену г АНС оцтювали бюф{зичт параметри мембран еритроцит{в у 23 спортсметв на р{зт перюди трену вольно-змагальног д{ялъност{. Для оцтки накопичення в мембранах юте калъщю, в{дпов{далъного за основт параметри функцюнування мембранних структур, використовували флуоресцентный зонд хлортетрациклт. Вивчали актившстъ Ыа+,К-АТФази. В мембранах еритроцит{в спортсметв, в периферичнш кров{ яких тдвищено вмжт морфолог{чно змтених форм еритроцит1в, виявлено змти бюф{зичних параметр{в, активност{ Ыа+,К+-АТФази та вмюту юте калъщю.
Ключов1 слова: спортсмени, адаптацт, еритроцит, мембрана, флуоресцентне зондування, ¡они кальц1ю, активнють Ыа+,К+-АТФази
Вступ
Сучасний спорт - це можливють здоровоТ лю-дини розвивати адаптацшж зд1бносп оргажзму в умовах екстремальноТ д1яльносп ¡, перш за все, при значних ф1зичних \ психоемоцшних наван-таженнях. Процес адаптаци супроводжуеться пщвищенням функцюнальноТ активносп бюлоп-чних структур та покращенням Тхнього функцю-нування. За нерацюнально побудованих трену-вальних програмах, яю не вщповщають функцю-нальним можливостям атлета, окрем1 функци можуть виснажуватися \ функцюнування оргаж-зму проткае на перед - та патолопчному р1внях. Такий стан дизадаптаци призводить до виник-нення стажв перевтоми, перенапруження, перетренованосп та значного зниження працездатносп, а у подальшому до розвитку за-хворювань та травм [11]. Дослщження перед- та патолопчних стажв оргажзму передбачае вияв-лення загального мехажзму, який лежить в основ1 зрушень ц1еТ саморегулюючоТ системи [10]. Анал1з результате сучасних дослщжень показав, що одним ¡з фактор1в структурно-функцюнальних порушень в оргажзм1 спортсмежв, як наслщок надм1рних ф1зичних на-вантажень е змши, яю вщбуваються у мембранах кл1тин. Стан кл1тинноТ мембрани багато в чому визначае проткання ф1зюлопчних та бюх1м1чних процеав та розвиток пристосуваль-них мехажзм1в на вах оргажзацшних р1внях оргажзму: субкл1тинному, кл1тинному, тканинно-му системному тощо [2, 4, 12]. Мембрани вах кл1тин оргажзму мають довол1 схож1 структурж характеристики, тому цтком обфунтованим е дослщження структурних пошкоджень мембран кл1тин кров1 як ужверсальних д1агностичних мар-кер1в [1, 3, 9].
Для виконання ф1зюлопчних функцш за необ-хщне е рухливють структурних компоненте мембрани. Компоненти мембран пов'язаж пом1ж собою не за рахунок ковалентних зв'язюв, а гщ-
рофобними та електростатичними силами, \ тому мембрани е вельми гнучкими та здатж до активного обмшу сво'Гми елементами ¡з оточуючим середовищем. Бюф1зичж параметри кл1тинноТ мембрани в першу чергу залежать вщ и лтщно'Г компоненти [4]. ГНпщний б1шар мембран не е лише ¡нертною основою щодо розмщення мембранних бшмв, а активний елемент складноТ системи чисельних молекул, що взаемодшть, та без чого не можливе не ттьки здшснення бар'ерноТ функцП' мембран, але й нормальна дн яльнють мембранних рецептор1в, ¡онних канал1в та безл1ч1 фермент1в [15,16]. Кооператив^ структура переходи, як1 виникають у мембранах, ¡н-дукують конформацшж модифкаци лтщ1в та/або б1люв, й визначають в'язкють та текучють мембрани, а також трансмембранний транспорт \ активнють мембранозв'язаних ферментативних систем [4, 8]. Видтяють дектька процеав, що призводять до ушкоджень мембран: внутр1юп-тинне накопичення южв кальцш; д1я фосфолн паз \ лтаз; детергентна д1я вищих жирних кислот; мехажчне (осмотичне) розтягування мембрани; адсорбц1я на мембран! пол1електрол1т1в, у тому числ1 окремих бтюв й пептид1в; перемене окислювання л1пщ1в. Наведен1 вище процеси практично р1вною м1рою сприяють деструкци мембранних утворень кл1ток та як правило е взаемозалежними. Так накопичення южв каль-цш в кл1тинах викликае дезорган1зац1ю мембран як за рахунок прямот взаемодП' кальцш з л1пщ-ними молекулами, так \ за рахунок пщвищення активносп кальц1й-залежно'|' фосфол1пази А2 [14]. Стрес-реакц1я мае мобт1зуючий ефект на оргажзм шляхом пщвищення концентрацП' ¡он1в кальцш в мембранах [12], що призводить до збтьшення м1кров'язкост1 л1пщного матриксу мембран. Надлишок кальцш в умовах тривалоТ стрес-реакц1'|' призводить до дм, що пошкоджуе кл1тинн1 структури, зм1нюе д1ю гормон1в \ мед1а-тор1в. Стресов1 гормони безпосередньо, або
* Обраний напрям досл^джень виконувався у в^дпов^дност: з темою науково-досл1дноГ роботи кафедри ф1зично)' реабтта-ц/)', спортивно!' медицини та валеологп Дн/пропетровськоГ державно? медичноГ академп: «Розробка та оптимизация методов лжарського контролю при ф!зичному вихованн/', оздоровчому та спортивному тренуванн1» (номер державноТ реестрацп 0100и000352)
опосередковано активують лтази, фосфолтази та збтьшують перекисне окисления лтщ1в, субстратом якого е ненасичеш жирш кислоти. Пщ-вищення ненасиченосп жирнокислотного складу мембранних фосфолтщ1в е загальною стратеп-ею мембранно'| адаптаци. Однак накопичення окисненних ненасичених жирних кислот може призводити до виникнення перекюних кпастер1в, м1ж якими виникають канали ¡ohhoï провщност1, що призводить до збтьшення проникливосп та порушенням загальних властивостей мембран [8].
Мета роботи - вивчення змш бюф1зичних па-раметр1в мембран еритроцит1в при довготрива-лих ф1зичних навантаженнях у спортсмешв на р1зних етапах ïx тренувально-змагально'Г д1яль-
hocti.
Об'ект та методи дослпджснь
У обстеженш приймали участь 23 спортсмени у вщ1 вщ 20 до 27 роюв, яю тренуються на ви-тривалють. Спортсмешв було розподтено на 2 групи. Першу групу, склали 11 спортсмешв ¡з bmîctom в кров1 еритроцит1в нормоцит1в. Другу групу склали 12 спортсмешв у яких реестрували суттеве зростання морфолопчно'Г неоднорщносп пулу еритроцит1в, на що свщчило BiporiflHe, у пор1внянш з першою групою атлет1в, зниження вмюту двовв1гнутих дискоцит1в та збтьшення Ki-лькосп перехщних, передгемол1тичних й деге-неративних форм еритроцит1в
Дослщження проводилося на pi3Hi перюди тренувально-змагально'| д1яльност1. 1з отриманих зразш кров1 видтяли суспензш мембран ерит-роцит1в [13]. Вмют бтку у суспензП' мембран ви-значали м1кроб1уретовим методом. Оцшку структурного стану мембран проводили за допомо-гою флуоресцентного зондування на спектрофлюориметр1 «Shimadzu-RF510». Вико-ристовували негативно заряджений зонд АНС (1-антшонафталш-8-сульфонат) та неполярний зонд nipeH. Мкров'язкюты властивост1 глибинно'| структури л1пщно'| фази мембрани еритроциту та м пдрофобний об'ем оц1нювали вщповщно ви-значенню стввщношення ¡нтенсивност1 флюо-ресценц1'| ексимерно'Г форми зонду nipeHy до мо-HOMipHOï 1470 / 1370 при довжиы хвил1 збуджуючого св1тла Хв = 285 та 340 нм вщповщно, а також 1370 / 139о при Хв = 340 нм [5]. Вщсоток ¡ндуктивно-резонансного переносу енерш ¡з триптофанових
залиишв до nipeHy, що дозволяе характеризу-вати 61лок-л1пщн1 взаемодП' у мембраш, розрахо-вували за методом Г.е. Добрецова [6]. Вм1ст в мембранах ¡он1в кальц1ю визначали за показни-ками флюоресценцП' комплекав Са-хпортетрациклш (ХТЦ). 1нтенсивн1сть флуоресценцП' АНС реестрували при Лзб=380 нм та Лфл=490 нм. Активн1сть Ыа+,К+-АТФази у мембранах еритроцит1в визначали вщповщно зростання вмюту неоргашчного фосфору Pi у ¡нкубацшному середовищ1 [7].
Математичну та статистичну обробку результате проводили за допомогою комп'ютера ¡з використанням програмних пакет1в Statistica 6.0 (StatSoft Inc., США) та Excel 2003 (Microsoft Corp., США). Вщповщно до експери-ментальних установок, р1зниц1 м1ж середн1ми арифметичними тестували за допомогою парного t-тесту. Р значения <0,05 було прийняте як достов1рне. Результати вщображеш як середне арифметичне ± середньоквадратичне вщхилення.
Результати дослпджснь та "ix обговорення
Серед спортсмен1в, другоТ групи, у яких в пе-риферичнш кров1 пщвищувався вмют морфоло-пчно змшених форм еритроцит1в вщзначали суб'ективш прояви перевтоми та/або перетрено-ваност1, для них були характерними: вщмова вщ тренувальних занять; скарги на попршення за-гального стану (немотивована стомлюванють, головний бть, безсоння, роздратованють, то-що); як правило серед них спостер1гали негати-вну динамку ф1зичноТ працездатност1 (зниження абсолютних та вщносних показниюв PWC170, максимального споживання кисню). Виявлеы по-рушення негативно впливали на тренувальну дн яльнють, процеси вщновлення пюля ф1зичних навантажень, спортивну результативнють, ф1зи-чну i псих1чну працездатнють та стан здоров'я атлет1в. Пщвищення в кров1 трансформованих еритроцит1в та зростання пол1морф1зму популя-цм червоних кл1тин е вщдзеркаленням порушень структури та метабол1зму еритроциту [9].
Було виявлено, що у спортсмешв другоТ групи спостер1галися змши параметр1в флуоресценцП' зонду nipeHy, який дифундуе у мембранах до вуг-леводноТ дтянки мембрани та можливо до дтян-ки глщеринових залишюв (табл..1).
Таблиця 1
Спектральш характеристики nipeHy, зв'язаного з мембранами epumpoLiumie у спортсмешв, та актившсть в еритроцитах Na*,К*- АТФази (М±т)
Спортсмени
1 группа (N=11) 2 группа (N=12)
Параметри флюоресценци' (у.о): I470/I370 (Я, = 285 нм) I470/I370 (Ä-в = 340 нм) I370/I390 (Я-в = 340 нм) 0,354 ±0,018 0,438 ±0,019 0,942 ± 0,004 0,289 ±0,017* 0,371 ±0,018* 0,959 ± 0,007
Величина м1грацм енергм з триптофану до nipeHy, R (%) 53,97 ±1,64 51,98 ±2,01
Актившсть Na+,[^-АТФази (мкМ Р / год ■ мг бтку) 0,067 ± 0,004 0,049 ± 0,004*
üpuMimKa: *- Р<0,05 сп1ввЮношення показниюв м'ж групами спортсмена
Таблиця 2
Спектральш характеристики АНС, зв'язаного з мембранами еритроцит'!в у спортсмешв (М±т)
Спортсмени
1 группа (N=11) 2 группа (N=12)
флюоресценц1я (у.о): 1,0 ±0,03 0,96 ± 0,03
КАНС (у.о): 0,054 ±0,014 0,046 ± 0,009
ЫАНС нМоль/мг. б1лку 0,438 ±0,019 0,371 ±0,018*
Таблиця 3
Показники флюоресценцп комплексов Са-ХТЦ в мембранах еритроцит1в у спортсмешв (М±т)
Спортсмени
1 группа (N=11) 2 группа (N=12)
НФ, у.о.: 11,38 ±0,54 12,52 ±0,36*
ПФ, у.о: 15,09 ± 1,03 16,88 ± 1,24
ШДПФ, у.о./хв.. 0,119±0,02 0,171±0,03*
Прим1тка: НФ - начальна флюоресценщя, ПФ - п'т флюоресценцП] ШДПФ -швидюсть досягнення пку флюоресценцп
Серед атлетов вщзначалося зниження в мембранах еритроци"пв показника 1470/1370 при довжиш хвил1 збуджуючого свппа Хв = 285 нм на 19 % (р<0,05) у сшввщношенш до показниш спортсмешв першо'Г групп. Надане може бути обумов-лене зменшенням у мембранах еритроцит1в гщ-рофобного об'ему зони бшок-лшщних контакте та пщвищенням м1кровязкосп [5].
Щодо зниження пдрофобного об'ему прилегло'Г до ¡нтегральних бтюв лтщно'Г фази мембрани та посилення дисоц1аци бткового компоненту мембран свщчило збтьшення вщсотку ¡ндуктив-но-резонансного транспорту енерги ¡з молекули триптофану до молекули шрену. Пщвищення мн граци енергП' вщбивае залучення до змш бокового компоненту, що поряд ¡з процесами дисоцн аци або перебудови у молекулах бтюв може бути пов'язане ¡з зануренням останшхдо лтщного шару [6]. Надаш змши можуть бути одшею ¡з причин збтьшення полярносп оточення шрену. Структурними особливостями лтщного матри-ксу у значнш м1р1 визначаеться активнють транспортних АТФаз, як1 розташоваш у глибиш лтщного шару мембран. У спортсмешв, як1 увшшли до друго'Г групи, було встановлено зниження показниюв активносп мембраноасо-цшованого, юнотранспортного ензиму Ыа+,К+-АТФази на 27 % (р<0,05) у сшввщношенш до по-казниш першо'Г групи спортсмешв, що свщчило на користь змш бткових компоненте мембран еритроцтчв.
У спортсмешв спостер1галися змши показниюв 1470 /1370 при довжиш хвил1 збуджуючого св1тла Хв = 340 нм. В першш груш атлет1в вони склада-ли 0,438 ± 0,019, а в друпй 0,371 ± 0,018. Надаш змши свщчили щодо пщвищення у спортсмешв друго'Г групи в'язкосп лтщного б1шару еритроци-т1в в цтому.
Таким чином змши параметр1в флюоресценцП' шрену свщчили на користь ушкоджень у спортсмешв друго'Г групи структурно-функцюнального стану глибинного шару мембран еритроцит1в.
Збтьшення показниш 1з7о/1зэо при довжиш хви-л1 збуджуючого св1тла Хв = 340 нм були незнач-ними та свщчили про зростання у спортсмешв друго'Г групи полярносп оточення молекул шрену у глибиш лтщного б1шару мембрани \ зниження компактное^ (розрихпення) упаковки фосфолн пщ1в за рахунок накопичення у мембраш значноТ
ктькост! полярних сполук води, зростання активное^ реакцш перекюного окисления лтщ1в та оголения полярних груп бткових молекул у результат! дисоц1аци ол1гомерних ансамбл1в.
Вщомо, що при взаемоди ¡з бюлопчною мембраною негативно заряджена молекула АНС ло-кал1зуеться переважно на поверхневих дтянках мембрани у зонах контакту бток - лтщ [5]. Встановлено, що у спортсмешв друго'Г групи ¡н-тенсивнють флюоресценцП' мембранозв'язаного АНС була нижчою, шж у атлет1в першо'Г групи (табл..2). Одночасно знижувалася константа зв'язування АНС (КАНс) I пщвищувалася ктькють м1сць зв'язування зонда з мембранами кл1тинок (Мднс). Таким чином у спортсмешв друго'Г групи збтьшувалася \ м1кров'язкють поверхневих ша-р1в мембрани еритроцит1в.
Встановлено, що у трупах спортсмешв, яких було обстежено, в мембранах еритроцит1в в1ро-гщно розр1знялися показники флюоресценцП' комплешв Са-ХТЦ (пщвищувалися початкова флюоресценц1я на 10 % \ п1к флуоресценци на 12 %), що свщчило про м1жгрупову р1зницю вмю-ту в мембранах юшв кальцш, що е вщповщаль-ними за основш параметри кл1тинного реагуван-ня (табл.. 3). Бтьш висою показники тку флюоресценцП' мембранних комплешв Са-ХТЦ та швидкосп досягнення шку флюоресценцП' комплешв Са-ХТЦ (збтьшувалася на 43 %) у спортсмешв друго'Г групи були вищ1, що свщчило про збтьшення проникносп мембран для юшв кальцш \ пщвищення Тх вмюту в мембранах еритроцит1в у даних атлет1в.
Висновки
1. У спортсмешв з дизадаптацшними проява-ми змшюеться структурно-функц1ональний стан поверхневих та глибинних шар1в мембран еритроцит1в. За рахунок накопичення у мембраш значно'Г ктькост1 полярних сполук води спостер1гаються зм1ни компактност1 (розрихлення) упаковки фосфолтщ1в. Зм1ни свщчили щодо пщвищення в'язкосп л1пщно-го б1шару еритроцит1в в ц1лому.
2. Встановлено зменшення пдрофобного об'ему прилегло'Г до ¡нтегральних бтш лтн дно'Г фази мембрани еритроцит1в та ушко-дження бткового компоненту мембран, яке поряд з процесами дисоц1ацм або перебудо-
ви у молекулах бтш може бути пов'язане ¡з зануренням останшх до лтщного шару мем-брани. Спостеркалося зниження активносп вбудованих до мембран ферментативних ансамбл1в.
Порушення функцюнальноТ активносп фер-мент1в, що вщповщають за м1жюптинний транспорт iOHiB, призводить до збтьшення проникност1 мембран для iOHiB кальцш, пщ-вищенню ix вмюту в мембранах, що мае негативы наслщки щодо структурно'!' цшюносп кл1тин.
Своечасне виявлення розвитку та корекц1я зм1н стану мембрани еритроцит1в вкрай по-тр1бне за ходом тренувально-змагальноТ fli-яльносп спортсмеыв, осктьки е суттевим
резервом щодо оптим1заци спортивно: працездатно-CTi та стану здоров'я атлет1в.
Лпсратура
Абдулкадыров K.M. Клиническая гематология: Справочник (Спутник врача). / K.M. Абдулкадыров - СПб.: Питер, 2006. -448 с.
Болдырев A.A. Биомембранология.: Учебное пособие. / A.A. Болдырев, Е.И. Кяйвяряйнен, В.А. Илюха. - Петрозаводск : Изд-во Кар. НЦ РАН, 2006,- 226 с.
Васильева Е.М. Биохимические особенности эритроцитов: влияние патологии (обзор литературы) / Е.М. Васильева // Биомедицинская химия. - 2005. - Т. 51, Вып.2. - С.118 - 126. Владимиров Ю.А. Роль нарушений свойств липидного слоя мембран в развитии патологического процесса / Ю.А. Владими-
10. 11. 12.
13.
14.
15.
16.
ров // Патол. физиология и эксперим. терапия. - 1989. - № 4. -С.7-19.
Владимиров Ю.А. Флуоресцентные зонды в исследовании биологических мембран / Ю.А. Владимиров, Г.Е. Добрецов - М. : Наука, 1980.-320 с.
Добрецов Г.Е. Флуоресцентные зонды в исследовании клеток, мембран и липопротеидов / Добрецов Г.Е. - М. : Наука,1989. -277 с.
Казенное A.M. Исследование активности Ыа+,К+-АТФазы в эритроцитах млекопитающих / A.M. Казенное , М.Н. Маслова , А.Д. Шалабодов // Биохимия. - 1984. - № 7. - С. 1089-1094. Липиды и рак. Очерки липидологии онкологического процесса / М.Г. Акимова [и др.], под ред. В.В. Безуглова и С.С. Коновалова. - СПб. : Прайм-Еврознак, 2009. - 352 с.
Новицкий В.В. Физиология и патофизиология еритроцита / В.В. Новицкий, H.B. Рязанцева , Е.А. Степовая. - Томск : Изд-во Том. ун-та, 2004. - 202 с.
Перхуров A.M. Интегральные показатели функциональной по-дготовлености спортсменов в донозологическом аспекте / A.M. Перхуров // Журнал РАСМИРБИ. - 2007. - №1 (21). - С. 35 - 41. Пешкова О.В. Типи синдрому перетренованост1 у спортсмешв ¡грових вид1в спорту / О.В. Пешкова // Медичш перспективи. -2009. - Том XIV, № 3. - С. 91 - 97.
Пшенникова М.Г. Феномен стресса: эмоциональный стресс и его роль в патологии / М.Г. Пшенникова // Патол. физиология и эксперим. терапия. - 2000. - № 3. - С. 20-26. Dodge J.Т. Erythrocytes membranes isolation / J.T.Dodge, C.Mitchell, D.J. Hanahan // Arch. Biochem. Biophys. - 1963. -V.100. - P. 119-130.
Shaloske R.H. The phospholipase A2 superfamily and its group numbering system // R.H. Shaloske, E.A. Dennis // Biochim. Biophys. Acta. - 2006. - V. 1761. - P.1246 - 1259. Vance D. Biochemistry of lipids, lipoproteins, and membranes / D. Vance, J. Vance. - N.Y. : Elsivier Pub.Co., 2008. - 576 p. Yamaji-Hasegawa A. Asymmetric distribution of phospholipsds in biomembranes / A.Yamaji-Hasegawa, M. Tsujimoto // Biol. Pharm. Bull.-2006. -V. 29. -P. 1547-1553.
Реферат
БИОФИЗИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ МЕМБРАН ЭРИТРОЦИТОВ У СПОРТСМЕНОВ Корж В.П.
Ключевые слова: спортсмены, адаптация, эритроцит, мембрана, флуоресцентное зондирование, ионы кальция, активность Ыа+,К+-АТФазы
С помощью зондовой флуоресцентной спектроскопии с использованием флуоресцентных зондов пирена и АНС оценивали биофизические параметры мембран эритроцитов у 23 спортсменов на разные сроки тренировочно-соревновательной деятельности. Для оценки накопления в мембранах ионов кальция, ответственного за основные параметры функционирования мембранных структур, использовали флуоресцентный зонд хпортетрациклин. Изучали активность Ыа+,К+-АТФазы. У спортсменов, в периферической крови которых повышено содержание морфологически измененных красных клеток крови, выявлены изменения биофизических параметров, активности Ыа+,К+-АТФазы и содержания ионов кальция в мембранах эритроцитов.
Summary
BIOPHYSICAL PARAMETERS О ERYTHROCYTE MEMBRANES FOR ATHLETS Korzh V.P.
Keywords: athlets, adaptation, erythrocyte, membrane, fluorescent probing, calcium ions, Na+,K+-ATPase activity
By means of the probe fluorescent spectroscopy of erythrocyte membranes with the use of fluorescent probes piren and ANS we have estimated biophysical properties of erythrocyte membranes in 23 athlets.
To evaluate of the calcium ions accumulation in the erythrocyte membranes responsible for the major paramétrés of membrane structure functionion we have used the probe chlortetracycline fluorescent spectroscopy. We have also studied the activity of Na+,K+-ATPase. It has been found out the athlets show the change in biophysical parameters and the increase in the number of calcium ions in the erythrocyte membranes in the peripheral blood as well as the alterations in the Na+,K+-ATPase activity.
