CC BY
18
УДК 615.276.4:616-092:612.017.1]015.44.076.9 ВеснЫа Л.Е.
РОЛЬ КАЛЬЦ1ЙЗАЛЕЖНИХ МЕХАН1ЗМ1В В РЕГУЛЯЦП ЕКСПРЕСП ПОВЕРХНЕВИХ МЕМБРАННИХ РЕЦЕПТОР1В Л1МФОЦИТ1В
Науково-дослiдний iнститут генетичних та iмунологiчних основ розвитку патологи та фармакогенетики, Украшська медична стоматолопчна академiя, м. Полтава
Проведено визначення ролi кальцшзалежних механiзмiв в регуляцп експресп поверхневих мем-бранних iмуноглобулiнiв A,M,G та антигенних детермтант лiмфоцитiв CD3, CD4, CD8, CD23, CD72, HLA-DR та гх перегрупувань у площин мембрани за допомогою реакцп прямог та непрямой iмунофлюоресценцii. Показано, що незалежно вiд мехатзму пригнчення надходження каль-цю у пятину - блокування мембранних каналiв за допомогою верапамшу та фен^дту, зв'язування поза- та внутрiшньоклiтинного кальщю ЕДТА та ВАРТА вiдповiдно, вiдбуваюmься односпрямован змти, як характеризуются зниженням експресп та рухливостi у площин мембрани поверхневих iмуноглобулiнових рецепторiв та антигенних детермтант лiмфоцитiв. Зроблено висновок, що збереження фiзiологiчноi концентраци кальцю у позаклтинному прос-торi та нормальне функщонування транспортних систем для ютв е суттевими для бшьш вiддаленних за часом етатв формування групувань рецепторiв у виглядi переважно петчiв та кетв, а тдтримання внутршньоцитозольног концентраци кальцю - для формування початко-вих угрупувань - мембранних кластерiв. Результати роботи свгдчать, що на початкових ета-пах активацп iмунокомпетентних клiтин тдтримка кальщевого гомеостазу забезпечуе повно-цтну експреЫю поверхневих мембранних рецепторiв та адекватне перегрупування у площинi мембрани i тим самим тдтримуе високий рiвень функцюнальног активностi лiмфоцитiв.
Ключов1 слова: кальцшзалежы мехажзми, л1мфоцити, рецептори, експреая.
Дослщження е фрагментом науково-дослщно'Т роботи НД1 ГЮРПФ "Вивчення локал1заци та мехажзм1в секрецп регулятор-них пептидних комплешв нирок за ф|зюлопчних умов та п1д час типових патолопчних процес1в", № держреестрацп 0109и002187.
Вступ
Кальцieвi мехаызми в^грають важливу роль у пщтриманш сталост внутршнього середовища багато^тинного оргашзму на рiвнi нервовоТ, ендокринноТ та iмунноТ систем. Так, каль^евою сигнальною системою на раных етапах забезпе-чуються актива^я, пролiферацiя i виконання ефекторноТ функци iмунокомпетентними кланами, зокрема, опосередкування вiдповiдi на стимуляцш TCR-CD3 рецепторного комплексу [13].
Роль кальцш як регулятора фiзiологiчних процесiв, що вiдбуваються у штиж, добре вщо-ма. Нормальний рiвень кальцiю в цитозолi пщ-тримуеться мехаызмами його активного транспорту через бюмембрани та системою його ком-партменталiзацiТ у клiтинних органелах. Зазви-чай надходження кальцiю у кттину за градiен-том концентраци врiвноважуеться його активним виведенням, яке реалiзуеться за участю пред-ставниш родини Са2+- АТФ-аз i Na+/Ca2+ обмiном у збудливих тканинах. Рiвень кальцiю також ре-гулюеться його секвенуванням у кл^инних органелах - ядр^ мiтохондрiях, ендоплазматичному ретикулум^ зв'язуванням внутрiшньоклiтинними бiлками.
Порушення внутр^ньокл^инного гомеостазу цього iону, що супроводжуеться значним пщви-щенням його концентраци у цитоплазмi клiтини, лежить в основi механiзму клiтинноТ загибелi пщ час цiлоТ низки патологiчних стаыв, таких як iшемiя, аутоiмуннi процеси та ш. [11].
Вiдомо, що за деяких фiзiологiчних умов мо-же збiльшуватись проникнiсть плазматичних мембран зi змiною концентрацiТ внутршньоклн тинного кальцш як сигнального механiзму, що
значним чином сприятиме зм^ функцюнальноТ активностi клiтин. Тому метою нашоТ роботи стало визначення ролi кальцшзалежних мехаш-змiв в регуляцiТ експресп поверхневих мембранних рецепторiв лiмфоцитiв та Тх перегрупувань у площиш мембрани.
Матерiали та методи
Експериментальн дослiдження проведено на 74 зразках перифершноТ кровi здорових донорiв вком 21-40 рокiв. Перед початком дослщження отримано дозвiл комiсiТ з етичних питань та бю-етики УкраТнськоТ медичноТ стоматолопчноТ ака-демiТ.
Суспензш лiмфоцитiв отримували за станда-ртним методом центрифугуванням у градiентi густини фкол-триомбраст (р=1,077 г/см) iз на-ступним вiдмиванням у фосфатно-сольовому буфера рН 7,4 [5]. Юлькють клiтин у суспензiТ' становила в середньому 1-1,5х106/мл [4].
Для модуляци внутрiшньоклiтинного рiвня Са + використовували прямий антагонют - вера-памт, якiй взаемодiе з повiльними Ca2+-каналами клiтинноТ мембрани i дтянками зв'язування Ca2+ на мембранi [2] та фентдин -змiшаний антагонют кальцш, взаемодiе з повi-льними каналами плазматичноТ мембрани, впливае на процеси накопичення i звтьнення Ca2+ всерединi клiтини (посилення депонування в мiкросомах, взаемодiя з кальмодулшом) [1]. 1н-кубацiю лiмфоцитiв iз препаратом iзоптину гщ-рохлорид (верапамт) (Knoll, Germany) проводили в концентра^ях 0,025; 0,05; 0,01 мг/мл; з фе-нiгiдином (УкраТна) в концентра^ях 0,002; 0,004; 0,024 мг/мл [12] протягом 60 хвилин при 37° С.
Позакл^инний кальцш блокували за допомо-
гою хелатора - динатрiевоT солi ети-лендiамiнотетраоцтовоT кислоти - ЕДТА, що створюе комплекснi сполуки з iонами кальцш та магнiю в позаклiтинному середовищк ЕДТА (Serva, Feinbiochemica,Heidelberg/New York) ви-користовували в концентрацiT 2,5*10-3 М та шку-бували 60 хвилин при 37° С.
Внутршньо^тинний кальцш зв'язували хе-латором внутрiшньоклiтинного кальцш 1,2-бiс(О-амiнофеноксi)-етан-N,N,N,N-тетраоцтовоT кислоти (ВАРТА), яка завдяки гщрофобним вла-стивостям надходить до кл^ини. ВАРТА (ICN Biomedicals, USA) додавали до суспензiT моно-нуклеарiв в концентрацiT 2*10- М [18] та шкубу-вали 60 хвилин при 37°С.
Проникнення iонiв кальцiю всередину клiтини iндукували шляхом додавання до суспензп кт-тин каль^евого iонофору А23187 (Sigma, USA) в кшцевш концентрацiT 1*10-7 М [18] та шкубацп 60 хвилин при 37°С. А23187 в гщрофобнш фазi утворюе комплекси з каль^ем та опосередковуе електронейтральний трансмембранний перенос двовалентного катiону Са2+ на iнший двовалент-ний катюн або два протони.
Дослiджуванi препарати шкубували Í3 суспен-зiею лiмфоцитiв у середовищi 199 (Sigma, USA) з додаванням 10% шактивовано!' телячо!' сиро-ватки (BioMark, УкраTна), 10 мМ HEPES (Sigma, USA), 100 мкг/мл гентамщину сульфату (ДНЦЛЗ, Украша). В якостi контролю використовували фосфатно-сольовий буфер (ФСБ).
Змшу функцiональноT активност лiмфоцитiв реестрували за рiвнем та характером флюорес-ценцiT поверхневих рецепторiв за допомогою прямого та непрямого iмунофлюоресцентного аналiзу.
У реакцiT прямоT iмунофлюоресценцiT викори-стано антитiла проти мембранних iмуноглобулi-нiв A,M,G людини, кон'югованi з Ф|Тц (Sanofi, France). Неспецифiчному зв'язуванню запоб^а-ли шляхом адсорбци препарату антитiл на аце-тонованому порошцi печiнки щурiв. Для непрямого iмунофлюоресцентного аналiзу були вико-ристанi моноклональнi антитiла до поверхневих мар^в лiмфоцитiв - LT3 (CD3), LT4 (CD4), LT8 (CD8), LT23 (CD23), 3F3 (CD72), LT-DR (HLA-DR)
45
40
■з I 35
0)
30
cu о 25
о
<¿ 20
с
# 15
п
£ 0) 10
m OL 5
(Сорбент, Роая). В якост вторинних антитт бу-ло використано кон'югованi з Ф1ТЦ анти^(аЬ)2-антитта (Сорбент, Росiя).
Реeстрацiю флюоресценцп проводили на мн кроскопi "Люмам-Р8" (ЛОМО, Роая), пщрахову-вали вiдносну кшьмсть клiтин з флюоресценцieю (у вщсотках). Результати оцiнювали за штенсив-нютю флюоресценцп: власну (фонову) флюоре-сценцш (дуже слабке свiтiння) вважали негативною реак^ею, виражену флюоресценцiю - позитивною реак^ею та видтяли слабкий, серед-нiй та сильний ступшь флюоресценцп [10]. Контроль власноТ флюоресценцп лiмфоцитiв проводили шсля Тх вiдмивання у ФСБ.
За характером флюоресценцп видiляли ди-фузний тип, коли рецептори рiвномiрно розподн ленi у площинi мембрани та перегрупування у виглядi кластерiв (окремi невеликi групи рецеп-торiв), петчiв (плями, бiльш впорядкована форма кластерiв) та кепiв (перегрупування у виглядi капелюшка) [3].
Морфолопчний контроль клiтин проводили у фазовому контрастк Життездатнiсть клiтин ви-значали в тест з трипановим сишм, у середньо-му вона становила 95-97% [5].
Результати та 1х обговорення
Як вщомо, в процесах активацп iмунокомпе-тентних клiтин провщне значення посiдае саме iнтенсивнiсть каль^евого обмiну мiж клiтиною та середовищем [19]. Лiмфоцити мають широкий спектр юнних каналiв, якi беруть участь в регу-ляцiТ Тх функцюнальноТ' активностi [14]. Тому на першому етапi дослiдження було визначено вплив блокування каль^евих каналiв на рiвень експресiТ поверхневих iмуноглобулiнових рецеп-торiв лiмфоцитiв.
Верапамiл достовiрно пригнiчував експресш поверхневих iмуноглобулiнових рецепторiв, найбiльш значним чином у концентрацп 0,01 мг/мл - у 3,3, у концентрацп 0,05 мг/мл - у 3,8 рази (рис. 1).
Спостер^алась змша характеру перегру-пувань рецепторiв у площинi мембрани, яка сто-сувалась переважно зменшення формування кешв та петчiв (табл. 1).
1нтакт
0,01
0,025
0,05
Рис. 1. 3MÍHa експресп поверхневих iмуноглобулiнових рецепторе лiмфоцитiв nid дieю верапамлу. Тут, та на рисунку 2 по ос абсцис - концент- розбiжностей мiж штактними лiмфоцитами та рацiя препарату (мг/мл). лiмфоцитами, iнкубованими з верапамiлом у рь
Тут, та в таблиц 1 - * - p<0,05 - вiрогiднiсть зних концентрацiях.
0
Таблиця 1
Змна характеру перегрупувань поверхневих ¡муноглобулшових рецептор1в л/мфоцит/в п1б б1ею верапамлу (М±а)
ЕкспреЫя антигенних дете-рмшант 1д А,М,Э (% позитивних кштин) 1нтактш лiмфоцити, (п=5) Лiмфоцити, iнкубованi з верапамiлом в дозi 0,01 мг/мл, (п=5) Лiмфоцити, iнкубованi з верапамтом в дозi 0,025 мг/мл, (п=5) Лiмфоцити, шкубоваш з верапамiлом в дозi 0,05 мг/мл, (п=5)
0 59,20+4,15 87,80+3,96 65,0+4,06 89,40+3,05
дифузне 3,0+2,0 3,80+4,09 4,80+4,15 0,80+0,84
кепи 12,20+4,82 3,20+1,64 5,20+4,44 3,40+3,13
петчi 18,80+5,50 3,0+2,35 22,80+6,14 3,0+2,12
кластери 6,80+4,66 2,20+1,10 2,20+2,17 3,40+0,55
Примтка: тут та в табл. 2,3,4 - 0 - клтини, у яких вдсутня флюоресценц/я; дифузне - дифузне свшння мембрани.
Блокада каль^евих каналiв плазматичних мембран за допомогою змшаного антагонюту каль^я фентдину також показала пригшчення
Г- 50 -,-
^ —
рiвня експресп поверхневих iмуноглобулiнових рецепторiв лiмфоцитiв у вах використаних кон-центрацiях (рис. 2).
ш 40 ^
о
30
о
2 20 ■&
л 10
ш т
0
iнтакт
0,002
0,004
0,024
Рис. 2. Змша експресп поверхневих ¡муноглобулнових рецептор1в л/'мфоцит/'в п1д дею фен/г/дину.
2+
Слщ вщзначити, що зниження експресп мем-бранних iмуноглобулiнiв пщ впливом фенiгiдину спостерiгалось меншою мiрою, нiж пiд впливом верапамiлу, також менш вираженим було пере-групування рецепторiв у площинi мембрани.
Таким чином, пригшчення обмшу iонiв Са мiж клiтиною та зовнiшнiм середовищем за ра-хунок блокади повтьних каналiв i дiлянок зв'язування Са2+ на мембранi фенiгiдином, зни-жуе рiвень експресiТ поверхневих iмуноглобулi-нових рецепторiв та Тхне перегрупування у пло-щинi мембрани, тим самим знижуючи функцю-нальну активнiсть лiмфоцитiв.
У лiмфоцитах пiсля швидкого транзиторного пщйому вмiсту [Ca2+]i внаслiдок звтьнення iз внутрiшньоклiтинних джерел розпочинаеться тривале (бтьше 30 хвилин) пiдвищення за раху-нок надходження Са2+ ззовш [16], тому наступ-
70
§ 60
кп
£ н- 50 40 30 20 10
0 1д А,М^ CD3
ним етапом стали дослiдження за умов зв'язування зовнiшньо- та внутршньокттинного кальцiю.
Використання хелатора зовшшньоштинного кальцiя ЕДТА призвело до зниження рiвня експресп iмуноглобулiнових рецепторiв на 21,55% максимально в дозi 2,5х10-3 М (рис. 3), зниження штенсивносп флюоресценцiТ та зменшення утворення кешв i петчiв рiзних ступешв флюоре-сценцп.
Також змiнювалась експреая антигенних де-термiнант лимфоцитiв: на 19,4% знижувалась експресiя CD3, на 26,72% - CD4 та значно знижувалась (у 3,1 рази) експреая молекул CD23, що супроводжувалось незначним перегрупуван-ням рецепторiв (рис. 3).
го
Е 'о <и ср с
о ^
Ш
CD4
CD8
CD23
Рис. 3. Зм/'на експресП' поверхневих рецептор1в л1мфоцит1в пд д'ею ЕДТА. Бл стовпчики - ¡нтактна група; ср стовпчики -використання ЕДТА в доз12,5х 10-3 М; - р<0,05 - в1рог1днють розб1жностей м1ж ¡нтактними лимфоцитами та лимфоцитами,
яю ¡нкубували з ЕДТА.
CD4 CD8
CD72 HLA-DR
Рис. 4. ЗмНа експресП поверхневих рецептор1в л1мфоцит1в пд дею пд дею ВАРТА. Бл стовпчики - /'нтактна група; ср стовпчики - використання ВАРТА в доз1 2x10-2 М; * - р<0,05 - в1рог1дн1сть розб1жностей м1ж ¡нтактними лимфоцитами та
лимфоцитами, як ¡нкубували з ВАРТА.
Таблиця 2
Змна характеру перегрупувань поверхневих рецептор1в л/мфоцит/в п1д д1ею ВАРТА (М±а)
ЕкспреЫя антигенних детермтант 1нтактш лiмфоцити, Лiмфоцити, шкубоваш з ВАРТА в дозi
(% позитивних кштин) (п=6) 2х10"2 М, (п=6)
1 2 3
CD 3
0 32,83+7,94 52,33+7,26*
дифузне 0,0±0,0 0,0+0,0
кепи 11,0+5,59 7,0+1,79
петчi 1,67+2,34 6,33+2,42*
кластери 54,50+5,72 34,33+5,35*
CD 4
0 68,17+4,45 81,83+3,19*
кепи 8,33+3,33 7,50+3,27
петчi 5,50+4,32 4,0+2,28
кластери 18,0+3,03 6,67+2,50*
CD 8
0 70,67+6,47 63,33+5,72
кепи 6,0+3,03 10,33+4,72
петчi 1,83+1,47 2,83+1,72
кластери 21,50+7,45 23,50+4,51
CD 72
0 91,33+3,39 98,0+2,10*
кепи 2,17+2,79 0,0+0,0
петчi 3,0+1,79 2,0+2,10
кластери 3,50+2,95 0,0+0,0
0 84,50+4,04 92,83+3,19*
кепи 8,83+4,49 5,17+3,25*
петчi 6,67+3,33 0,0+0,0
кластери 0,0+0,0 2,0+0,89
Примтка: * - р<0,05 - в1рог1днють розб1жностей м1ж ¡нтактними лимфоцитами та лимфоцитами, як ¡нкубували з ВАРТА.
Таблиця 3
Змна характеру перегрупувань поверхневих ¡муноглобулшових рецептор1в л/мфоцит/в п1д д1ею ¡онофору А23187 (М±а)
ЕкспреЫя антигенних детермтант 1д А,М^ (% позитивних кштин) 1нтактш лiмфоцити, (п=6) Лiмфоцити, шкубоваш з А23187 в дозi 100 нмоль/л, (п=6)
0 66,20+3,96 63,20+3,42
кепи 7,20+3,19 14,60+2,61
петчi 20,40+4,62 20,0+3,16
кластери 6,20+4,76 2,20+1,10
Примтка: * - р<0,05 - в1рог1днють розб^жностей м1ж¡нтактними лимфоцитами та лимфоцитами, яю ¡нкубували з А23187.
Таблиця 4
Змна характеру перегрупувань поверхневих рецептор1в л/мфоцит/в п1б б1ею онофору А23187 (М±а)
Експресiя антигенних детермшант (% позитивних клiтин) lнтактнi лiмфоцити, (п=6) Лiмфоцити, шкубоваш з А23187 в дс^ 1*10-7 М, (п=6)
1 2 3
CD 3 0 дифузне кепи петчi кластери 41,0+7,01 2,17+2,14 8,33+2,80 11,50+2,66 37,0+3,74 37,17+8,52 2,17+3,06 13,67+5,05* 4,67+1,86* 42,33+4,08*
CD 4 0 дифузне кепи петчi кластери 71,0+6,45 2,0+1,79 5,17+1,94 16,83+3,31 5,0+3,90 74,67+5,24 2,83+2,32 16,0+5,62* 1,0+0,89* 5,50+4,23
CD 8 0 дифузне кепи петчi кластери 80,50+5,58 1,0+1,26 6,83+4,07 3,17+1,94 8,50+4,23 77,50+7,18* 0,0+0,0 5,17+4,07 3,33+2,58 14,0+5,33*
CD 72 0 дифузне кепи петчi кластери 91,0+5,51 0,0+0,0 0,67+0,82 1,0+1,55 7,33+4,27 86,83+4,71* 1,0+1,10 5,33+1,97* 1,0+0,89 5,83+1,72
НЬА^ 0 дифузне кепи петчi кластери 85,67+4,32 1,17+1,17 3,0+2,45 7,0+4,60 3,17+1,47 88,0+9,08 1,0+1,26 8,0+7,35 1,0+0,63* 2,0+1,55
1нкуба^я лiмфоцитiв з високоафшним хела-тором внутршньо^тинного кальцш ВАРТА сприяла зниженню експреси поверхневих iмуно-глобулiнових рецепторiв на 18,49% та зменшен-ню перегрупувань рецепторiв у виглядi кепiв, пе-тчiв i кластерiв, що е ознакою зниження функцн онально!' активност клiтин.
Дослiдження експреси поверхневих антиген-них детермiнант лiмфоцитiв на фон зв'язування внутрiшньоклiтинного кальцiю за допомогою ВАРТА показало вiрогiдне зниження експреси CD3 - на 29,03%, CD4 - на 42,92%, CD72 - на 76,93% та HLA-DR - на 53,74% (рис. 4).
Також змшювалось перегрупування рецепто-рiв у площиш мембрани - зменшувався на 37,01% рiвень утворених кластерiв iз молекул CD3, збiльшувалась кiлькiсть петчiв CD3 у 3,8 рази (табл. 2). Ктькють кластерiв CD4 знижува-лась у 2,7 рази, зникали петчi та на 37,94% зни-жувалась кiлькiсть кепiв з молекул HLA-DR.
Отриманi данi дали змогу зробити висновок, що використання хелатора внутршньокл^инно-го кальцш ВАРТА призвело до зниження рiвня експреси як поверхневих iмуноглобулiнових ре-цепторiв та антигенних детермшант CD3, CD4, CD72 та HLA-DR.
Наступним етапом було дослщжено експре-сiю поверхневих рецепторiв за умов пщвищен-ного вмюту iонiв кальцiю всерединi клiтини, який моделювали використанням iонофору А23187
(перенос Са2+ iз позаклiтинного середовища з концентра^ею 1x10-3 М всередину клiтини, де концентрацiя кальцiю 0,1 х10- М) [7].
Використання юнофору А23187 виявило тен-денцiю до пщвищення експреси поверхневих iмуноглобулiнових рецепторiв лiмфоцитiв та перегрупування переважно у виглядi кепiв (табл. 3).
Каль^евий iонофор А23187 здатен утворю-вати в гщрофобнш фазi комплекси з каль^ем, опосередковувати електронейтральний транс-мембранний перенос двовалентного катюну, що рiзко збiльшуе вмiст юшв кальцiю всерединi клн тинi та сприяе стимуляци експреси поверхневих антигенних детермшант лiмфоцитiв [3].
Обробка кл^ин кальцiевим iонофором А23187 призводила до вiрогiдного збiльшення рiвня експреси антигенних детермшант CD8 з 19,50+5,58% до 22,50+7,18% та CD72 з 9,0+5,51% до 13,17+4,71%.
Також отриманi результати змши перерозпо-дiлу рецепторiв у площиш мембрани - вiрогiдне пщвищення ктькосп кепiв та кластерiв, зниження ктькосп петчiв CD3, збтьшення у 3,1 рази рiвня кетв CD4, збiльшення кiлькостi кластерiв CD8, збiльшення у 8 разiв ктькосп кепiв CD72 (табл. 4).
В цтому, iнкубацiя лiмфоцитiв за умов дм кальцiевого iонофору А23187 сприяла збтьшен-ню рiвня експреси антигенних детермшант CD8
та CD72, активiзувала перерозподiл рецепторiв у площиш мембрани в бiк переважного утворен-ня кепiв та кластерiв.
Сприйняття кл^иною активуючих сигналiв призводить до процеав, якi розпочинаються на мембран в першi секунди та хвилини - змша потоку одновалентних катюшв Na+ та К+, рашшне трансметилювання лiпiдiв, активацiя фосфолн пази А2, посилення потоку Са2+ у кл^ину, змiна концентрацiТ циклiчних нуклеотидiв [3]. Процес активацiТ лiмфоцитiв потребуе обов'язкового пщвищення внутрiшньоклiтинноТ концентрацiТ Ca2+ [20].
Нами отриманi данi, якi свiдчать, що незале-жно вщ механiзму пригнiчення надходження кальцiю у кттину - блокування мембранних ка-налiв за допомогою верапамiлу та фентдшу, зв'язування поза- та внутршньокл^инного каль-цiю, вiдбуваються односпрямованi змши, якi ха-рактеризуються зниженням експресп та рухли-востi у площин мембрани поверхневих iмуно-глобулiнових рецепторiв та антигенних детермн нант лiмфоцитiв.
Зниження експресп мембранних рецепторiв лiмфоцитiв тiсним чином корелюе зi зменшен-ням Тх функцюнальноТ активностi, можливосп лн ганд-рецепторноТ взаемодiТ пiд час розвитку iму-нноТ вiдповiдi.
Не менш важливим для лiмфоцитiв е характер перерозподту рецепторiв у площиш мембрани, в мехашзмах якого приймае участь каль-цш. Кальцiй залучаеться в процеси пщтримки цитоскелету як безпосередньо, так i через низку Са2+-зв'язуючих протеТнiв та ензимiв. Особливо важливим е рiвень Са2+ у цитоплазмi для утво-рення асоцiацiТ бiлкiв цитоскелету з бтками плазматичноТ мембрани та взаемодп рiзних елементiв цитоскелету. Поверхнева структура кл^ин регулюеться динамiчними взаемодiями мiж бiлками цитоскелету та мембраною [8]. Ко-ординована агрегацiя рецепторiв вщбуваеться, як правило, у виглядi кластерiв, кепiв або петчiв, що забезпечуеться Тх асо^а^ею з фiламентами кл^ини [15, 21].
За фiзiологiчних умов взаемодiя мiкрофiла-ментiв, мiкротрубочок з мембранними бтками знаходиться в динамiчнiй рiвновазi, що забезпе-чуе утворення невеликих кластерiв та петчiв, як вважаються бiльш впорядкованою формою кла-стерiв [6]. Петчi рецепторiв, поряд з пусковим сигналом для активацп Т- та В-кштин, регулю-вання ктькосп антитiл, несуть додаткову шфо-рмацiю для клiтини, яка надходить до неТ шляхом ендоцитозу комплешв лiганд-рецептор [9], кепи використовуються для припинення надхо-дження надлишкового сигналу у кштину шляхом викиду комплешв л^анд-рецептор у зовнiшне середовище, або ут^заци в лiзосомах.
Вщповщно до наших результатiв, спостер^а-лись односпрямоваш змiни в бiк пригшчення утворення переважно петчiв та кешв при блоку-ваннi надходження кальцш у клiтину верапамн
лом та фентдином та при зв'язуваннi зовшш-ньоклiтинного кальцiю за допомогою ЕДТА. Це свщчить, що збереження фiзiолоriчноT концент-рацiT кальцiю у поза^тинному просторi та нор-мальне функцюнування транспортних систем для iонiв е суттевими для бiльш вiддаленних за часом еташв формування групувань рецепторiв. Зв'язування внутрiшньоклiтинного кальцiю ВАРТА пригшчувало утворення не тiльки петчiв та кешв, але й початкових угрупувань - мембранних кластерiв, що е важливим для подаль-ших процеав поляризаци клiтини. Цiлковита не-обхiднiсть пiдтримання внутрiшньоцитозольноT концентрацiT кальцш пiдтверджуеться стимуля-цiею утворення кластерiв та кепiв поверхневих iмуноглобулiнових рецепторiв та антигенних де-термiнант лiмфоцитiв при дiT iонофору А23187.
В цтому результати роботи свiдчать, що на початкових етапах активацп iмунокомпетентних кл^ин пiдтримка кальцiевого гомеостазу забез-печуе повноцiнну експресiю поверхневих мембранних рецепторiв та адекватне перегрупуван-ня у площинi мембрани i тим самим пiдтримуе високий рiвень функцiональноT активностi лiм-фоцитiв.
Л^ература
1. Джишамбаев Э.Д. Применение антагонистов кальция при нарушениях ритма сердца / Э.Д. Джишамбаев //Кардиология.-1987.- T.27, № 5.- C. 109-116. 217
2. Добронравов В.А. Блокаторы кальциевых каналов в нефропро-текции / В.А. Добронравов, О.В. Царькова //Нефрология.-2004.- Т. 8, № 1.- С. 7-21.
3. Иммунология: / [под ред. У. Пола: пер. с англ.].- М.: Мир, 19871988.- Т.1.- С. 414-469.
4. Лабораторные методы исследования в клинике / [справочник] / [под ред. В.В. Меншикова]. - М.: Медицина, 1987, - 368 с.: ил.
5. Лимфоциты: Методы: / [под ред. Дж. Клауса: пер. с англ.]. - М.: Мир, 1990. - 393 с., ил..
6. Молекулярная биология клетки / [пер. с англ.] /Б. Албертс, Д. Брейт, Дж. Льюис и др. - М.: Мир, 1999.- Т. 1-5.- 296 с.
7. Руководство по иммунофармакологии: / [под ред. М.М.Дейла, Дж.К. Формена: пер. с англ.].- М.: Медицина, 1998.- 332 с.
8. Семенов А.В. Элементы цитоскелета и патогенез аллергических реакций. 1.Элементы цитоскелета и их функции (обзор литературы) / А.В. Семенов // Клин. лаб. диагностика. - 2002.- № 11.- С. 3-11.
9. Семенов А.В. Элементы цитоскелета и патогенез аллергических реакций. 2.Цитоскелет и его участие в патогенезе аллергических реакций (обзор литературы) / А.В. Семенов //Клин. лаб. диагностика.- 2003.- № 2.- С. 3-8.
10. Современные проблемы ревматологи / [науч. обзор] / [Под ред. В.А.Насоновой].- М., 1974. - 154 с.
11. Хаитов Р.М. Внутриклеточные сигнальные пути, активирующие или ингибирующие функции клеток иммунной системы. 4. Внутриклеточные сигнальные пути при апоптозе / Р.М. Хаитов, В.М. Манько, А.А. Ярилин //Успехи современной биологии. -2006. - Т. 126. - № 1. - С. 3-9.
12. Чекман И.С. Справочник по клинической фармакологии и фармакотерапии /И.С. Чекман, О.А. Пелещук, О.А. Пятак и др. / [дод ред. И.С. Чекмана, А.П. Пелещука, О.А. П'ятака]. - К.: Здоров'я, 1986. - 736 с.
13. Kay J.E. Mechanisms of T lymphocyte activation / J.E. Kay //Immunol. Lett.- 1991.- Vol. 29 (1-2). - C.51-54.
14. Cahalan M.D., Wulff H., Chandy K.G. Molecular properties and physiological roles of ion channels in the immune system. / M.D. Cahalan, H. Wulff, K.G. Chandy //J. Clin. Immunol. - 2001.- Vol. 21, № 4.- P. 235-252.
15. Evans S.S. Dynamic association of L-selectin with the lymphocyte cytoskeletal matrix / S.S. Evans, D.M. Schleider, L.A. Bowman et al. //J. Immunol.- 1999.- Vol. 162.- P. 3615-3624.
16. Kuno M., Gardner Ph. Ion cannels activated by inositol 1,4,5-triphosphate in plasma membrane of human T-lymphocytes / M. Kuno, Ph. Gardner //Nature. - 1987. - Vol. 326 (6110). - P. 301-304.
17. Lewis R.S. Calcium signaling mechanisms in T lymphocytes / R.S. Lewis //Annu. Rev. Immunol. - 2001. - Vol. 19. - P. 497-521.
18. Nishimoto Y. Protein synthesis dependent and independent apop- 20. Quintana A. Calcium-dependent activation of T-lymphocytes / A. tosis of murine splenic T cells / Y. Nishimoto, Y. Onishi, Y. Sato, H. Quintana, D. Griesemer, E.C. Schwarz, M. Hoth //Pflugers Arch. -Kizaki //Bull. Tokyo dent. Coll.- 1997.- Vol. 38 (2). - P. 133-138. 2005.- Vol. 450 (1). - P. 1-12
19. Pasini F.L. Adenosine inhibits polymorphonuclear leukocyte in vitro 21. Sedwick C.E. TCR, LFA-1 and CD28 play unique and complemen-activation: a possible role as an endogenous calcium entry blocker / tary roles in signaling T cell cytoskeletal reorganization / C.E. Sed-F.L. Pasini, P.L. Capecchi, A. Orrico et al. //J. Immunopharmacol.- wick, M.M. Morgan, L. Jusino et al. // J. Immunol.- 1999.- Vol. 162.1985.- Vol. 7 (2).- P. 203-215. P. 1367-1375.
Реферат
РОЛЬ КАЛЬЦИЙЗАВИСИМЫХ МЕХАНИЗМОВ В РЕГУЛЯЦИИ ЭКСПРЕССИИ ПОВЕРХНОСТНЫХ МЕМБРАННЫХ РЕЦЕПТОРОВ ЛИМФОЦИТОВ Веснина Л.Э.
Ключевые слова: кальцийзависимые механизмы, лимфоциты, рецепторы, экспрессия.
Проведено изучение роли кальцийзависимых механизмов в регуляции экспрессии поверхностных мембранных иммуноглобулинов A, M, G и антигенных детерминант лимфоцитов CD3, CD4, CD8, CD23, CD72, HLA-DR и их перегруппировок в плоскости мембраны с помощью реакции прямой и непрямой иммунофлюоресценции. Показано, что независимо от механизма подавления поступления кальция в клетку - блокады мембранных каналов с помощью верапамила и фенигидина, связывания вне- и внутриклеточного кальция ЭДТА и ВАРТА соответственно, происходят однонаправленные изменения, характеризующиеся снижением экспрессии и подвижности в плоскости мембраны поверхностных иммуноглобулиновых рецепторов и антигенных детерминант лимфоцитов. Сделан вывод, что сохранение физиологической концентрации кальция во внеклеточном пространстве и нормальное функционирование транспортных систем для ионов являются существенными для более отдаленных по времени этапов формирования группировок рецепторов в виде преимущественно пэтчей и кэпов, а поддержание внутрицитозольной концентрации кальция - для формирования начальных группировок - мембранных кластеров. Результаты работы свидетельствуют, что на начальных этапах активации иммунокомпетентных клеток поддержка кальциевого гомеостаза обеспечивает полноценную экспрессию поверхностных мембранных рецепторов и адекватную перегруппировку в плоскости мембраны и тем самым поддерживает высокий уровень функциональной активности лимфоцитов.
Summary
THE ROLE OF CALCIUM-DEPENDENT MECHANISMS IN THE REGULATION OF SURFACE MEMBRANE RECEPTORS EXPRESSION OF LYMPHOCYTES Vesnina L.E.
Keywords: calcium-dependent mechanisms, lymphocytes, receptors, expression
The role of calcium-dependent mechanisms in the regulation of surface membrane immunoglobulin A, M, G expression and antigenic determinants of lymphocytes CD3, CD4, CD8, CD23, CD72, HLA-DR and theirs rearrangements on the membrane surface by the direct and indirect immunofluorescence reactions were studied. It was shown that irrespective of the suppression mechanism of calcium flux into the cell - the blockade of membrane channels by verapamil and fenigidin, binding of out- and intracellular calcium by EDTA and BAPTA, respectively, unidirectional changes were observed characterized by reduced expression and mobility of the immunoglobulin receptors and antigenic determinants on the membrane surface of lymphocytes. It was concluded that the maintenance of the physiological calcium concentration in the extracellular space and normal functioning of the ion transport systems were essential for more remote stages of the receptor groups forming mainly in the form of the patches and caps, while maintenance of the intracellular calcium concentration was significant for forming the initial groups - the membrane clusters. The results of the research indicated that at the initial stage of the immune cells activation the maintanance of calcium homeostasis provided a complete expression of the surface membrane receptors and adequate regrouping on the membrane, thereby maintaining a high level of the functional activity of lymphocytes.
