CC BY
75
Детская андрология и эндокринология
Л.Б. Меновщикова1, 2, А.И. Захаров2, Ю.В. Петрухина1, 2, Н.О. Ерохина1, Э.С. Севергина3
1 ФГБОУ ВО «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова» Минздрава России, Москва
2 ГБУЗ «Детская городская клиническая больница № 13 им. Н.Ф. Филатова» Департамента здравоохранения г. Москвы
3 ФГБОУ ВО «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова» Минздрава России
Безопасно ли применение гормональной терапии при односторонних формах крипторхизма? Экспериментальная оценка влияния хорионического гонадотропина на здоровые гонады крысы
Статья описывает результаты экспериментальной работы, проведенной на 50 самцах крыс, обосновывающие безопасность применения гормональной терапии для здорового яичка при односторонних формах крипторхизма.
Ключевые слова: крипторхизм, гормональная терапия, человеческий хорионический гонадотропин, крысы, экспериментальная работа
Репродуктив. здоровье детей и подростков. 2016. № 6. С. 43-52.
Статья поступила в редакцию: 01.10.2016. Принята в печать: 18.11.2016.
Для корреспонденции
Меновщикова Людмила Борисовна -доктор медицинских наук, профессор кафедры детской хирургии педиатрического факультета ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова» Минздрава России
Адрес: 123001, г. Москва, ул. Садовая-Кудринская, д. 15 Телефон: (916) 685-89-46 E-mail: snik2011@mail.ru
L.B. Menovschikova1, 2, A.I. Zakharov2, Yu.V. Petrukhina1, 2, N.O. Erokhina1,2, E.S. Severgina3
1 Pirogov Russian National Research Medical University, Moscow
2 Filatov Pediatric State Clinical Hospital, Moscow
3 I.M. Sechenov First Moscow State Medical University
Is it safe to use hormonal therapy in unilateral forms of cryptorchidism? Experimental evaluation of human chorionic gonadotropin influence on the rats gonads
The article presents the results of the experimental study on 50 male rats. The results testify the safety of the hormone therapy for healthy testis in patients with unilateral cryptorchidism.
Keywords: cryptorchidism, hormonal therapy, human chorionic gonadotropin, rats, experimental study
Pediatric and Adolescent Reproductive Health. 2016; Vol. 6: 43-52.
Received: 01.10.2016. Accepted: 18.11.2016.
Вот уже много лет вопрос актуальности и безопасности применения гормональной терапии при лечении крипторхизма остается нерешенным и вызывает горячие споры среди как отечественных, так и зарубежных ученых, а учитывая высокую частоту, и большую вероятность возникновения тяжелых последствий. Сама проблема лечения крип-торхизма также не теряет своей актуальности. По данным разных авторов, бесплодие развивается в 30-50% случаев при двустороннем крипторхизме и в 11-25% случаев при одностороннем, кроме того, встречается тестикулярная неоплазия (крипторхированное яичко подвергается неоплазии в 5-10 раз чаще, чем мошоночное): и высок риск малигнизации [1, 2]. Одним из звеньев патогенеза возникновения крипторхизма является гормональная составляющая. В антенатальном периоде высокая локальная доза тестестерона стимулирует развитие гонады по мужскому типу и опущение ее в мошонку. Выработку тестестерона в свою очередь обусловливает воздействие хорионического гонадо-тропина на клетки Лейдига [1]. Этот меха-
низм лег в основу этиопатогенетического обоснования применения гормональной терапии в лечении данного заболевания, как стимулятора выработки тестостерона. Применение хорионического гонадотропи-на (ХГЧ) во внеутробном периоде приводит к увеличению яичка, у части детей положение крипторхированного яичка становится ниже, а у некоторых оно опускается в мошонку. Кроме того, улучшается кровоснабжение органа, что позволяет провести оперативное вмешательство в более выгодных условиях с точки зрения кровотока [1-5]. Но эффективность, а главное, безопасность применения гормональной терапии поставлены под сомнение: существует мнение об отрицательных эффектах этого метода лечения вследствие увеличения числа апоптотических клеток в яичке, что отрицательно влияет на яички, особенно на здоровое яичко при односторонних формах [6-10]. Наша работа была направлена на изучение данного явления. Цель - оценить результаты воздействия хорионического гонадотропина человека на здоровые гонады неполовозрелой крысы в эксперименте.
№ 1 контроль > < < 1 < Ч . . № 2 № 3 № 4 № 5 ХГЧ ХГЧ ХГЧ физраствор
В течение 14 дней (возраст с 4 до 6 нед)
Удаление гонады 1 ХГЧ подкожно ежедневно 0,2 мл Суммарная доза 85 ЕД подкожно ежедневно
На следующий день после окончания инъекций (возраст 6 нед)
Удаление гонады
Удаление гонады 3 самцам
Рис. 1. Схема эксперимента
Материал и методы
В эксперимент вошло 50 самцов крыс линии М^аг, в возрасте 4 нед, массой 80100 г, которые были разделены на 5 групп по 10 особей в каждой. Крысам 1-й группы (группа сравнения) проводилась односторонняя фуникулорхэктомия с фиксацией материала в 10% растворе формалина в возрасте 4 нед (3 самца), 6 нед (3 самца), 8 нед (4 самца) с целью изучения нормального морфологического строения здоровых гонад самцов крыс в различных возрастах, соответствующих этапам эксперимента. Крысам 2, 3, 4-й групп (опытные группы) проводились подкожные инъекции хорионического гонадотропина по 5 ЕД в сутки в течение 10 дней и еще 5 дней по 7 ЕД в сутки (с поправкой на увеличение массы крысы в процессе эксперимента). Необходимое количество препарата вводилось разведенным в 0,2 мл физиологического раствора. Крысам 5-й группы (контрольной) в течение того же периода проводились ежедневные подкожные инъекции физиологического раствора в дозе 0,2 мл. Сразу по окончании курса инъекций выполнялась односторонняя фуникулорхэктомия крысам 2-й опытной группы и 3 крысам из группы контроля, затем через 14 дней то же оперативное вмешательство проведено крысам 3-й опытной группы и 3 крысам из контрольной группы. Все материалы фиксировались в 10% растворе формалина, в последующем проводилось гистологическое исследование забранного материала. Одномоментно всем оперируемым крысам производился забор крови для определения уровня сывороточного тестостерона. Крысам 4-й группы фуникулорхэктомия не проводилась (эта группа введена для контроля размножения, в случае, если внешний дефект оперированного самца отрицательно повлияет на результат подсадки). После окончания основного этапа производилась подсадка к испытуемым особям по 2 самки к каждому. Схема эксперимента представлена на рис. 1.
Морфологические исследования проводились при использовании окраски гематоксилином и эозином, морфометри-ческие - диаметр канальца и площадь поперечного сечения канальца при увеличении 16x10 в у.е. в 10 полях зрения, которые затем переводились в мкм2 и мм2.
Результаты Морфология гонад. При изучении нормального морфологического строения гонад с целью удобства интерпретации последующих данных все канальцы были распределены на 3 типа, соответствующих стадиям сперматогенеза, в зависимости от преимущества тех или иных генераций клеток (рис. 2). Не исключено, что на разных участках одного извитого канальца происходят разные стадии сперматогенеза, поэтому данное деление условное, на плоскости по срезу канальцаю. Первый тип - стадия размножения. Здесь на ба-зальной мембране лежат сперматогонии, затем несколько слоев крупных клеток (крупные сперматогонии и сперматоциты 1-го порядка), и только в некоторых канальцах редко - слой сперматид. Единичные сперматоциты 1-го порядка и спермати-ды упакованы в клетки Сертоли. Просвет канальца, как правило, широкий. Второй тип, соответствующий стадии созревания, характеризовался крупными клетками, лежащими на базальной мембране -сперматоциты 1-го порядка, затем несколько рядов сперматоцитов 2-го порядка и сперматиды, упакованные в клетки Сер-толи. Третий тип - соответствует стадии формирования. Вдоль мембраны расположены сперматогонии, клетки небольшого диаметра с темноокрашенной цитоплазмой и крупным ядром. Второй ряд - крупные темные округлые клетки с крупным более светлым ядром (сперматоциты 1-го порядка). Следующие слои светлые клетки неправильной формы, более мелкие (сперматоциты 2-го порядка, сперма-тиды), ближе к просвету они упакованы в отростки клеток Сертоли. В просвете
Контроль № 1
Семенные нити
Сперматоциты 2-го порядка и сперматиды
Сперматоциты 1-го порядка
Сперматогонии
Клетки Лейдига
I тип (размножения) Рис. 2. Морфологическая картина гонад в норме
ХГЧ № 2
Извилистость канальца
Отсутствие просвета
Семенные нити лежат беспорядочно
Выброс клеток в просвет
Интерстиций расширен
Интерстиций
I тип (размножения) Интерстиций
Рис. 3. Морфологическая картина гонад, удаленных сразу после окончания инъекций
канальцев расположены семенные нити с присутствием сперматозоидов. В интер-стиции в рыхлой соединительной ткани расположено около сосудов несколько клеток Лейдига, они округлой или многоугольной формы с вакуолями в цитоплазме. Вдоль базальной мембраны миоид-ные клетки, ответственные за сокращения канальцев. Среди изложенных вариантов у интактных животных превалировали канальцы в стадии формирования. Встречалось небольшое число канальцев с нарушениями расположения клеток пос-тадийной принадлежности, центр единичных канальцев заполнен беспорядочным расположением клеток различной степени зрелости, что является свидетельством деструктивных изменений.
Морфологическая картина гонад, удаленных непосредственно после окончания гормональной терапии, характеризуется протеканием процессов деструктуризации канальцевого эпителия, проявляющихся в беспорядочном расположении сперм-тоцитов 2-го порядка и сперматид, де-структурированных отростках клеток Сертоли, беспорядочной упаковкой се-
менных нитей. Отмечено значительное число канальцев 1-го типа, соответствующего стадии размножения и роста, что можно рассматривать как потенциальную возможность развития процесса компенсации за счет увеличения базового количества сперматоцитов 1-го порядка (рис. 3).
В гонадах, удаленных через 14 дней после окончания курса инъекций, отмечаются признаки регенеративных процессов сперматогенеза. Интенсивно протекающие фазы сперматогенеза, стимуляция степени зрелости всех генераций клеток сопряжены с развитием деструктивных изменений в части клеточных структур, которые характеризуются беспорядочным расположением сперматоцитов 2-го порядка и сперматид, упакованных в конгломерат отростков клетки Сертоли, и выселением сперматоцитов 1-го порядка в просвет канальца, беспорядочными семенными нитями. Присутствуют канальцы, «нафаршированные» клетками всех типов с отсутствием просвета. Процесс деструктивных изменений в меньшей степени затрагивает клетки,
ХГЧ № 3
Выброс клеток всех типов Отсутствие просвета
Выброс клеток всех типов
Рис. 4. Морофологическая картина гонад, удаленных через 14 дней после окончания 1-го курса инъекций
ХГЧ № 3
II тип (роста и созревания) II тип (роста и созревания)
Конгломерат отростков
III тип (формирования)
Рис. 5. Морофологическая картина гонад, удаленных через 14 дней после окончания 2-го курса инъекций
Физиологический раствор № 5
I тип (размножения)
Рис. 6. Морофологическая картина гонад крыс, получавших физиологический раствор 48 Репродуктивное здоровье детей и подростков / 2016, №6
- 3-5 нед - 9 нед
Рис. 7. Полученный уровень тестостерона у крыс, получавших хорионический гонадотропин
лежащие ближе к базальной мембране, которые сохраняют более или менее нормальное строение, что может в дальнейшем дать возможность обеспечить в полной мере процесс сперматогенеза (рис. 4, 5).
В гонадах крыс, получавших физиологический раствор, также отмечены изменения: имеет место присутствие всех 3 типов канальцев, однако можно отметить некоторое преимущество канальцев 3-го типа. Имеют место и признаки деструкции, которые обнаруживаются в сперматоцитах 2-го типа и сперма-тидах, беспорядочно лежащих в отдельных структурах клеток Сертоли. Просвет заполнен семенными нитями, иногда беспорядочно расположенными в просвете единичными сперматозоидами, иногда определяются в просвете семенные шары (рис. 6).
Тестостерон. При исследовании сывороточного уровня тестостерона в группе контроля у крыс не было обнаружено четкой зависимости его количественных показателей ни от возраста, ни от массы. Отмечено, что с возрастом увеличивается неабсолютное значение уровня тестостерона, а диапазон значений: 0,692,93 нмоль/л в возрасте 8 нед (масса крыс 80-155 г) и 0,69-13,1 нмоль/л в воз-
расте 12 нед (масса 205-379 г) (рис. 7). Диапазон значений уровня тестостерона в крови крыс, получавших ХГЧ, шире, чем в группах физиологического раствора и контроля: 0,69-8,56 нмоль/л против 0,69-5,79 и 0,69-4,68 нмоль/л соответственно (возраст 6 нед) (рис. 8).
Размножение. Потомство было получено от 12 из 15 самцов групп ХГЧ (80%), в группе физиологического раствора от 4 из 7 (42,86%). Результаты размножения не зависели от факта отсутствия одного из яичек у самца.
Обсуждение
Морфология. Серийное введение ХГЧ крысам стимулирует все стадии сперматогенеза. Ближайшие результаты после окончания курса инъекций говорят о де-структурирующем влиянии на канальцы, наряду с интенсификацией процессов сперматогенеза, который, однако, остается незавершенным. Процессы регенерации, отмеченные в биоптатах крыс, оперированных в отдаленные сроки после окончания гормонального воздействия, свидетельствуют о конвертируемости данных процессов, что опровергает теорию о наличии необратимого отрицательного влияния гормональной терапии на здоровые гонады. Наличие сходных процессов
Масса крысы, г
-ХГЧ №2 -ХГЧ №3
Рис. 8. Полученный уровень тестостерона у крыс, получавших хорионический гонадотропин
18
16
"§14
¡12
=-10 о
р8 е
т
и с^
о 6
т с
ш 4 2 0
2 3 4 5 6 7 - Крыса 1 -Крыса 2
Дни
Рис. 9. Суточные колебания уровня тестостерона у крыс по данным литературы
деструктуризации в гонадах крыс, получавших физиологический раствор, может свидетельствовать о наличии не только непосредственного влияния ХГЧ на гонады, но и о значимости стрессового фактора в развитии данных процессов, что также уменьшает гипертрофированность отрицательного влияния гормонов.
Тестостерон. Отсутствие достоверной связи между уровнем тестостерона в сыворотке крыс различных возраста, массы
и степени воздействия может быть связано с тем, что, по данным литературы [4], уровень тестостерона в крови у крыс циклично изменяется в течение нескольких дней с максимумом в середине цикла, также значения колеблются и в течение дня, при этом разница может достигать нескольких раз (рис. 9).
Необходимы дополнительные исследования в этой области: суточное монито-рирование уровня тестостерона в норме и при воздействии хорионического го-надотропина.
Размножение. Объем исследования не позволяет говорить о достоверности. Однако потомство, полученное во всех группах, получавших ХГЧ, свидетельствует о сохранности фертильности крыс после гормональной терапии.
Выводы
• Хорионический гонадотропин вызывает интенсификацию процесса сперматогенеза, однако процесс этот остается незавершенным.
• Происходит локальная деструктуризация отдельных канальцев, что, с одной стороны, носит стрессовый характер, так как подобные явления наблюдаются в группе
с использованием физиологического раствора, а с другой стороны, является обратимой за счет процесса репарации.
• Не установлена достоверная связь • уровня тестостерона и воздействия
гормональной терапии, необходимы дополнительные исследования в этой области.
Фертильность крыс после курса хорио-нического гонадотропина сохранена.
Сведения об авторах
Меновщикова Людмила Борисовна - доктор медицинских наук, профессор кафедры детской хирургии педиатрического факультета ФГБОУ ВО «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова» Минздрава России, сотрудник нефроурологического центра ГБУЗ «Детская городская клиническая больница № 13 им. Н.Ф. Филатова» Департамента здравоохранения г. Москвы E-mail: snik2011@mail.ru
Захаров Андрей Игоревич - кандидат медицинских наук, заведующий отделением урологии ГБУЗ «Детская городская клиническая больница № 13 им. Н.Ф. Филатова» Департамента здравоохранения г. Москвы E-mail: pedurology@yandex.ru
Петрухина Юлия Владимировна - кандидат медицинских наук, ассистент кафедры детской хирургии педиатрического факультета ФГБОУ ВО «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Минздрава России, сотрудник нефро-урологического центра ГБУЗ «Детская городская клиническая больница № 13 им. Н.Ф. Филатова» Департамента здравоохранения г. Москвы E-mail: petrukhina-j@mail.ru
Ерохина Надежда Олеговна - аспирант кафедры детской хирургии педиатрического факультета ФГБОУ ВО «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Минздрава России (Москва) E-mail: nadegdaerokhina@yandex.ru
Севергина Эльвира Серафимовна - доктор медицинских наук, профессор кафедры патологической анатомии ФГБОУ ВО «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова» Минздрава России
Литература
1. Ерохин А.П. Воложин С.И. Крипторхизм. М. : Медицина, 1995. 344 с.
2. Латышев О.Ю., Самсонова Л.Н., Макаров К.К., Окулов А.Б., Касаткина Э.П. Крипторхизм: этиология и патогенез, современные представления о механизме опускания гонад // Андрология и генитал. хир. 2008. № 2. С. 21-26.
3. Рачков Е.Б., Сибилева В.Н., Журавский О.И., Марков Н.В., Ширяев Н.Д. Вариант комбинированного лечения крипторхизма // Дет. хир. 1998. № 2. С. 36-38.
4. Friedman R.M., Lоpez F.J., Tucker J.A., King L.R., Negro-Vilar A. Fertility after cryptorchidism: a comparative analysis of early
orchidopexy with and without concomitant hormonal therapy in the young male rat // J. Urol. 1994. Vol. 151 (1). P. 227-233.
5. Matthews L.A., Abdul-Karim F.W., Elder J.S. Effect of preoperative human chorionic gonadotropin on intra-abdominal rat testes undergoing standard and Fowler-Stephens orchiopexy // J. Urol. 1997; Vol. 157 (6). P. 2315-2317.
6. Karaman I.M., Kaya C., Ozturk M., Pirincci N., Yimazgum-rukcu G., Tuken M. The effects of human chorionic gonado-trophin on normal testicular tissue of rats: dose-dependence and reversibility // BJU Int. 2006. Vol. 97 (5). P. 11161118.
7. Kaya C., Karaman M.I., Pirincci N., Ozturk M., Yilmazgumrukcu G. Human chorionic gonadotropin deteriorates the histology of rat testes // Urol. Int. 2006. Vol. 76 (3). P. 274-277.
8. Ritzen EM. Undescended testes: a consensus on management // Eur. J. Endocrinol. 2008. Vol. 159, Suppl 1. P. S87-S90.
9. Yuan J.L., Zhang Y.T., Wang Y. Increased apopto-sis of spermatogenic cells in cryptorchidism rat model
and its correlation with transforming growth factor beta type II receptor // Urology. 2010. Vol. 75 (4). P. 992998.
10. Zivkovic D., Bica D.G., Hadziselimovic F. Effects of hormonal treatment on the contralateral descended testis in unilateral cryptorchidism // J. Pediatr. Urol. 2006. Vol. 2 (5). P. 468472.
References
1. Yerokhin A.P., Volozhin S.I. Cryptorchidism. Moscow: Medit-sina, 1995: 344 p. (in Russian)
2. Latyshev O.Yu., Samsonova L.N., Makarov K.K., Okulov A.B., Kasatkina E.P. Cryptorchidism: etiology and pathogenesis, current understanding of the mechanism lowering the gonads. Andrologiya i genital'naya khirurgiya [Andrology and Genital Surgery]. 2008; Vol. 2: 21-6. (in Russian)
3. Rachkov Y.B., Sibileva V.N., Zhuravsky O.I., Markov N.V., Shiryaev N.D. Combined treatment of cryptorchidism. Detskaya khirurgiya [Pediatric Surgery]. 1998; Vol. 2: 36-38. (in Russian)
4. Friedman R.M., Lopez F.J., Tucker J.A., King L.R., Negro-Vilar A. Fertility after cryptorchidism: a comparative analysis of early orchidopexy with and without concomitant hormonal therapy in the young male rat. J Urol. 1994№ Vol. 151 (1): 227-33.
5. Matthews L.A., Abdul-Karim F.W., Elder J.S. Effect of preop-erative human chorionic gonadotropin on intra-abdominal rat
testes undergoing standard and Fowler-Stephens orchiopexy. J Urol. 1997; Vol. 157 (6): 2315-7.
6. Karaman I.M., Kaya C., Ozturk M., Pirincci N., Yimazgumrukcu G., Tuken M. The effects of human chorionic gonadotrophin on normal testicular tissue of rats: dose-dependence and reversibility. BJU Int. 2006; Vol. 97 (5): 1116-8.
7. Kaya C., Karaman M.I., Pirincci N., Ozturk M., Yilmazgumrukcu G. Human chorionic gonadotropin deteriorates the histology of rat testes. Urol Int. 2006; Vol. 76 (3): 274-7.
8. Ritzen EM. Undescended testes: a consensus on management. Eur J Endocrinol. 2008; Vol. 159 (Suppl 1): S87-S90.
9. Yuan J.L., Zhang Y.T., Wang Y. Increased apoptosis of sper-matogenic cells in cryptorchidism rat model and its correlation with transforming growth factor beta type II receptor. Urology. 2010; Vol. 75 (4): 992-8.
10. Zivkovic D., Bica D.G., Hadziselimovic F. Effects of hormonal treatment on the contralateral descended testis in unilateral cryptorchidism. J Pediatr Urol. 2006; Vol. 2 (5): 468-72.
