CC BY
109
Оригинальные статьи
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2017 УДК 616.681-007.41-085.357-092.9 МеновщиковаЛ.Б.12, Захаров А.И.2, Петрухина Ю.В.12, Ерохина Н.О.1, Севергина Э.С.3
ГОРМОНАЛЬНАЯ ТЕРАПИЯ ПРИ ОДНОСТОРОННИХ ФОРМАХ КРИПТОРХИЗМА. МОРФОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ДЕЙСТВИЯ ХОРИОНИЧЕСКОГО ГОНАДОТРОПИНА НА ЗДОРОВЫЕ ГОНАДЫ КРЫСЫ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ
1Кафедра детской хирургии ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова», 117997, г. Москва;
2ГБУЗ «Детская городская клиническая больница № 13 им. Н.Ф. Филатова, 103001, г. Москва; 3кафедра патологической анатомии ГБОУ ВПО «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова», 119991, г Москва
В статье приведены результаты экспериментальной работы, целью которой было оценить влияние хорионического гонадотропина человека (ХГЧ) на здоровые гонады неполовозрелой крысы.
Материал и методы. 50 крыс-самцов линии Wistar в возрасте 4 нед, массой 80-100 г были разделены на 5 групп по 10 крыс в каждой. Крысам 1-й группы (сравнения) была проведена односторонняя фуникулорхэктомия для морфологического исследования гонад в разные сроки эксперимента. В течение 14 дней крысам 2, 3 и 4-й групп проводили ежедневные подкожные инъекции ХГЧ по 5 ЕД/сут, крысам 5-й (контрольной) группы - инъекции физиологического раствора по 0,2 мл. После окончания курса инъекций были выполнены односторонняя фуникулоргэктомия крысам 2-й группы на следующий день, а крысам 3-й группы через 14 дней. Крысам 4-й группы фуникулорхэктомия не проводилась. Результаты. При морфологическом исследовании гонад на фоне гормональной терапии выявлены интенсивно протекающие фазы сперматогенеза и деструктуризация в канальцах гонады, характеризующиеся беспорядочным расположением сперматоцитов II порядка и сперматид, упакованных в конгломерат отростков клетки Сертоли, а также беспорядочно упакованных семенными нитями. Наиболее выраженные изменения были обнаружены в гонадах, удаленных в 1-й день после окончания эксперимента, чем в гонадах, удаленных на 14-й день.
Выводы. Введение ХГЧ оказывает стимулирующее влияние на все стадии сперматогенеза, но стадия формирования (переход сперматид в сперматозоиды) оказывается незавершенной. Следует отметить, что влияние на сперматогенез и деструктуризация семенных канальцев носит обратимый характер, о чем свидетельствуют менее выраженные изменения в гонадах, удаленных в более поздние сроки.
Ключевые слова: крипторхизм; гормональная терапия; хорионический гонадотропин человека; крысы; экспериментальное исследование.
Для цитирования: Меновщикова Л.Б., Захаров А.И., Петрухина Ю.В., Ерохина Н.О., Севергина Э.С. Гормональная терапия при односторонних формах крипторхизма. Клинико-морфологический анализ действия хорионического гонадотропина на здоровые гонады крысы в эксперименте. Детская хирургия. 2017; 21(2): 60-63. DOI: htpp//dx.doi.org/10.18821/1560-9510-2017-21-2-60-63
Для корреспонденции: Меновщикова Людмила Борисовна, д.м.н., профессор кафедры детской хирургии педиатрического факультета ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова» Минздрава России, Москва. E-mail: snik2011@mail.ru
Menovshchikova L.B.1'2, Zakharov A.I.2, Petrukhina Yu.V1'2, Erokhina N.O.1, Severgina E.S.3
HORMONAL THERAPY OF UNILATERAL CRYPTORCHIDISM. MORPHOLOGICAL ANALYSIS OF EFFECTS OF CHORIONIC GONADOTROPIN ON RAT GONADS IN EXPERIMENT
1N.I.Pirogov Russian National Research Medical University, 117997, Moscow;
2N.F.Filatov Children's City Hospital,103001, Moscow;
3I.M.Sechenov First State Medical University, 119991, Moscow
The article reports results of experiments designed to evaluate effects of human chorionic gonadotropin (hCG) on healthy gonads of immature rats.
Material and methods. 50 male Wistar rats (4 weeks of age, body weight of80-100 g) were divided into 5 groups of 10 animals each. Those of group 1 underwent unilateral funiculorchectomy for morphological study of gonads. Rats in groups 2-4 were given daily hCG injections (5 U/day) and those of group 5 (controls) 0.2 ml of physiological saline. Rats of groups 2 and 3 were funiculorchectomized on the next day and within 14 days after the termination of injections.
Results. Morphologial studies revealed intense spermatogenesis and destructurization of seminiferous tubules characterized by haphazard localization of order II spermatocytes and spermatids packed in a conglomerate of Sertoli cells and spermatic filaments. The changes were most pronounced in the gonads removed on day 1 after the last injection.
Conclusions. It is concluded that hCG stimulates all stages of spermatogenesis although fails to ensure maturation of spermatids into spermatozoa. Both induced spermatogenesis and destructurization of seminiferous tubules are reversible since the changes become less intense with time.
Keywords: cryptorchidusm; hormonal therapy; human chrionic gonadotropin; rats; experimental studies.
RUSSIAN JOURNAL OF PEDIATRIC SURGERY. 2017; 21(2)
_DOI: htpp://dx.doi.org/10.18821/1560-9510-2017-21-2-60-63
Original article
For citation: Menovshchikova L.B., Zakharov A.I., Petrukhina Yu.V., Erokhina N.O., Severgina E.S. Hormonal therapy of unilateral cryptorchidism. Morphological analysis of effects of chorionic gonadotropin on rat gonads in experiment. Detskya khirurgiya (Russian Journal of Pediatric Surgery) 2017; 21(2): 60-63. (in Russ.). DOI:htpp//dx.doi.org/ 10.18821/1560-9510-2017-21-2-60-63
For correspondence: Menovshchikova Lyudmila Botrisovna, dr. med. sci., prof., Dpt. Pediatric Surgery, N.I.Pirogov Russian National
Research Medical University,117997, Moscow , Russian Federation. E-mail: snik2011@mail.ru
Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
Acknowledgments. The study had no sponsorship.
Received 29 Oktober 2016
Accepted 28 November 2016
Актуальность проблемы крипторхизма обусловлена не только его высокой распространенностью, но и теми осложнениями, которые он вызывает; самое тяжелое и наиболее частое среди них бесплодие (30-50% при двустороннем крипторхизме и 11-25% при одностороннем). Кроме того, встречаются тестикулярная неоплазия (крип-торхированное яичко подвергается неоплазии в 5-10 раз чаще мошоночного) и существует риск малигнизации [1, 2]. На протяжении десятилетий не утихают споры относительно допустимости и актуальности применения гормональной терапии. В основе применения гормональной терапии лежит гипотеза об участии в этиопатогенезе крипторхизма недостаточности хорионического гона-дотропина человека (ХГЧ) как стимулятора выработки тестостерона, что приводит к нарушению нормального процесса опущения яичка. Применение ХГЧ во внеу-тробном периоде приводит к увеличению яичка, у части детей положение крипторхированного яичка становится ниже, а у некоторых оно опускается в мошонку. Кроме того, улучшается кровоснабжение органа, что позволяет провести оперативное вмешательство в более выгодных условиях с точки зрения кровотока [1-5]. Однако в последнее время эффективность гормональной терапии поставлена под сомнение, к тому же существует мнение
06 отрицательных эффектах этого метода лечения вследствие увеличения числа апоптотических клеток в яичке, что отрицательно влияет на яички, особенно на здоровое яичко при односторонних формах [6-10].
Изучение данного эффекта и легло в основу нашей работы, цель которой изучить влияние ХГЧ на здоровые гонады неполовозрелой крысы в эксперименте непосредственно после курса и в отдаленные сроки.
Материал и методы
В эксперимент включено 50 самцов крыс линии Wistar в возрасте 4 нед массой 80-100 г, которые были разделены на 5 групп по 10 особей в каждой. Для морфологического исследования здоровых гонад неполовозрелых самцов проведена односторонняя фуникулорхэктомия крысам 1-й группы (сравнения) с фиксацией материала в 10% растворе формалина. Крысам 2, 3 и 4-й групп (опытные) проводили подкожные инъекции ХГЧ по 5 ЕД/сут в течение 10 дней и еще 5 дней по
7 ЕД/сут. Необходимое количество препарата вводили разведенным в 0,2 мл физиологического раствора. Крысам 5-й группы (контрольной) в течение того же периода проводили ежедневные подкожные инъекции физиологического раствора в дозе 0,2 мл. Сразу после окончании курса инъекций выполняли одностороннюю фуникулорхэктомию крысам 2-й опытной группы и 3 крысам группы контроля, затем через 14 дней то же оперативное вмешательство проводили крысам 3-й опытной группы и 3 крысам контрольной группы. Все материалы фиксировали в 10% растворе формалина, в последующем выполняли гистологическое исследование забранного материала. Одномоментно у всех оперируемых крыс брали кровь для определения уровня сывороточного тестостерона. Крысам 4-й группы фуникулорхэк-томия не проводилась (эта группа введена для контроля размножения в случае, если внешний дефект
оперированного самца отрицательно повлияет на результат подсадки). После окончания основного этапа проводили подсадку к испытуемым особям по 2 самки к каждому. Схема эксперимента представлена на рис. 1.
Морфологические исследования проводили при использовании окраски гематоксилином и эозином, морфометрические -диаметра канальца и площади поперечного сечения канальца при увеличении 16 • 10 в усл. ед. в 10 полях зрения, которые затем переводили в микрометры и миллиметры в квадрате.
Результаты
Морфология гонад. Для удобства интерпретации полученных данных канальцы были распределены по стадиям сперматогенеза в зависимости от преимущества тех или иных генераций клеток. В контроле выделено 3 типа канальцев (рис. 2, см. на вклейке). Iтип - канальцы, находящиеся в стадии размножения. Здесь на базальной мембране лежат сперматогонии, затем несколько слоев крупных клеток (крупные сперматогонии и сперматоци-ты I порядка) и только в некоторых канальцах - редко слой сперматид. Единичные сперматоциты I порядка и сперматиды упакованы в клетки Сертоли. Просвет канальца, как правило, широкий. II тип, соответствующий стадии созревания, характеризовался крупными клетками, лежащими на базальной мембране, - сперматоциты I порядка, затем несколько рядов сперматоцитов II порядка и сперматиды, упакованные в клетки Сертоли. III тип соответствует стадии формирования. Вдоль мембраны расположены сперматогонии, клетки небольшого диаметра с темноокрашенной цитоплазмой и крупным ядром. Второй ряд - крупные темные округлые клетки с крупным более светлым ядром (сперматоциты I порядка). Следующие слои - светлые клетки неправильной формы, более мелкие (сперматоциты II порядка, спермати-ды), ближе к просвету они упакованы в отростки клеток Сертоли. В просвете канальцев расположены семенные
№ 4 № 5
№ 1 № 2 № 3 Физиологический
Контроль ХГЧ ХГЧ ХГЧ раствор
Удаление гонады
течение 14 дней (возраст с 4 до 6
А_
нед)
ХГЧ подкожно ежедневно Суммарная доза 85 ЕД
0,2 мл подкожно ежедневно
На следующий^день после окончания инъекций (возраст 6 нед)
Удаление Удаление гонады а
гонады 3 самцам
Через 2 нед после окончания инъекций (возраст 8 нед)
Удаление Удаление гонады
гонады 3 самцам
_►_:
Подсадка к самкам для размножения
Рис. 1. Схема эксперимента.
В
Оригинальные статьи
3-5 нед
Рис. 7. Уровень тестостерона. Контроль № 1.
9 нед
Масса крысы, г
нити с присутствием сперматозоидов. В интерстиции в рыхлой соединительной ткани около сосудов расположено несколько клеток Лейдига, они округлой или многоугольной формы с вакуолями в цитоплазме. Вдоль ба-зальной мембраны миоидные клетки, ответственные за сокращения канальцев. Среди изложенных вариантов у интактных животных превалировали канальцы в стадии формирования. Встречалось небольшое число канальцев с нарушениями расположения клеток постадийной принадлежности, центр единичных канальцев заполнен беспорядочным расположением клеток различной степени зрелости, что является свидетельством деструктивных изменений.
Морфологическая картина гонад, удаленных непосредственно после окончания гормональной терапии, характеризуется протеканием процессов деструктури-зации канальцевого эпителия, проявляющихся беспорядочным расположением сперматоцитов II порядка и сперматид, деструктурированных отростков клеток Сертоли, беспорядочной упаковкой семенных нитей. Отмечено значительное число канальцев 1-го типа, соответствующего стадии размножения и роста, что можно рассматривать как потенциальную возможность развития процесса компенсации за счет увеличения базового количества сперматоцитов I порядка (рис. 3, см. на вклейке).
В гонадах, удаленных через 14 дней после окончания курса инъекций, обнаружены признаки регенеративных процессов сперматогенеза. Интенсивно протекающие
Рис.
-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1
163 173 179 189 191 195 209 217 250 259 265 282 288 290 335
Масса крысы, г
а - ХГЧ № 2 б - ХГЧ № 3
8. Результаты тестостерона группы ХГЧ.
фазы сперматогенеза, стимуляция степени зрелости всех генераций клеток сопряжены с развитием деструктивных изменений в части клеточных структур, которые характеризуются беспорядочным расположением сперматоцитов II порядка и сперматид, упакованных в конгломерат отростков клетки Сертоли, и выселением сперматоцитов I порядка в просвет канальца, беспорядочными семенными нитями. Присутствуют канальцы, нафаршированные клетками всех типов, с отсутствием просвета. Процесс деструктивных изменений в меньшей степени затрагивает клетки, лежащие ближе к базальной мембране, которые сохраняют более или менее нормальное строение, что может в дальнейшем дать возможность обеспечить в полной мере процесс сперматогенеза (рис. 4, 5, см. на вклейке).
В гонадах крыс, получавших физиологический раствор, также наблюдались изменения: присутствие всех трех типов канальцев, однако можно отметить некоторое преимущество канальцев III типа. Наблюдались и признаки деструкции, которые обнаруживаются в сперматоцитах II типа и сперматидах, беспорядочно лежащих в отдельных структурах клеток Сертоли. Просвет заполнен семенными нитями, иногда беспорядочно расположенными в просвете, присутствуют единичные сперматозоиды, иногда определяются в просвете семенные шары (рис. 6, см. на вклейке).
Тестостерон. При исследовании сывороточного уровня тестостерона в группе контроля у крыс не обнаружено четкой зависимости его количественных показателей ни от возраста, ни от массы тела. Отмечено, что с возрастом увеличивается не абсолютное значение уровня тестостерона, а диапазон значений: 0,69-2,93 в возрасте 8 нед (масса крыс 80-155 г) и 0,69-13,1 в возрасте 12 нед (масса 205-379 г) (рис. 7 Диапазон значений уровня тестостерона в крови крыс, получавших ХГЧ, шире, чем у животных, получавших физиологический раствор, и контрольных: 0,69-8,56 г против 0,69-5,79 и 0,69-4,68 г соответственно (возраст 6 нед) (рис. 8).
Размножение. Потомство было получено от 12 (80%) из 15 самцов групп ХГЧ, в группе получавших физиологический раствор - от 4 (42,86%) из 7. Результаты размножения не зависели от факта отсутствия одного из яичек у самца.
Обсуждение
Морфология. Серийное введение ХГЧ крысам стимулирует все стадии сперматогенеза. Ближайшие результаты после окончания курса инъекций говорят о деструктурирующем влиянии на канальцы наряду с интенсификацией процессов сперматогенеза, который, однако, остается незавершенным. Процессы регенерации, отмеченные в биоптатах крыс, оперированных в отдаленные сроки после окончания гормонального воздействия, свидетельствуют о конвертируемости данных процессов, что опровергает теорию о наличии необратимого отрицательного влияния гормональной терапии на здоровые гонады. Сходные процессы деструктуризации в гонадах
б
а
RUSSIAN JOURNAL OF PEDIATRIC SURGERY. 2017; 21(2)
_DOI: htpp://dx.doi.org/10.18821/1560-9510-2017-21-2-60-63
18 16 14 12 10
А15,3
¡ V
Л9,4 / \
i
4,^7 V»' \
4'5 > з,5 /
' 1,8 2,4 1,8
1 2 3 4 5 6 День
а - Rat # 1 б - Rat # 2
Рис. 9. Уровни тестостерона у крыс.
крыс, получавших физиологический раствор, могут указывать на наличие не только непосредственного влияния ХГЧ на гонады, но и о значимости стрессового фактора в развитии данных процессов, что также уменьшает гипер-трофированность отрицательного влияния гормонов.
Тестостерон. Отсутствие достоверной связи между уровнем тестостерона в сыворотке крыс различного возраста, массы и степени воздействия может быть связано с тем, что, по данным литературы [4], уровень тестостерона в крови у крыс циклично изменяется в течение нескольких дней с максимумом в середине цикла, значения также колеблются в течение дня, при этом разница может достигать нескольких раз (рис. 9).
Необходимы дополнительные исследования в этой области: суточный мониторинг уровня тестостерона в норме и при воздействии ХГЧ.
Размножение. Объем исследования не позволяет говорить о достоверности в этом плане. Однако потомство, полученное во всех группах, получавших ХГЧ, свидетельствует о сохранности фертильности крыс после гормональной терапии.
Выводы
1. После курса ХГЧ в гонадах происходит интенсификация процесса сперматогенеза, но он остается незавершенным.
2. Происходит локальная деструктуризация отдельных канальцев.
3. Процесс деструктуризации может носить стрессовый характер, так как подобные явления наблюдаются в группе, где использовали физиологический раствор.
4. Все процессы носят обратимый характер.
Original article
5. Не установлена достоверная связь уровня тестостерона и воздействия гормональной терапии, необходимы дополнительные исследования в этой области.
6. Фертильность крыс после курса ХГЧ сохранена.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.
ЛИТЕРАТУРА (пп. 4-10 см. в REFERENCES)
1. Ерохин А.П., Воложин С.И. Крипторхизм. М.: Медицина; 1995.
2. Латышев О.Ю., Самсонова Л.Н., Макаров К.К., Окулов А.Б., Касаткина Э.П. Крипторхизм: этиология и патогенез, современные представления о механизме опускания гонад. Андрология и гени-тальная хирургия. 2008; (2): 21-6.
3. Рачков Е.Б., Сибилева Е.Н., Журавский О.И., Марков Н.В., Ширяев Н.Д. Вариант комбинированного лечения крипторхизма. Детская хирургия. 1998; (2): 36-8.
REFERENCES
1. Erokhin A.P., Volozhin S.I. Cryptorchidism [Kriptorkhizm]. Moscow: Meditsina; 1995. (in Russian)
2. Latyshev O.Yu., Latyshev O.Yu., Samsonov L.N., Makarov K.K., Okulov A.B., Kasatkina E.P. Kriptorchidism: etiology and pathogenesis, current understanding of the mechanism of lowering the gonads. Andrologiay i genital'naya khirurgiya. 2008; (2): 21-6. (in Russian)
3. Rachkov E.B., Sibileva E.N., Zhuranskiy O.I., Markov N.B. Option of combined treatment of cryptorchidism. Detskaya khirurgiya. 1998; (2): 36-8.
4. Friedman R.M., López F.J., Tucker J.A., King L.R., Negro-Vilar A. Fertility after cryptorchidism: a comparative analysis of early orchi-dopexy with and without concomitant hormonal therapy in the young male rat. J. Urol. 1994; 151 (1): 227-33.
5. Matthews L.A., Abdul-Karim F.W., Elder J.S. Effect of preoperative human chorionic gonadotropin on intra-abdominal rat testes undergoing standard and Fowler-Stephens orchiopexy. J. Urol. 1997; 157 (6): 2315-7.
6. Karaman I.M., Kaya C., Ozturk M., Pirincci N., Yimazgumrukcu G., Tuken M. The effects of human chorionic gonadotrophin on normal testicular tissue of rats: dose-dependence and reversibility. Br. J. Urol. Int. 2006; 97 (5): 1116-8.
7. Kaya C., Karaman M.I., Pirincci N., Ozturk M., Yilmazgumrukcu G. Human chorionic gonadotropin deteriorates the histology of rat testes. Urol. Int. 2006; 76 (3): 274-7.
8. Ritzén E.M. Undescended testes: a consensus on management. Eur. J. Endocrinol. 2008; 159 (Suppl. 1): S87-90.
9. Yuan J.L., Zhang Y.T., Wang Y. Increased apoptosis of spermato-genic cells in cryptorchidism rat model and its correlation with transforming growth factor beta type II receptor. Urology. 2010; 75 (4): 992-8.
10. Zivkovic D., Bica D.G., Hadziselimovic F. Effects of hormonal treatment on the contralateral descended testis in unilateral cryptorchidism. J. Pediatr. Urol. 2006; 2 (5): 468-72.
Поступила 29 октября 2016 Принята в печать 28 ноября 2016
