CC BY
40
УДК 616.015.348:616-074
А.А. Рунович, Ю.И. Пивоваров, Т.Б. Курильская, Э.Э. Кузнецова, В.Г. Горохова, Л.Б. Корякина
БЕЛКОВО-ПЕПТИДНЫЙ СОСТАВ ОРГАНОТИПИЧЕСКИХ КЛЕТОЧНЫХ СУСПЕНЗИЙ ЧЕЛОВЕКА И ЖИВОТНЫХ РАННИХ ЭТАПОВ ОНТОГЕНЕЗА
НЦ РВХ ВСНЦ СО РАМН (Иркутск)
Работа посвящена изучению белково-пептидного состава органотипических фетальных клеточных суспензий человека (18—20 недели гестации): печень, легкое, сердце и аналогичный клеточный материал кроликов на 1—2 сутки неонатального периода. В пептидных экстрактах идентифицированы группы, ангиотензинов, брадикинина, энкефалинов, окситоцина, соматостатина, бомбезина, эндо-телинов, эндорфинов, субстанции Р, карнозина, аминокислотная, фракция. Кроме того, клеточные суспензии содержали, фибриногеноподобные вещества, ангиотензин—II и. плазминоген.
Ключевые слова: пептиды, хроматография, гемостатические факторы
THE PROTEIN-PEPTIDE STRUCTURE OF ORGANOTYPIC CELLULAR SUSPENSION OF HUMAN AND ANIMAL IN EARLY STAGES OF ONTOGENESIS
A.A. Runovitch, Ju.I. Pivovarov, T.E. Kurilskaja, E.E. Kuznetzov,
V.G. Gorokhova, L.B. Koriakina SC RRS ESSC SB RAMS, Irkutsk
The work is devoted to the study of protein-peptide structure of organotypic feta! cellular suspension, of human (18—20 weeks of gestation): liver, lung, heart and the similar cellular materia! of rabbits in 1—2 days of neonatal period. In peptide extracts the groups of angiotensins, bradykinin, enkephalins, oxytocin, somatostatin, bombesin, endothelins, endorphins, Psubstance, carnosine, aminoacid fraction were identified. Except that, the cellular suspensions contained fibrinogen, like substances, angiotensin—II and plasminogen.
Key words: peptides, chromatography, hemostatic factors________________________________________
Ранее было показано, что трансплантация алло-генного или ксеногенного клеточного материала в виде органотипических суспензионных клеток фе-тусов человека либо клеток органов животных (кроликов) неонатального периода дает выраженный позитивный эффект при атеросклерозе. Снижение интенсивности специфических патологических изменений в результате клеточной трансплантации зафиксировано на моделях гиперхолестеринемии в эксперименте, а также в клинике у больных ИБС, обусловленных стенозирующим атеросклерозом коронарных артерий [8, 11, 13, 14].
Саногенетический механизм клеточной трансплантации объясняется высоким содержанием регионарных стволовых и прогенеторных клеток, свойственных клеточным субстратам на ранних стадиях онтогенеза.
Принято считать, что введенные стволовые клетки дифференцируются в направлении поврежденных патологическим процессом клеточных сообществ, восстанавливая тем самым нор-
мальные морфофункциональные взаимоотношения в соответствующих органах.
Вместе с этим, накапливаются данные, свидетельствующие о том, что введенный клеточный трансплантант не проходит процесс диффе-ренцировки, а лишь активизирует регенеративный потенциал органа реципиента, и что это происходит за счет молекул или группы молекул, присущих трансплантированным стволовым клеткам [21].
Исходя из предположения, что клеточная трансплантация оказывает влияние на эндогенные неспецифические регуляторные процессы организма, нами продолжено изучение регуляторных пептидов и гемостатических факторов клеток органов на ранних стадиях онтогенеза.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
С учетом наиболее часто используемого в клинике и эксперименте материала для коррекции коронарного атеросклероза изучали органотипи-
ческие фетальные клеточные суспензии человека (срок гестации 18 — 20 недель): печень, сердце, легкое и аналогичный клеточный материал кроликов на 1—2 сутки неонатального периода. Для изучения пептидного состава получали супернатанты уксуснокислых суспензий изучаемых образцов, в которых высокомолекулярную фракцию белков осаждали ацетоном, выдерживали на холоде, обрабатывали уксусной кислотой и лио-филизировали [5]. Для компонентной идентификации была использована обращено-фазовая жидкостная хроматография на «Милихроме» в условиях для разделения пептидов [5]. Метод позволил выявить пептиды в диапазоне 1 — 10 нМ [18, 19]. Тонкослойная хроматография на высокоэффективных ионообменных катионитных и анионитных смолах, а также на силикагеле с буферными элюентами дали возможность верифицировать в сложных по составу фракциях аминокислоты и пептиды. Для оценки гемостатическо-го потенциала определяли показатели, характеризующие состояние основных звеньев системы гемостаза: фибриноген [2], активность антитромбина III (АЫП) и плазминоген с применением хромогенного субстрата [1].
Результаты исследования обработаны методом вариационной статистики с применением критерия ^Стьюдента и пакета анализа «^аИБИса 5.0».
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Было установлено, что пептидная фракция исследуемых клеточных субстратов составляет 20 — 50 пг/мл и представляет совокупность групп или
семейств пептидов. В пептидных экстрактах идентифицированы группы ангиотензинов, брадики-нина, энкефалинов, окситоцина, соматостатина, бомбезина, эндотелинов, эндорфинов, субстанции Р, карнозин, аминокислотная фракция. Другие группы пептидов выявить не удалось. Кроме того, клеточные суспензии содержали фибриногеноподобные вещества, АТ — III и плазминоген (табл. 1).
Приведенные в таблице 1 данные показывают, что фетальные и неонатальные клеточные суспензии по качественным характеристикам не отличаются друг от друга. Однако в количественном отношении содержание определяемых компонентов в неонатальных клеточных субстратах было значительно выше, за исключением АТ — Ш.
Дискриминантный анализ показал, что наиболее существенными компонентами, отличающими фетальные и неонатальные клеточные субстраты, являлись соматостатин, ангиотензин, эндорфин и плазминоген (табл. 2). Как известно, соматостатин в сформированном организме обеспечивает ингибиторный контроль гормона роста и ряда других гормонов гипофиза и ферментов желудочно-кишечного тракта. Ангиотензин участвует в регуляции уровня артериального давления, сопряженных процессах почечной фильтрации и водно-солевого обмена [4, 5, 6]. Он содержит Ы-концевой трипептид, который принадлежит к числу так называемых «общих фрагментов», выявленных как общие структурные элементы у ряда пептидных гормонов и кининов. Этот Ы-трипептид в молекуле ангиотензина принимает участие в активации рецепторов и внутриклеточного сигнала [9].
Таблица 1
Содержание белково-пептидных веществ в органотипических фетальных и неонатальных клеточных суспензиях
Показатели (пг/мл) Клеточные суспензии (печень + сердце + легкое) Печень Сердце Легкое
фетал. неонат. фетал. неонат. фетал. неонат. фетал. неонат.
соматостатин 3,8333 13,028* 5,5 13* 2,4 13* 3,6 13,083*
ангиотензин 3,5 10,056* 5 10083* 2,2 10,083* 3,3 10*
энкефалин 4,2389 11* 6,0167 11* 2,667 11* 4,00333 11*
окситоцин 3,5 12,033* 5 12,017* 2,2 12* 3,3 12,083*
бомбезин 4,9056 14,056* 7,0167 14,083* 3,1 14,017* 4,6 14,067*
эндотелины 2,0667 9,3944* 3 8,1167* 1,1667 8,0667* 2,0333 12*
эндорфин 1,4056 5,9* 2,0 5,0667* 0,8833 5,0833* 1,3333 7,55*
субстанция Р 1,7778 7,0333* 2,55 6* 1,1667 6,05* 1,6167 9,05
аминокислот. фракции 2,7722 5,8111* 4 8,8* 1,7167 4,5* 2,6 4,53*
карнозин 0,725 3,0333* 0,9667 3,00333* 0,4417 3* 0,7667 3,0667*
антитромбин, % 27,836 24,5 23,463 28,5* 27,542 28,917* 36,533 28,3
плазминоген, % 5,9489 8,4667* 6,704 7,05* 4,9167 12* 7,2283 7,75
фибриноген, г/л 0,5422 3,3889* 0,51 1,6* 0,46 0,8* 0,4466 1,4167*
Примечание: вероятность отличия фетальных клеточных суспензий от неонатальных - * р < 0,005.
Таблица 2
Основные компоненты, существенно отличающие фетальные и неонатальные клеточные суспензии,
по данным дискриминантного анализа
Клеточные суспензии печень + легкое + сердце Д2 Р Р Компоненты
фетальные неонатальные
- - 42,75 33,1 2Е- 06 соматостатин
- - - 7,87 0,009 ангиотензин
- - - 7,17 0,0012 эндорфин
- - - 4,87 0,035 плазминоген
фет. печень неон.печень 840,9 366 1 Е- 08 фибриноген
- - - 6,85 0,028 эндотелины
фет. сердце неон. сердце 966,8 67 4 гп 0 сл фибриноген
- - - 10,6 0,012 плазминоген
- - - 9,62 0,015 антитромбин III
фет. легкое неон. легкое 69,09 12,5 0,006 соматостатин
- - - 11 0,009 субстанция Р
Примечание: Д~2 - расстояние Махаланобиса.
Эндорфин, как опиоидный пептид, играет важную роль в регуляции фундаментальных процессов жизнедеятельности организма и оказывает антистрессорное действие [17]. Энкефа-лины участвуют в антиболевой реакции, регулируют процессы локомоции, стереотипных поведенческих реакций и иммунную активность [4]. Бомбезин является эффективным терморегулятором [5]. По данным П.К. Климов и Г.М. Барашкова [7], пептиды являются составной частью подвижной управляющей системы, выполняющей контролирующую и моделирующую функции, осуществляя транспорт по крови, лимфе и межклеточным пространствам. Они выступают и как высоко специфические передатчики необходимой информации от клетки к клетке, и как гормоны, и как сообщества молекул, своего рода подвижный код из химически активных соединений. Особенность их сочетания гарантирует при поэтапном или залповом высвобождении комплексную реакцию — ответ множества клеток, тканей или органов по определенному запрограммированному типу. Этим механизмом и достигается срочная адаптация. Пептиды, содержащиеся в исследованных нами тканях, обладают широким спектром биологического действия и регулируют процессы развития и функции многоклеточных систем. Несмотря на многоуровневую иерархию, механизмы пептидной регуляции гомеостаза выполняют единую задачу — координируют процессы биосинтеза в клетках организма путем воздействия на экспрессию генов [16]. Важна роль пептидов и в регуляции процессов старения. Известно, что возрастная инволюция сопровождается снижением синтеза и секреции регуляторных пептидов, а также ослаблением чувствительности к ним клеток-мишеней. Среди
известных пептидов, обладающих геропротек-торными свойствами, наибольшую значимость имеет дипептид карнозин, присутствующий в исследуемых клетках. Его геропротекторное действие связывают преимущественно с анти-оксидантной активностью [3]. При возрастной инволюции эпифиза, тимуса, половых желез и других органов и тканей у млекопитающих наблюдается апоптоз клеток их паренхимы [10]. Доказано, что у человека усиленная индукция апоптоза приводит как к возникновению и развитию тяжелых заболеваний, сопровождающихся массивной дегенерацией клеток (болезнь Альцгеймера и др.), так и преждевременному старению [20]. В работе В.Х. Хавинсон и И.М. -Кветной [15] было установлено, что пептиды также способны регулировать процессы клеточного обновления в различных органах. Возможно, одной из точек приложения этого действия является контроль интенсивности апоп-тоза на присущем определенному типу тканей генетически детерминированном уровне. При стимуляции апоптоза какими-либо факторами (облучение, тяжелые заболевания и т.д.) пептиды выступают в роли ингибиторов гибели клеток. Необходимо отметить, что отличительной особенностью регуляторных пептидов является их способность проявлять свое действие в условиях патологии, не изменяя при этом физиологические показатели [17]. Плазминоген, как один из составляющих белково-пептидного комплекса, и как предшественник плазмина, способствует удалению образовавшегося в сосудистом русле фибрина и поддержанию динамического равновесия крови в физиологических условиях [12]. Дискриминантный анализ выявил, что фетальные клетки печени существенно отличались от сердца по уровню энке-
фалина и соматостатина, а от клеток легкого — по содержанию энкефалина, карнозина, бомбе-зина и ангиотензина и активности антитромбина III (табл. 1, 2). Неонатальные клеточные субстраты печени и сердца различались по таким компонентам как фибриноген, бомбезин, субстанция Р. В белково-пептидном составе печени по сравнению с неонатальными клетками легкого доминировали фибриноген, плазмино-ген и эндорфин, а в сердце в отличие от клеток легкого — плазминоген и субстанция Р.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, проведенное исследование продемонстрировало, что фетальные клеточные субстраты печени, легкого, сердца и аналогичные неонатальные клеточные суспензии содержат широкий спектр регуляторных пептидов и обладают гемостатическим потенциалом. Существенные признаки, отличающие фетальные и неонатальные клеточные суспензии, могут играть важную роль в адаптивных процессах. Наиболее высокое количество компонентов установлено в более морфофункционально зрелых клетках, т.е. неонатальных клеточных субстратах, очевидно, в связи с их высокой потребностью в обеспечении собственных адаптивных реакций. Полученные результаты не дают пока оснований для предпочтительной оценки фетального или неонатального клеточного материала в отношении эффективности клеточной трансплантации. Однако расширяют представления об особенностях клеточных суспензий, составляющие компоненты которых могут явиться пусковым моментом в индукции регенераторного потенциала реципиента.
ЛИТЕРАТУРА
1. Баркаган З.С. Введение в клиническую ге-мостазиологию / З.С. Баркаган, А.П. Момот. — М.: Ньюдиамед — АО», 1999. — 217 с.
2. Балуда В.П. Актуальные проблемы гемоста-зиологии / В.П. Балуда. — М., 1981. — С. 14 — 26.
3. Болдырев А.А. Карнозин. Биологическое значение и возможности применения в медицине / А.А. Болдырев. — М., 1998. — 290 с.
4. Гомазков О.А. Физиологически активные пептиды / О.А. Гомазков. — М.: ИПГМ, 1995. — 114 с.
5. Гомазков О.А. Пептиды в кардиологии / О.А. Гомазков. — М., 2000. — 143 с.
6. Исследование состава белково-пептидного комплекса фетальных тканей человека и ювенильных тканей кролика / В.Г. Горохова, Э.Э. Кузнецова, Г.Г. Горохов, А.А. Рунович и др. // Бюл. эксперт. биол. и мед. — 2004. — № 4. — С. 423-425.
7. Климов П.К. Эндогенные пептиды как единая система регуляторных веществ / П.К. Климов,
Г.М. Барашкова // Физиол. журн. — 1993. — Т. 79, №3. — С. 80 — 83.
8. Курильская Т.Е. Патогенетическое обоснование фетальной терапии в профилактике и комплексном лечении ишемической болезни сердца: Дис. ... д-ра мед. наук / НЦ РВХ ВСНЦ СО РАМН.
— Иркутск, 1999.
9. Мышлякова Н.В. Биологические свойства низкомолекулярных пептидов / Н.В. Мышлякова,
В.Е. Клуша, Г.И. Чипенс // Хим.-фарм. журн. — 1981. — Т. XV, № 1. — С. 10 — 20.
10. Новиков В.С. Программированная клеточная гибель / В.С. Новиков. — СПб., 1996. — 180 с.
11. Репин В.С. Трансплантация клеток: новые реальности в медицине. Трансплантация фетальных тканей и клеток: Сб. науч. статей / В.С. Репин // Под ред. В.И. Кулакова, Г.Т. Сухих // Бюлл. эксперим. биол. и мед. — 1988. — Прил. 1.
— С. 14 — 28.
12. Сидоркина А.Н. Биохимические основы системы гемостаза и диссеминированное внутри-сосудистое свертывания крови / А.Н. Сидоркина,
B.Г. Сидоркин, М.В. Преснякова. — Н. Новгород, 2001. — 92 с.
13. Стрекаловский Д.В. Влияние трансплантации фетальной ткани печени на течение экспериментального атеросклероза: Автореф. дис. . канд. мед. наук. — Иркутск, 1999. — 18 с.
14. Судаков Н.П. Влияние трансплантации ал-логенных неонатальных гепатоцитов на развитие экспериментальной гиперхолестеринемии: Авто-реф. дис. ... канд. мед. наук. — Иркутск, 2004. — 24 с.
15. Хавинсон В.Х. Пептидные биорегуляторы ингибируют апоптоз / В.Х. Хавинсон, И.М. Квет-ной // Бюлл. эксперим. биол. мед. — 2000. — № 12.
— С. 657 — 659.
16. Хавинсон В.Х. Механизмы геропротектор-ного действия пептидов / В.Х. Хавинсон, В.В. Малинин // Бюл. эксперим. биол. мед. — 2002. — Т. 133, № 1. — С. 4 — 9.
17. Чазов Г.И. Перспективы биоорганической химии и молекулярной биологии / Г.И. Чазов. — М., 1986. — С. 116—119.
18. Шваб О.В. Хроматографический анализ пептидов фетальных тканей / О.В. Шваб,
C.В. Тришкин, В.П. Демушкин // Бюл. экспер. биол. мед. — 1998. — Прил. 1. — С. 191 — 193.
19. Шваб О.В. Анализ пептидов из тканей животных и растений / О.В. Шваб, С.В. Тришкин, Е.Н. Шепель // Биоорг. химия. — 1999. — Т. 25, № 1. — С. 20 — 24.
20. The Pertides: analysis, synthesis, biology / Eds. E. Gross, I. Meiengofer. — N.Y., 1981. — 180 p.
21. Hess D. Bone Marrow derived stem cells provide pancreatic regeneration / D. Hess, L. Li,
S. Sakano // Nature Biotechnology. — July 2003. — Vol. 21 (7). — P. 763 — 770.
