CC BY
185. Калинина О.В., Красиков С.И., Шехтман А.М. и др. Гепатопротекторное действие милиа-цина при токсическом поражении печени метотрексатом. Российский биотерапевтический журнал. 2009, 8 (1): 48-54.
6. Кириллова А.В., Скачков М.В., Панфилова Т.В. и др. Стимуляция иммунитета к столбнячному анатоксину милиацином. Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2003, 6: 36-38.
7. Олифсон Л.Е., Осадчая Н.Д., Нузов Б.Г. и др. Химическая природа и биологическая активность милиацина. Вопросы питания. 1991, 2: 57-59.
8. Панфилова Т.В. Штиль А.А., Фролов Б.А. Тритерпеноид милиацин снижает индуцированное стрессом ПОЛ. Бюлл. экспер. биол. и мед. 2006, 141 (6): 633-635.
9. Панфилова Т.В., Штиль А.А., Полосухина Е.Р. и др. Влияние тритерпеноида милиацина на чувствительность лимфоцитов тимуса и селезенки к апоптозу, индуцированному дексаме-тазоном. Бюлл. экспер. биол. и мед. 2003, 136 (10): 382-385.
10. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ «Статистика». М., Медиа Сфера, 2002.
11. Фролов Б.А., Кириллова А.В. Милиацин как мембранопротектор. Защитное действие милиацина при детергент-индуцированной иммуносупрессии. Российский аллергол. журнал. 2011, 4 (1): 402-403.
12. Чайникова И.Н. Инфектологическая характеристика сальмонеллеза. Автореф. дисс. д-ра мед. наук. Оренбург, 2006.
13. Чернов А.Н., Павлова М.Н., Олифсон Л.Е. Средство, стабилизирующее биологические мембраны. АС № 1043860 от 23.05.1983. А61К35/78.
14. Шварц Я.Ш., Свистельник А.В. Функциональные фенотипы макрофагов и концепция М1-М2-поляризации. Провоспалительный фенотип. Биохимия. 2012, 77 (3): 312-329.
15. Kiney-Cain T., Clements J.D., Bost K.L. Endogenous and exogenous interleukin-12 augment the protective immune response in mice orally challenged with Salmonella dublin. Infect. Immunol. 1996, 64: 1444-1447.
16. Lessard M., Hutckings D.L., Spencer J.L. Cell-mediated and humoral immune responses in chickens infected with Salmonella typhimurium. Avian diss. 1995, 39: 230-238.
17. Nick A., Wright A.D., Sticher O., Rali T. Antibacterial triterpenoid aids from Dillenia papuona. J. Nat. Prod. 1994, 52: 1245-1250.
Поступила 12.02.13
Контактная информация: Смолягин Александр Иванович, д.м.н., проф.,
460000, Оренбург, ул. Советская, 6, р.т. (3532)77-71-72
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013
Е.В.Сысолятина1, К.А.Собянин1, А.В.Петряков2, Н.И.Трушкин2, Е.Н.Бекетова3, О.Ю.Арсеенкова3, Т.И.Карпова1, А.Л.Гинцбург1, Ю.С.Акишев2,4, С.А.Ермолаева1
БАКТЕРИЦИДНОЕ ВОЗДЕЙСТВИЕ НИЗКОТЕМПЕРАТУРНОЙ АРГОНОВОЙ ПЛАЗМЫ НА БИОПЛЕНКИ, СФОРМИРОВАННЫЕ IN VITRO И В ЗУБНОМ КАНАЛЕ
1НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи, 2Троицкий институт инновационных и термоядерных исследований, 3Стоматологическая поликлиника № 65, 4Национальный исследовательский ядерный университет «МИФИ», Москва
Цель. Оценка эффективности бактерицидного действия низкотемпературной плазмы (НТП) на биопленки, сформированные in vitro и в зубном канале. Материалы и методы. В работе использован антибиотикоустойчивый изолят Staphylococcus epidermidis, выделенный из очага гнойного пульпита. Биопленки, сформированные S.epidermidis in vitro на поверхности пластика и ex vivo на поверхности стенок зубных каналов, обрабатывали плазменной струей, формируемой смесью аргон:воздух (9:1), подвергнутой электромагнитному воздействию с частотой 100 кГц. Жизнеспособность бактерий определяли высевами на твердые питательные среды и по дифференциальной окраске Live/Dead с помощью флюоресцентной микроскопии. Результаты. Установлена дозозависимая гибель бактерий в биопленках с трехступенчатой кинетикой. Полное уничтожение микроорганизмов, содержащих в образце до 109 КОЕ/мл, было достигнуто при времени экспозиции равном 240 с и более. Заключение. Доказана возможность использования НТП для уничтожения бактерий в биопленках, сформированных в зубных каналах.
Журн. микробиол., 2013, № 6, С. 8—12
Ключевые слова: низкотемпературная плазма, биопленки S.epidermidis, зубные каналы
E.V.Sysolyatina1, K.A.Sobyanin1, A.V.Petryakov2, N.I.Trushkin2, E.N.Beketova3, O.Yu.Arseenkova3, T.I.Karpova1, A.L.Gintsburg1, Yu.S.Akishev2'4, S.A.Ermolaeva1
BACTERICIDAL ACTION OF NON-THERMAL PLASMA ON BIOFILMS FORMED IN VITRO AND WITHIN A ROOT CHANNEL
1Gamaleya Research Institute of Epidemiology and Microbiology, 2Troitsk Institute of Innovative and Thermonuclear Research, 3Stomatological policlinic No. 65, ^National Research Nuclear University, Moscow, Russia
Aim. Evaluation of efficiency of non-thermal plasma as bactericidal agent affecting biofilms formed in vitro and on walls of a root channel. Materials and methods. The multiple antibiotic resistant strain Staphylococcus epidermidis isolated from pulpitis was used. Biofilms formed in vitro on the plastic surface and ex vivo at the walls of the root canal were treated with plasma torch formed by argon:air (9:1) mixture eradiated with 100 kHz electrtomagnetic field. Bacterial viability was determined by plating and by differential Live/Dead labeling. Results. The dose-dependent decrease in living bacteria was demonstrated. The three-step kinetics ofbacterial killing was observed. Total elimination ofup 109 CFU/sample was reached at exposition of240 s or more. Conclusion. The non-thermal plasma effectively destroyed bacterial biofilms within root channels.
Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2013, No. 6, P. 8—12
Key words: non-thermal plasma, biofilms of Staphylococcus epidermidis, root channels ВВЕДЕНИЕ
Плазма — это четвертое состояние вещества, в котором частицы газа находятся в ионизированном состоянии. Плазменные технологии широко используются в различных областях человеческой деятельности, в том числе и в медицине, где в настоящий момент уже внедрены плазменные установки, используемые как плазменные скальпели, инструменты для коагуляции крови, стерилизаторы медицинских инструментов и оборудования [3, 6, 7, 14, 16].
За последние годы была разработана технология получения плазмы с температурой ниже 40°С, которая получила название низкотемпературной плазмы (НТП) [1]. НТП обладает выраженным микробицидным и иммуностимулирующим действием благодаря нетермальным эффектам компонентов плазменного факела [2, 9]. К биологически активным компонентам факела относятся заряженные частицы (ионы), незаряженные активные частицы, такие как радикалы ОН-, NO-, озон и перекись водорода H2O2, ультрафиолетовое излучение и электромагнитное поле [2]. Синергизм компонентов плазменного факела обусловливает выраженный биологический эффект НТП, в то время как абсолютные концентрации каждого из компонентов относительно низкие. Комфортная температура низкотемпературной плазмы позволяет использовать ее для непосредственного терапевтического воздействия на ткани и органы [8].
Преимуществами НТП, лежащими в основе ее медицинских применений, является неспецифическая микробицидная и иммуностимулирующие активность, возможность воздействия на узкие полости, в том числе изогнутые, а также способность плазмы изменять свойства полимерных поверхностей [6, 7, 16]. Например, обработка НТП усиливает адгезионные свойства дентина, показаны усиление эффективности связывания пломбировочного материала при обработке дентина НТП [19], возможность использования НТП для отбеливания эмали [13], высокая бактерицидная активность НТП в отношении основных этиологических агентов кариеса [17].
Перечисленные качества позволяют рассматривать НТП как многообещающий подход в терапии заболеваний зуба и пародонта.
Важным достоинством НТП является ее воздействие на внутрибиопленочные бактерии[8, 16]. Биопленки представляют собой многослойные структуры, включающие микробов и продуцируемый ими матрикс, который состоит преимущественно из экзополисахаридов. Матрикс защищает микроорганизмы от внешних стрессов, в том числе от микробицидных веществ, находящихся в окружающей среде. Биопленки, формируемые на поверхности дентина патогенными и условно патогенными бактериями, играют важнейшую роль в развитии кариеса и периодонтита [3, 5].
Цель работы — оценка эффективности применения специально сконструированного источника НТП для воздействия на биопленки, сформированные в экспериментальных условиях, в том числе в полости зубных каналов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использован выделенный из очага гнойного пульпита изолят S. epidermi-dis Se04, характеризующийся множественной антибиотикорезистентностью (Ampr, Vanr, доксициклинг). Бактерии рутинно культивировали на агаризованной среде ГРМ № 1 (Оболенск) при 37°С.
Биопленки выращивали на поверхности стекла, пластика и на поверхности зубных каналов. Для выращивания биопленок на поверхности стекла ночную культуру, выращенную в бульоне Brain Heart Infusion (BHI, BD, США) при шуттелировании и температуре 37°С, разводили в 10 мл соответствующего стерильного бульона в 100 мл флаконе, во флакон наклонно помещали покровное стекло и культивировали без шуттелирования в течение 24 часов. Стекло с биопленкой, сформировавшейся на границе бульон/воздух, промывали стерильным физиологическим раствором и исследовали с помощью микроскопии. Для количественной оценки бактерицидного эффекта НТП использовали биопленки, выращенные на пластиковой поверхности в плоскодонных 96-луночных планшетах. Для этого 100 мкл ночной культуры вносили в лунку планшета и инкубировали в термостате при 37°C в течение 24 ч без покачивания. Перед обработкой НТП из лунок удаляли излишек культуральной жидкости таким образом, чтобы на дне оставалась только биопленка. Для выращивания биопленок на поверхности зубных каналов были взяты 5 зубов (моляры и премоляры) с удаленной пульпой, распиленных по продольной оси на 2 равные половины. Для дальнейшей работы половинки каждого зуба были соединены при помощи эластичной пленки Parafilm. В образовавшуюся полость вносили ночную культуру клеток S. epidermidis, содержащую 109 КОЕ/мл, после чего полость герметично закрывали пленкой. Инкубацию проводили в термостате в течение 24 ч при 37°C без шуттелиро-вания.
В работе был использован источник низкотемпературной плазмы атмосферного давления. Газовой смесью является аргон + воздух в соотношении 9:1. Диаметр плазменной струи не более 1 мм, длина струи — до 2 см, скорость газовой струи 5 — 10 м/с, расход газа 5 — 10 см3/с. Частота синусоидального напряжения 10 — 100 кГц.
Перед обработкой НТП из лунок удаляли излишек культуральной жидкости таким образом, чтобы на дне оставалась только биопленка. Обработку проводили источником НТП на расстоянии 10 мм от обрабатываемой поверхности в течение 30, 60, 90, 120 и 300 с. По окончании облучения в лунку вносили 100 мкл стерильного PBS и смывали биопленку пипетированием, после чего делали серию 10-кратных разведений с высевами на плотную питательную среду (ГРМ-1, Оболенск). В качестве контроля использовали необлученные образцы, находившиеся в сходных условиях (без культуральной жидкости). Инкубацию проводили при 37°С, учет результатов проводили через 18 ч. Для качественной оценки эффекта НТП биопленки окрашивали дифференциальным красителем Live/Dead (Invitrogen). Окрашенные биопленки изучали с помощью флюоресцентного микроскопа. Перед проведением эксперимента полость
зуба освобождали от жидкости, одну половину без обработки использовали в качестве контроля, другую прикрепляли вертикально к поверхности стерильного стекла и подвергали воздействию НТП в течение 1, 2, 3, 4, 5 мин. После этого каждую половинку помещали в 1 мл стерильного PBS и соскабливали сформированные на внутренней поверхности полости зуба биопленки стерильным медицинским инструментом в течение 1 мин для каждого образца. Полученная суспензия подвергалась 10-кратным разведениям с последующими высевами на твердую питательную среду. Инкубацию проводили при 37°С, учет результатов — через 18 ч.
РЕЗУЛ ЬТАТЫ
В опытах с биопленками S. epidermidis, выращенными в лунках 96-луночного планшета и подвергнутых воздействию НТП в течение 30 — 300 с, было установлено, что облучение в течение первых 60 с приводило к снижению числа КОЕ на 25%. Увеличение экспозиции приводило к более быстрому снижению количества выживших бактерий: 90-секундное облучение уничтожало до 97±3% живых бактерий из 109 КОЕ. Для подтверждения того, что в результате облучения НТП бактерии погибали, а не переходили в некультивируемое состояние, биопленки, облученные в течение 5 мин, были окрашены красителем Live/Dead, позволяющим дифференцировать живые и мертвые бактерии: живые клетки окрашиваются зеленым, мертвые — красным. Облученные бактерии окрашивались красным, что свидетельствует о гибели бактериальных клеток.
Нашей следующей задачей было изучение эффекта НТП на биопленки, выращенные на стенках зубного канала. Разрезанный и скрепленный зуб с биопленками разнимали на половины и обрабатывали одну половину плазмой, как описано выше. Для каждой временной точки использовали отдельный зуб, которые менялись в повторах в произвольном порядке. Как и в случае модельных биопленок, обработка в течение 60 с приводила только к 50% снижению количества живых бактерий, но уже 180-се-кундная обработка приводила к 94% снижению числа КОЕ, а обработка в течение 240 с к полному устранению живых бактерий из биопленок, сформировавшихся на поверхности зубного канала (рис.).
ОБСУЖДЕНИЕ
В результате 4-минутного воздействия НТП были полностью элиминированы жизнеспособные бактерии S. epidermidis, растущие в составе биопленок на поверхности пластика и на стенках зубных каналов.
Количественное определение снижения численности живых бактерий в биопленках в зависимости от времени экспозиции демонстрирует трехфазную кинетику: относительно медленное снижение числа выживших бактерий сменяется быстрым
снижением, после чего скорость изменения числа выживших бактерий замедляется и затем ускоряется вновь. Ранее в исследованиях чувствительности одиночных бактериальных клеток, расположенных на агаре, было показано, что снижение числа выживших бактерий описывается двухфазной кривой: первоначальное быстрое снижение числа бактерий замедляется, а затем опять наблюдается быстрое снижение числа жизнеспособных бактерий [11, 12]. Для бактерий в биопленках наблюдались как двухфазная, так и трехфазная кривые гибели [10, 15, 18]. Двухфазная кривая гибели на-
№ Не
Динамика гибели бактерий в биопленках, сформированных на поверхности зубного канала, после обработки НТП.
Показаны средние значения и стандартное отклонение по результатам трех экспериментов.
блюдается с источниками НТП, сопровождающими формирование плазмы испусканием ультрафиолетового излучения и/или электромагнитным излучением [10, 18]. В нашем случае ультрафиолетовая радиация была сведена к минимуму благодаря специальной конструкции прибора. Используемая частота электромагнитного поля не создает биологически опасного электромагнитного излучения, характерного для микроволнового излучения с частотой более 1 ГГц. Электрическая мощность разряда чрезвычайно мала: 0,1 — 0,4 Вт, поэтому температура газа в зоне обработки не более 40°C, а также отсутствует УФ-излучение и озон. Дополнительная медленная фаза скорости гибели, которую мы наблюдали при малых экспозициях у бактерий в биопленках, скорее всего, свидетельствует о защите, которую создают биопленки для биоактивных частиц, входящих в состав факела. Тем не менее, при более длительной экспозиции мы наблюдали полную гибель бактерий в биопленках, сформированных как на искусственной поверхности, так и на поверхности зубных каналов.
Использованный в работе штамм характеризовался множественной антибиоти-коустойчивостью, что подчеркивает возможность применения НТП для воздействия на бактерии, устойчивые к наиболее распространенным антибиотикам.
ЛИТЕРАТУРА
1. Арцимович Л.А., Сагдеев Р.З. Физика плазмы для физиков. М., Атомиздат, 1979.
2. Ермолаева С., Петров О., Миллер Г. и др. Перспективы использования низкотемпературной газовой плазмы как антимикробного агента. Вестн. РАМН.2011, 10: 15-21.
3. Романова Ю.М., Гинцбург А.Л. Бактериальные биопленки как естественная форма существования бактерий в природе и в организме человека. Журн. микробиол. 2011, 3: 99-109.
4. Савельев В., Ступин И., Волкоедов В. Перспективы использования плазменного скальпеля в хирургической практике. Хирургия. 1986, 10: 153-156.
5. Юдина Н., Курочкина А. Контроль биопленок — овременная стратегия контроля и лечения стоматологических заболеваний. Стоматология. 2099, 88 (3): 77-81.
6. Akishev Y, Grushin M., Karalnik V. et al. Atmospheric-pressure, nonthermal plasma sterilization of microorganismus in liquids and on surfaces. Pure Appl. Chem. 2008. 80: 1953-1969.
7. Deilman M., Halfman H., Bibinov N. et al. Low-pressure microwave plasma sterilization of polyethylene terephthalate bottles. J. Food Prot. 2008, 71: 2119-2123.
8. Ermolaeva S.A., Varfolomeev A.F., Chernukha M.Y. et al. Bactericidal effects of non-thermal argon plasma in vitro, in biofilms and in the animal model of infected wounds. J. Med. Microbiol. 2011, 60 (1): 75-83.
9. Fridman G., Friedman G., Gutsol A. et al. Applied plasma medicine. Plasma Process Polym. 2008, 5 (6): 503-508.
10. Joaquin J.C., Kwan C., Abramzon N. et al. Is gas-discharge plasma a new solution to the old problem of biofilm inactivation? Microbiology. 2009, 155: 724-732.
11. Kayes M.M., Critzer F.J., Kelly-Wintenberg K. et al. Inactivation of foodborne pathogens using a one atmosphere uniform glow discharge plasma. Foodborne Pathog. Dis. 2007, 4: 50-59.
12. Laroussi M., Alexeff L., Kang W Biological decontamination by non-thermal plasmas. IEEE Trans. Plasma Sci. 2000, 28 (1): 184-188.
13. Lee H.W, Kim J.M. et al. Tooth bleaching with nonthermal atmospheric pressure plasma. J. Endod. 2009, 35 (4): 587-591.
14. Manner H. Argon plasma coagulation therapy. Curr. Opin. Gastroenterol. 2008, 24 (5): 612-616.
15. Moisan M., Barbeau J., Grevier M. et al. Plasma sterilization.Methods and mechanisms. Pure Appl. Chem. 2002, 74: 349-358.
16. Rupf S., Idlibi A.N., Marrawi F.A. et al. Removing biofilms from microstructured titanium ex vivo: a novel approach using atmospheric plasma technologe. PLoS ONE. 2011, 6: e25893.
17. Rupf S., Lehmann A., Hanning M. et al. Killing of adherent oral microbes by a non-thermal atmospheric plasma jet. J. Med. Mocrobiol. 2010, 59: 206-212/
18. Xu L., Tu Y, Yu Y. et al. Augmented survival of neisseria gonorrhoeae within biofilms: exposure to atmospheric pressure non-thermal plasmas. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 2011, 30: 25-31.
19. Yavirach P., Chaijareenont P., Boonyawan D. et al. Effects of plasma treatment on the shear bond strength betweed fiber-reinforced composite posts and resin composite for core build-up. Dent. Mater. J. 2009, 28 (6): 686-692.
Поступила 18.06.13
Контактная информация: Ермолаева Светлана Александровна, д.б.н., 123098, Москва, ул. Гамалеи, 18, р.т. (499)190-43-75
