CC BY
144
КЛИНИЧЕСКАЯ ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА, № 8, 2013
микробиология
© коллектив авторов, 2013
УДК 616-002.71-022:579.842.23]-078
Л.Д. Македонова, Т.А. Кудрякова, Г.в. Качкина, Н.Е. Гаевская
БАКТЕРИОФАГИ YERSiNiA PSEUDOTUBERCULOSiS: ОБНАРУжЕНИЕ В шТАММАХ РАЗЛИЧНЫХ 0-СЕР0ВАР0В И ИХ ИДЕНТИФИКАцИя
ФКУЗ Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора
Подобраны 5 индикаторных псевдотуберкулезных штаммов, при использовании которых из 161 штамма Y.pseudotuberculosis выделены 9 бактериофагов, идентичных по морфологическим и серологическим свойствам, но имеющих индивидуальные особенности в их литической активности. Проба на чувствительность к бактериофагам может быть использована в лабораторной диагностике для дифференциации штаммов Y.pseudotuberculosis.
Ключевые слова: штаммыY.pseudotuberculosis, бактериофаги, обнаружение, идентификация, свойства, диагностика
L.D. Makedonova, T.A. Kudriyakova, G.V Katchkina, N.Ye. Gayevskaya
THE BACTERIOPHAGES YERSINIA PSEUDOTUBERCULOSIS: THE DETECTION IN STRAINS OF DIFFERENT O-SEROVARS AND THEIR IDENTIFICATION
The Rostov-on-Don anti-plague institute of Rospotrebnadzor, Rostov-on-Don, Russia
The .sample included five indicator pdeudotuberculosis .strains. The application of these strains permitted to isolate out of 161 strains of Y. pseudotuberculosis 9 bacteriophages identical by their morphologic and serologic characteristics but having individual particularities in their lytic activity. The test on sensitivity to bacteriophages can be used in laboratory diagnostic to differentiate the strains of Yersinia pseudotuberculosis.
Key words: Yersinia pseudotuberculosis, bacteriophages, detection, identification, quality, diagnostic
Возбудитель псевдотуберкулеза широко распространен в природе и охватывает многие виды млекопитающих и птиц. В последнее время эта инфекция все чаще регистрируется у людей. Распространение псевдотуберкулеза охватило практически все административные территории России. Многообразие клинических форм псевдотуберкулеза затрудняет его диагностику, в связи с чем случаи этой инфекции остаются нераспознанными и скрываются под диагнозами других инфекционных и соматических заболеваний [2, 3, 6]. В настоящее время известен 21 серологический вариант псевдотуберкулезного микроба. Наибольшее значение в патологии человека на территории России имеет возбудитель псевдотуберкулеза О1 серовара [2]. Наблюдаемое увеличение заболеваний людей псевдотуберкулезом требует дальнейшего усовершенствования бактериологической диагностики этой болезни. Большое значение при этом могут иметь вспомогательные тесты дифференцирования псевдотуберкулезного микроба с помощью фагов. Сведения о наличии фагов у штаммов различных сероваров Y.pseudotuberculosis в доступной литературе отсутствуют. Исследования в этом направлении крайне актуальны для решения практических задач фаго-диагностики возбудителей псевдотуберкулеза [4].
Целью работы явилось выделение и идентификация бактериофагов из штаммов псевдотуберкулезного микроба различных О-сероваров.
Для корреспонденции:
Македонова Людмила Дмитриевна, ст. науч. сотр. группы бактериофагов
Адрес: 344022, Ростов-на-Дону, ул. М. Горького, 117/40 Телефон: 240-91-20 E-mail: plague@aaanet.ru
Материалы и методы. Использовали 161 штамм псевдотуберкулезного микроба О1-О5 сероваров. Для изучения специфичности применяли 39 штаммов Y.enterocolitica, 69 штаммов Y.pestis, 6 - E.coli, 2 - S.dysenteriae, 3 - S.typhi, 6 - S.paratyphi. Индикаторами служили Y.pestis EV 76, а также каждый из исследованных штаммов возбудителя псевдотуберкулеза. В экспериментах применяли 9 псевдотуберкулезных фагов, выделенных из штаммов Y.pseudotuberculosis разных О-сероваров. В качестве контрольных взяты псевдотуберкулезные фаги Котляровой, 1б, 3м и PST. Выявление фагов в культурах Y.pseudotuberculosis осуществляли путем исследования надосадочной жидкости односуточной бульонной культуры испытуемого штамма, инактивированного хлороформом, двухслойным методом по Грациа с использованием 0,7% агара Хоттингера и 1,5% эритрит агара. Для выделения фагов из испытуемых культур использовали посев в 15% раствор мочевины по методике [1] и прогревание одно-суточной бульонной исследуемой культуры при 56°С в течение 50-60 мин. Диапазон литической активности и специфичность фагов изучали путем постановки прямой пробы с фагами. Строение корпускул исследовали в электронном микроскопе GEM 100B по методу [5].
Результаты и обсуждение. Испытан на наличие фага 161 серотипированный штамм Y.pseudotuberculosis. Выявлено, что индикаторными свойствами для выявления фагов из псевдотуберкулезных культур О1, О3, О4 сероваров обладают следующие штаммы: 1362, 1367 (О1 серовара), 310 (О3 серовара), 10368 (О4 серовара, депонирован в Государственной коллекции патогенных бактерий "Микроб" под № КМ 207). Исключение составил Y.pseudotuberculosis 5344 (О3 серова-ра), который являлся индикаторным для обнаружения фагов у штаммов О5 серовара. Из всех использованных методов выделения фагов из бульонных культур Y.pseudotuberculosis
МИКРОБИОЛОГИЯ
Лизабельность штаммов Y. pseudotuberculosis разных О-сероваров псевдотуберкулезными фагами
Серовары Лизировано бактериофагами
изучаемых штаммов Y. pseudotuberculosis Количество изу- из штаммов I серовара из штаммов III серовара из штаммов IV серовара из штаммов V серовара
чаемых штаммов 2344 2391 12310 1996 274 10364 10369 10358 1984
Л % Л % Л % Л % Л % Л % Л % Л % Л %
I 33 33 100 33 100 21 63,6 32 96,9 32 96,9 33 100 32 96,9 32 96,9 19 57,5
II 8 8 100 8 100 8 100 7 87,5 8 100 7 87,5 7 87,5 7 87,5 6 75,0
III 13 13 100 13 100 13 100 13 100 13 100 13 100 13 100 13 100 13 100
IV 20 20 100 20 100 19 95 19 95 19 95 19 95 19 95 19 95 19 95
V 2 2 100 2 100 2 100 2 100 2 100 2 100 2 100 2 100 2 100
Примечание. Л - лизабельность штаммов.
(обработка хлороформом, 15% раствором мочевины и прогреванием) эффективной оказалась обработка хлороформом испытуемой культуры с использованием при посеве в качестве нижнего слоя 1,5%-го эритрит агара. Примененный метод позволил изолировать из культур Y.pseudotuberculosis 9 фагов: 2 фага (2344, 2391) из штаммов О1 серовара, 1 (12310) - из штаммов О3 серовара, 1 (1984) - из О5 серовара и 5 (1996, 274, 10364, 10358, 10369) - из О4 серовара. Фаг 1996 выделяли также из односуточной культуры в бульоне Хот-тингера с добавлением 15% мочевины. Псевдотуберкулезные фаги обнаружены на соответствующих индикаторных штаммах: фаг 2344 на Y.pseudotuberculosis 1362, фаг 2193 -на Y.pseudotuberculosis 1367, фаги 1996, 274, 10364, 10358, 10369 - на Y.pseudotuberculosis 10368, фаги 12310 и 1984 - на Y.pseudotuberculosis 310 и 5344 соответственно. Свежевыде-ленные псевдотуберкулезные фаги имели на газоне соответствующих индикаторных культур негативные колонии с прозрачным центром и слегка мутным ореолом, образуемым зоной неполного лизиса. Диаметр колоний не превышал 4-6 мм. При электронной микроскопии они относились к семейству Podoviridae и III морфологической группе по классификации А.С. Тихоненко [5]. Изучение серологических свойств 9 фагов, полученных из штаммов Ypseudotuberculosis О1, О3, О4, О5 сероваров в реакции нейтрализации с антифаговыми сыворотками к псевдотуберкулезным фагам 1-Ш серотипов показало, что фаги полностью нейтрализовались антифаговой сывороткой к псевдотуберкулезным фагам О1 серотипа и не давали перекрестных реакций с антифаговыми сыворотками к псевдотуберкулезным фагам П-Ш серотипов, и чумным фагам 1-1У серотипов. Выделенные фаги обладали широким спектром активности. Они лизировали 50-100% штаммов Y.pseudotuberculosis, 100% штаммов Y.pestis, почти все взятые в опыт штаммы E.coli, S.dysenteriae, S.paratyphi и 2,6-20,5% штаммов Y.enterocolitica. Изучение литической активности выделенных псевдотуберкулезных фагов на штаммах Y.pseudotuberculosis разных О-сероваров показало, что они отличались друг от друга (см. таблицу). Два фага 2344 и 2391, выделенные из одноименных штаммов О1 серова-ра, обладали широким диапазоном действия, лизируя 100% изученных штаммов Y.pseudotuberculosis О1-О5 сероваров. Фаги из штаммов О3 и О5 сероваров (12310 и 1984) имели более узкий спектр действия в отношении штаммов О1 се-ровара (53,7 - 63,6%) и лизировали до 75-100% штаммов О2-О5 сероваров. Некоторые штаммы, чувствительные к фагу 1984, устойчивы к фагу 12310. Пять фагов (1996, 274, 10364, 10369, 10358), изолированные из штаммов О4 серо-
вара, активны в отношении 87,5-100% псевдотуберкулезных штаммов О1-О5 сероваров. Избирательной активности выделенных фагов в отношении псевдотуберкулезных штаммов определенных О-серогрупп не отмечено. Фаги лизировали не только штаммы своего серовара, но и других.
Заключение. С помощью подобранных индикаторных культур удалось обнаружить фаги в штаммах О1, О3, О4, О5 сероваров. Выделенные фаги не отличались друг от друга по морфологии негативных колоний на газонах соответствующих индикаторных культур. Изученные псевдотуберкулезные фаги независимо от серовара штамма, из которого они выделены, имели одинаковое строение корпускул (изометрический капсид и короткий отросток). Фаги имели антигенную структуру, идентичную с фагом Котляровой, и относились к 1 серологической группе псевдотуберкулезных фагов. Коллекция бактериофагов и тест-штаммов патогенных для человека иерсиний представлена в базе данных (св-во о государственной регистрации № 2012620588 от 19 06.12 г.). При изучении специфичности литического действия фагов полученные данные свидетельствуют об их способности одновременно лизировать чумные и псевдотуберкулезные культуры, а также отдельных представителей семейства Enterobacteriaceae. Фаги, выделенные из штаммов О1 серовара, обладали более широким спектром, чем фаги из штаммов О3 и О4 серова-ров. Отмечены индивидуальные особенности в литической активности псевдотуберкулезных фагов, пригодные в лабораторной диагностике для внутривидовой дифференциации штаммов Y. pseudotuberculosis.
ЛИТЕРАТУРА
1. Авт. сов-во 3 1578189 СССР. Кудрякова Т.А., Македонова Л.Д., Черкасова Л.Р. Опубл. 15.07.90. Бюлл. № 28, с. 100.
2. Профилактика инфекционных болезней. Кишечные инфекции. Эпидемиологический надзор и профилактика псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза / Демина Ю.В., Ценева Г.Я., Воскресенская Е.А. и др. // Методические указания. М.; 2009.
3. Псевдотуберкулез и иерсиниоз (эпидемиология, клиника, диагностика, терапия) / Ценева Г.Я., Кокорина Г.И., Воскресенская Е.А. и др. СПб.: 2005.
4. Серов Г.Д. // Дальневосточная скарлатиноподобная лихорадка. Владивосток. 1974: 96-104.
5. Тихоненко А.С. Ультраструктура вирусов бактерий. М.; 1968.
6. Ющук Н.Д., Ценева Г.Я., Кареткина К.Н., Бродов Л.Е. Иерси-ниозы // М. «Медицина». 2003.
Поступила 21.11.12
