CC BY
28
УДК 616.981.452+616.002.71
Н.А.Видяева, А.В.Г аева
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ЛИПОПОЛИСАХАРИДА ШТАММОВ YERSINIA PESTIS И YERSINIA PSEUDOTUBERCULOSIS РАЗЛИЧНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ
Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов
Изучена чувствительность штаммов Yersinia pestis различного происхождения и Y. pseudotuberculosis к ЛПС-специфическим бактериофагам энтеробактерий. Показано, что лизис штаммов возбудителя чумы этими бактериофагами не зависит от подвидовой принадлежности, культурально-морфологических свойств и температуры культивирования. Методом сравнительного электрофоретического анализа ЛПС всех изученных штаммов Y. pestis установлено, что он находится в R-форме (Re-хемотип) в отличие от S-формы ЛПС штаммов Y. pseudotuberculosis.
Ключевые слова: Yersinia pestis, Y. pseudotuberculosis, липополисахарид (ЛПС), ЛПС-специфические бактериофаги энтеробактерий.
Липополисахарид (ЛПС) является уникальной структурой, присущей только грамотрицательным бактериям. ЛПС состоит из трех частей: гидрофобного липида А, который погружен в наружный слой внешнего мембранного бислоя, корового олигосахарида и О-боковых цепей, называемых также О-ан-тигеном. О-антиген состоит из цепи повторяющихся единиц либо одного и того же, либо разных сахаров и значительно отличается по химическому составу, структуре и биологической активности у бактерий различных видов. Такая структура ЛПС характерна для гладких или 8-форм колоний. В отличие от них у шероховатых колоний (Я-форма) О-боковые цепи и коровая часть редуцированы. В зависимости от степени утраты звеньев О-боковой цепи и коровой части липополисахарида различают 8Я, ЯЬ, Яс, ЯЛ и Яе хемотипы [9]. Различные формы ЛПС могут быть детектированы с помощью техники электрофореза биополимеров в полиакриламидном геле и последующей окраской гелей с использованием азотно-кислого серебра [15].
Способность большинства энтеропатогенных грамотрицательных бактерий, в том числе У. pseudotuberculosis и У. еМегосо1Шеа, синтезировать полноценный ЛПС связана с их вирулентностью. В отличие от них возбудитель чумы вирулентен в Я-форме. Электрофоретический анализ ЛПС, выделенного водно-фенольной экстракцией из различных штаммов У. ре8^8, также доказал, что он относился к Я типу [3, 11]. Вместе с тем описаны штаммы У. ре8^8 с «атипичными» формами колоний, которые относят по культурально-морфологическим свойствам к 8-, 08- и ОЯ-формам. Такие штаммы появляются как спонтанно в процессе длительного хранения культур [4], так и в экспериментальных условиях [8]. Переход возбудителя чумы в 8-форму сопровождался утратой вирулентности для лабораторных животных [8].
Исследованиями последних лет показано, что у основного подвида У. pestis, как и у У. pseudotuberculosis, обнаружен кластер генов, ответственных за синтез О-антигена. Однако в отличие от псевдотуберкулезного микроба у возбудителя чумы он инактивирован вследствие инсерций или делеций в пяти
из 17 генов этого кластера, что приводит к невозможности биосинтеза О-антигена у возбудителя чумы [12, 14]. На территории бывшего СССР и Монголии, помимо основного подвида, выделяются штаммы четырех неосновных подвидов (кавказского, гиссарского, алтайского и улегейского), имеющие избирательную вирулентность (вирулентны для белых мышей и авирулентны для морских свинок). Они обладают как свойствами, объединяющими основной и неосновные подвиды, так и свойствами, общими с возбудителем псевдотуберкулеза. Эти штаммы рассматриваются как промежуточные формы между У. pseudotuberculosis и У. pestis [5]. Среди них иногда встречаются штаммы, описываемые по культурально-морфологическим свойствам как гладкие (8) или переходные 80-, ЯО-формы, которые, как правило, авирулентны для лабораторных животных [6]. Исходя из вышеизложенного, мы предположили, что среди штаммов возбудителя чумы, рассматриваемых как промежуточные формы между У. pseudotuberculosis и У. pestis, а также среди штаммов, описываемых по культуральноморфологическим свойствам (8-, 08- и ОЯ-формы), могут оказаться штаммы с полноценным или недостроенным ЛПС.
Целью работы было изучение чувствительности штаммов У. pestis различного происхождения к ЛПС-специфическим бактериофагам энтеробактерий. Провести сравнительный электрофоретический анализ липополисахарида у штаммов возбудителя псевдотуберкулеза, основного и четырех неосновных подвидов возбудителя чумы, а также у штаммов У. pestis, описываемых по культурально-морфологическим свойствам как 8-, 08- и ОЯ-формы.
Материалы и методы
Для изучения ЛПС были взяты референтные штаммы возбудителя чумы: 4 штамма основного подвида (А-161, М-231, 55-801, БУ) и по 2 штамма неосновных подвидов - кавказского (1146, 6499), гиссарского (А-1728, А-1249), алтайского (И-2998, И-2359), улэгейского (И-3069, И-3131), 4 штамма возбудителя псевдотуберкулеза, выделенных от
грызунов (417, 2600) и людей, больных дальневосточной скарлатиноподобной лихорадкой (312, 5073), а также штаммы Y. pestis, описываемые по культурально-морфологическим свойствам, как S-, OS- и OR-формы [А-1108, 231/П.Л.^-форма), EV11M].
ЛПС-специфические бактериофаги энтеробактерий, использованные для характеристики чумных штаммов (FP1, Р22), описаны ранее [13, 16]. Исследуемые бактериальные культуры, выращенные при 28 и 37 °С, высевали на чашки с LB агаром, затем добавляли каплю фагового лизата в концентрации 109 БОЕ/мл. Лизис клеток штаммов Yersinia учитывали после двухсуточной инкубации при 4, 28 или 37 °С.
Для анализа ЛПС штаммов Y. pestis и Y. pseudotuberculosis клетки выращивали в бульоне LB при 28 °С в течение 18 ч. Штаммы Y. pestis А-1108, 231/П.Л. (S-форма), EV11M - при 28, 37 и 4 °С. После обработки обеззараживания культур [7] клетки осаждали центрифугированием, отмывали 0,9 % раствором натрия хлорида, суспендировали в забу-ференном 0,9 % растворе натрия хлорида до 5 -109 КОЕ/мл. ЛПС анализировали в лизатах целых клеток после разрушения белков протеиназой К по P.Hitchcock и T.Brown [9]. Электрофоретический анализ ЛПС проводили в 15 % полиакриламидном геле с 4 М мочевиной по U.K.Laemmli [10] с последующей окраской азотно-кислым серебром по C.M.Tsai и C.E.Frasch [15]. Анализ моносахаридного состава проводили тонкослойной хроматографией после кислотного гидролиза ЛПС.
Результаты и обсуждение
Для предварительного определения хемотипа липополисахарида все штаммы чумного и псевдотуберкулезного микробов были исследованы на способность лизироваться R-ЛПС специфическим бактериофагом FP1 и S-ЛПС специфическим бактериофагом Р22 энтеробактерий. Все изученные штаммы возбудителя чумы и возбудителя псевдотубеку-леза лизировались, либо не лизировались R- и S-ЛПС специфическими бактериофагами, независимо от подвидовой принадлежности штаммов. Однако следует отметить, что один штамм основного подвида (М231), гиссарские, алтайские и улегейские штаммы, выращенные при 28 и 37 °С, не лизирова-лись изученными фагами ни при 28, ни при 37 °С культивирования, в то время как штаммы 1146 (кавказский) и А-1108, выделенный на Тянь-Шане и описанный как S-форма, два Бадхызских штамма (417 и 2600) лизировались обоими фагами. При 4 °С практически все исследованные штаммы Y. pestis приобретали способность лизироваться обоими фагами. Полученные данные в основном совпадают с данными ряда авторов [1, 2, 3] и свидетельствуют о том, что ЛПС-специфические фаги энтеробактерий не пригодны для тестирования ЛПС возбудителя чумы и псевдотуберкулеза. Вероятно, в рецепции этих бактериофагов у чумного и псевдотуберкулезного микробов играет роль не только (или не столько) ЛПС, но и белки внешней мембраны, как это описано для ряда бактериофагов Е. coli [17].
Дальнейшее изучение ЛПС проводили методом электрофореза в полиакриламидном геле с последующей окраской азотно-кислым серебром. Отсутствие на электрофореграмме характерных для 8-формы «лестниц» и наличие по одной быстро-движущейся полосе с низкой молекулярной массой (< 25 кДа) свидетельствует о том, что ЛПС штаммов всех пяти подвидов по электрофоретической подвижности относится к ЯЛ-Яе хемотипу (рис. 1). В отличие от них у всех четырех штаммов возбудителя псевдотуберкулеза ЛПС был в типичной 8-форме.
Таким образом, по данным электрофоретического анализа, можно предположить, что в кластере генов О-антигена у возбудителя чумы уже у неосновных подвидов произошли изменения, которые приводят к сдвигу рамки считывания и невозможности биосинтеза или сборки полноценного ЛПС. Однако на основании электрофоретической картины ЛПС У. pestis пяти подвидов нельзя говорить о 100 % идентичности нуклеотидных последовательностей кластера генов О-антигена у этих штаммов, так как было показано, что даже у двух штаммов основного подвида (БУ и СО92) существуют различия в нуклеотидных последовательностях, по крайней мере, в двух псевдогенах (ddhB и/&) О-антиген-ного кластера [14]. Анализ моносахаридного состава коровой части ЛПС у штаммов пяти подвидов методом тонкослойной хроматографии позволил выявить наличие у всех штаммов рибозы, галактозы и глюкозы, кроме штаммов кавказского подвида, у которого данным методом детекции моносахаров галактоза не выявлялась.
Вероятно, сравнение нуклеотидных последовательностей генов кластера О-антигена у штаммов различных подвидов позволит проследить эволюцию возникновения молчащих генов в этом кластере.
Выше отмечалось, что среди штаммов возбуди-
Рис. І. Электрофореграмма ЛПС штаммов Y. pseudotuberculosis и Y. pestis пяти подвидов:
1 - Y. pseudotuberculosis 4i7; 2 - iG Y. pestis; 2 - М-23І (основной);
3 - ІІ4б (кавказский); 4 - б499 (кавказский);5 - А-1728 (гиссарский); 6 - А-І249 (гиссарский); 7 - №299S (алтайский); 8 - И-2359 (алтайский); 9 - И-30б9 (улегейский); 10 - И-3І3І (улегейский);
11 - маркеры молекулярных масс (25 кДа - химотрипсиноген,
45 кДа - яичный альбумин, б0 кДа - бычий сывороточный альбумин)
Рис. 2. Электрофореграмма ЛПС штаммов У. ргъйъ, описанных по культурально-морфологическим свойствам, как БО-, ЯО-формы:
1 -ЕУ11М (28 °С); 2 - ЕУ11М (37 °С); 3 - ЕУ11М (4 °С);
4- М 231/П.Л. (28 °С); 5 - М 231/П.Л. (37 °С); 6 - М 231/П.Л. (4 °С);
7 - А-1108 (28 °С); 5 - А-1108 (37 °С); 9- А-1108 (4 °С);
10 - маркеры молекулярных масс (25 кДа - химотрипсиноген,
45 кДа - яичный альбумин, 60 кДа - бычий сывороточный альбумин)
теля чумы пяти подвидов в природных условиях [6], в процессе хранения [4], а также в эксперименте [8] выделяются штаммы, описываемые по культурально-морфологическим свойствам как гладкие (8) или переходные (8О-, ЯО-) формы. Электрофоретический анализ ЛПС штаммов, отобранных по свойствам, характерным для этих форм (гладкая форма колоний) показал, что все они независимо от формы колоний и температуры культивирования имеют ЛПС в Я-форме (рис. 2). Незначительные изменения наблюдались в его электрофоретической подвижности у штамма У. рв8ІЇ8 М-231, которая также характерна для ЯЛ-, Яе-хемотипа. Следовательно, форма колоний штаммов чумного микроба зависит не только от структуры ЛПС, а может быть обусловлена какими-то иными структурными изменениями в оболочке чумного микроба.
Таким образом, установлено, что чувствительность к ЛПС-специфическим фагам энтеробактерий штаммов возбудителя чумы пяти подвидов и штаммов, по культурально-морфологическим свойствам относящихся к 8-, 8О-, ЯО-формам, а также штаммов возбудителя псевдотуберкулеза не отражает структуру их ЛПС, так как некоторые из них лизи-ровались как ЯЛ-Яе-специфическим, так и 8-специфическим фагами. В то же время электрофоретический анализ показал, что у всех изученных штаммов возбудителя чумы ЛПС относится к ЯЛ-Яе хемотипу в отличие от 8-формы ЛПС псевдотуберкулезного микроба. Это свидетельствует о том, что переходные формы У. реиїін (кавказский, гиссар-ский, алтайский и улегейский подвиды), как и основной подвид, не продуцируют полноценный ли-пополисахарид.
Работа поддержана грантом РФФИ № 07-G4-00І00а.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
l. Балахонов С.В., Белькова С.А., Гремякова Т . А. и др. // Акт. аспекты природно-очаговых бол. - Омск, 2GG1. - С. 17G-172. - 2. Горшков О.В. Геномный полиморфизм коллекционных штаммов Yersinia pestis: Автореф. дис. ... канд. мед. наук. - Саратов, 2000. - 25 c. - 3. Гремякова Т.А., Волковой К.И., Степанов и др. // Вестн. РАМН. - 1999. -№ 2. - С. 32-34. - 4. Коробкова Е.И. // Вестн. микробиол., эпидемиол. и паразитол. - 1936. - Т. XV, вып. 2. - С. 163-1S6. -5. Куклева Л.М., Кузьмиченко И.А., Проценко О.А. и др. // Пробл. особо опасных инф. - 2GG1. - Вып. І (Si). -С. 1G5-116. - б. Мартиневский И.Л. // Карантинные и зоонозные инфекции в Казахстане. - Алматы, І999. - Вып. 1. -С. 211-212. - 7. Санитарно - эпидемиологические правила «Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)». СП 1.3.12S5-G3. - М., 2003. - S. Суров
B. С. Характеристика структуры и некоторых физикохимических свойств соматических антигенов R-, S-форм чумных и R-форм псевдотуберкулезных бактерий: Дис. ... канд. мед. наук. - Саратов, І9S0. - 163 c. - 9. Hitchcock P., Brown T. // J. Bacteriol. - 19S3. - Vol. 154. - P. 269-277. - lO. Laemmli U.K. // Nature (London). - 197G. - Vol. 227. - P. 6SG-6S5. -ll. Prior J.L., Hitchen P.G., Williamson E.D. et al. // Microb. Pathogen. - 2GG1. - Vol. 3G. - P. 49-57. - l2. Prior J.L., Parkhill J., Hitchen P.G. et al. // FEMS Microbiol. Lett. -2GG1. - Vol. 197. - P. 229-233. - l3. Schmidt G., Jann B., Jann K. // Eur. J. Biochem. - 197G. - Vol. 16. - P. 3S2--392. -l4. Skurnik M., Peippo A., Ervela E. // Mol. Microbiol. -2GGG. - Vol. 37(2) - P. 316-33G. - l5. Tsai C.-M., Frasch
C.E. // Analyt. Biochem. - 19S2. - Vol. 119. - P. 115-119. -l6. Wilkinson R.G., Gemsky J., Stocker B.A.D. // J. Gen. Microbiol. - 1972. - Vol. 7G. - P. 527-554. - l7. Yu F., Yama-da H., Mizushima S. // J. Bacteriol. - 19S1. - Vol. 14S. -P. 712-715.
N.A.Vidyaeva, A.V.Gaeva
A COMPARATIVE STUDY OF THE LIPOPOLYSACCHARIDES OF YERSINIA PESTIS AND YERSINIA PSEUDOTUBERCULOSIS STRAINS OF DIFFERENT ORIGINS
Russian Anti-Plague Research Institute "Microbe ", Saratov
Different Yersinia pestis isolates varying in their origin, and Yersinia pseudotuberculosis strains were analyzed to compare their sensitivity to LPS-specific Enterobacteria phages. Lysis of the plague agent strains with these bacteriophages was shown to occur irrespective of their subspecies, cultural and morphological characteristics and cultivation temperature. A comparative electrophoretic analysis of LPS in all the Y. pestis strains, involved in the experiments, found it to be present in the R-form (Re chemo-type), in contrast to the S form LPS displayed by Y. pseudotuberculosis strains.
Key words: Yersinia pestis, Yersinia pseudotuberculosis, lipopolysac-charide (LPS), LPS- specific enterobacterial bacteriophages.
nocTynu^a 17.10.07.
