18AHPHM yCHM^HKmP^AH A^PATHE O^HHrAH TAEEHH MO^AA^APHHHr BHO^OrHK OAO^^HrHHH IN VITRO mAPOHTH^A AHHK^Am
Мухаммаджон Абдувалиевич Мустафакулов Гулшода Озат кизи ^аландарова Шерали Насуруллаевич К^узиев Абдуманнон Искандарович Уралов Рахматилла Нуриллаевич Рахимов Биофизика ва биокимё инстиути [email protected]
АННОТАЦИЯ
Антиоксидантлар организмни эркин радикаллардан ва кислородни фаол шаклларидан химоя киладиган моддалардир. Эркин радикаллар органик молекулаларни кислород билан чала оксидланишида, яъни перекисли оксидланишида хосил булади.
Калит сузлар: НАДН, 2,2-дифенил-1-пикрилгидразил (ДППГ), Рутан, Провидин, Бехи, Антиоксидант.
КИРИШ
Маълумки, жигар митохондрияси икки оксидланиш тизимига эга НАД оркали оксидланувчи субстратлар ва сукцинат оксидланишининг ички фосфорланувчи йули ва кушилган НАДН эркин оксидланишини ташки йули; ушбу йулнинг нафас олиш занжирининг бошлангич кисми В5-редуктазанинг НАДН2-цитохроми хисобланади. Умумий НАДН - оксидаза фаоллигидан РС НАДН оксидаза фаолигини хисоблаб чикарилди. Энзимли антиоксидант тизими супероксиддисмутаза, каталаза, пероксидазалардан ташкил топган. Бу тизим НАД.Н фонди манбаси булиб хизмат киладиган эркин радикал протон окимлари тизимини учиради [1,2]. Антиоксидантлар эркин радикалли оксидланиш реакциясига тускинлик килади ва бузилган бирикмаларни кайта тиклайди. Уни узини ишга ярайдиган холатга утиши учун уни яна кайта тиклаши керак булади. Шу сабабдан антиоксидантлар тезлик билан икки ёки гурух булиб ишлайди, яъни оксидланган шеригини химоя килади ва тезда уни кайта тиклайди. Ана шундай антиоксидантлардан бири ионол (2,6-дитретбутил-4-метилфенол) хисобланади [3]. Антиоксидантларни организмга таъсирини курадиган булсак,
October, 2022
861
куплаб адабиёт маълумотларига кура флавоноид моддалар табиий антиоксидантлар хисобланади. Антиоксидантлар митохондрия мембранасидаги липидларни перекисли оксидланишида ингибирловчи таъсир этиши ва супероксиддисмутаза, каталаза ферментларининг фаолликлари билан изохланади. Бундай флавоноидларга рутин, пуликарин, кверцетин, апигенин ва шу каби куплаб моддалар тажрибаларда антиоксидант хоссаларини намоён килади. Антиоксидантлар митохондриялар дисфункциясида нафас занжирларида эркин радикалларни хосил булишини камайтириш, яъни антирадикал механизми иштирокида таъсир этади. Бундан ташкари прооксидант моддалар хам бор. Бундай моддалар митохондрияларда эркин радикалларни ортишига олиб келади, натижада мембрана липидларида перекисли оксидланиш жараёни бошланиб кетишига сабабчи булади. Бизнинг организмимиз учун кислород микдорининг меъёрий даражадан ортиб кетиши хам яхши окибатларга олиб келмайди. Бу куринишдаги холат юз берганда эркин радикалларнинг хосил булиши натижасида хужайра структуралари емирила бошлайди. Организмда эркин радикалларнинг хосил булиши ва липидларнинг перекисли оксидланиш жараёни кучайиши (баъзан бу жараён оксидатив стресс деб аталади) нафакат кислород микдори ортиб кетган холатларда, балки бир катор бошка сабаблар асосида хам юзага келиши мумкинлиги таъкидланган. Шундай килиб, оксидатив стресс таъсирида биологик мембраналар хусусиятлари ва хужайра функциясида бузилиши юз беради. Липидларнинг перекисли оксидланиши нисбатан учта бевосита таъсир натижасида юз бериш холатларидаги натижалари буйича купрок урганилган [4,
5].
Усимликлардан ажратиб олинган айрим препаратларнинг антиоксидантлик ва антирадикаллик хусусиятларини аниклашдан иборат.
АДАБИЕТЛАР ТАХДИЛИ МЕТОДОЛОГИЯ
a) ДФПГ (радикал)нинг эркин радикалининг оптик зичлиги узгаришини кайд этиш оркали кверцетин ва дигидрокверцетиннинг антирадикал фаоллиги аникланди; б). Руч услубига асосланган усул буйича водород пероксидга нисбатан бирикмалар (кверцетин ва дигидрокверцетин)нинг антирадикал ва антиоксидант фаоллиги аникланди; ДППГ усули: Кверцетин ва дигидрокверцетин флавоноидларининг антиоксидант ва антирадикал хусусиятларини ДФПГ (радикал) эркин радикалининг оптик зичлиги узгаришини кайд этиш оркали амалга оширилди. Ушбу ишда АРА ни аниклаш учун биз баркарор радикал 2,2-
October, 2022
862
дифенил-1-пикрилгидразил (ДППГ) молекулаларининг антиоксидантлар билан кайтарилиш кинетикасини спектрофотометрик улчов техникасидан фойдаландик. Синов аралашмалари сувда 1 мг/мл концентрациясида эритилди. ДППГ усули. Ушбу ишда АРФни бахолаш учун биз антиоксидантлар томонидан баркарор радикал 2,2-дифенил-1-пикрилгидразил (ДППГ) молекулаларини камайтириш кинетикасини спектрофотометрик улчаш усулидан фойдаландик [6]. Усул антиоксидантларнинг баркарор хромогенрадикали 2,2-дифенил-1-пикрилхидразил (ДППГ) билан узаро таъсирига асосланган. Сирка кислотаси билан кислоталанган этанолдаги ДППГ (5х10-4М) стандарт эритмаси иш эритмасини олиш учун 1:10 нисбатда этанол билан суюлтирилди. Олинган эритма 517 нмда 0,9 дан юкори булмаган оптик зичликка эга булиши керак. 5 мл ДППГ ишчи эритмасига 50 мкл урганилаётган усимликлардан олинган экстрактлар кушилди, аралаштирилди ва эритманинг оптик зичлиги пасайиш кинетикаси 30 дакика давомида 517 нм тулкин узунлигида кайд этилди. Назорат намунаси сифатида ДППГ ишчи эритмаси ишлатилган.Антирадикал фаоллик куйидаги формула буйича аникланади:
%ингибирлаш=
Аконтр—Ах Аконтр
х100%
Аконтр
Бу эрда А х - синов эритмасининг оптик зичлиги, хисоблагич - синов намунасининг оптик зичлиги.
H202 усули: Водород пероксидга нисбатан бирикмаларнинг антирадикаллик фаоллигини аниклаш учун Руч услубига асосланган усул ишлатилган. 2 мл 20 М фосфат тампони, 1 мл 43 М водород пероксид эритмаси ва 1 мл дистилланган сувни уз ичига олган хар бир найчага намуналар алохида кушилди. Назорат сифатида фосфат тампони эритмаси ва фосфат тампонсиз водород пероксид эритмасини кабул килиш ишлатилган. Хона хароратида 10 дакика инкубациядан сунг, намуналарнинг оптик зичлиги фосфат тампонининг назорат эритмасига нисбатан 230 нм да улчанди. Водород пероксидни кабул килиш фоизи куйидаги формуладан фойдаланиб хисоблаб чикилган:
H202% = [(Ас-Ае) / Ас х 100] бу ерда Ас- водород пероксид эритмасининг фосфат тампонисиз оптик зичлиги ва Ае - намуналарнинг оптик зичлиги.
Метод адреналиннинг аутоксидланиш реакциясининг ингибирланишига асосланган, препаратларнингш vitro шароитида адреналинни вакт давомида КФШни хосил булиши ва аутооксидланиши хисобига (%) фоизларда ифодаланади. Бунинг учун 0,2 М
October, 2022
863
натрий-карбонат (№2С0з-ЫаНС03)рН=10,65ли буферидан 2,0 мл, адреналин (эпинефрин) гидрохлориднинг 0,18% эритмасидан 56 мкл олинади, 30 мкл антиоксидант препарат солинади хамда тез аралаштириб 30 сониядан 10 дакика мобайнида 347 нм тулкин узунлигида 10 мм кюветада Cary 60 UV-Vis Agilet Technologies спектрофотометрида текширилди. Тадкик килинаётган (экстрактнинг 1 мл даги концентрацияси 1 мг) микдори стандартсифатида ишлатилади. Назорат намуна сифатида 0,2 М 2,0 мл буфер, 0,18% 56 мкл (5,46 мМ) адреналин ишлатилади [7].
МУХ,ОКАМА ВА НАТИЖАЛАР
Антиоксидантлар турли хил таъсир механизмларига эга булиши мумкин, уларнинг фаоллигини турли усуллар ёрдамида урганиш тавсия этилади. Ушбу ишда АРФ экстрактлари эркин радикал ДФПГ билан боглик холда бахоланди. Текширилувчи усимликлардан орлинган бирикмалар ДФПГ нинг сувли эритмасига кушилганда, эркин радикал молекулалар радикал булмаган шаклга айланади, ДФПГ нинг интенсив бинафша рангли эритмаси эса рангсизланади. Синов намуналарининг АРФ ни солиштириш учун такдим этилган эритмадан 50 мкл хар бир экстракт учун консентрациятанланган. 1, 2 ва 5-ракамли намуналар жуда юкори АРФ курсатганлиги сабабли, биз тегишли эритувчи (сув) билан 1: 100 нисбатда суюлтирдик.
0s О
5
38 36 34 32 30 28 26 24 22 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2
-■—Рутан - • — Гликлазид -А— Кверцетин
60
мкг/мл
0
20
40
80
100
1-Расм. Танлаб олинган препаратларнинг антиоксидантлик хусусиятларини текшириш
Олинган натижаларни тахлил килиб, шуни хулоса килишимиз мумкинки, текширилган 1, 4 ва 5-сонли усимликлардан олинган экстрактлар сувлили ДФПГ эритмасига кушилганда, ДФПГ эритмасининг оптик зичлигининг кескин пасайиши кузатилади, бу уларнинг юкори АРФ дан далолат беради (1-расм). 1, 4 ва 5 намуналар учун АРФ 100 марта суюлтирилгандан сунг бахоланди, бу усимликлардан олинган экстрактларнинг аник антирадикал кобилиятини курсатади.
Курсатгич 50 мкг/мл
2- расм. Танлаб олинган препаратларнинг антирадикаллик курсатгичи
Эгри чизикли булмаган регрессияга асосланган консентрацияси 0,1 мМ ни ташкил килади. Улчовлар текширилган экстрактлар кушилгандан сунг дархол 20 °C да амалга оширилди.
October, 2022
ДФПГнинг
865
2-wadean.
50% (IC50) HHruSupnam KunyBHH кoнceнтpaцнfl KHHMaraapu Ba TeKmupunraH экcтpaкraap SunaH pea^uara KupumraHga ^OnT кoнтцeнтpaцнflcннн 50% (t50) ra KaMaHTupum ynyH 3apyp SynraH BaKT.
YcHM^HK^apgaH o^HHraH axcTpaKT^ap IC50, MK^ t50, ceK 50 mk^ Mogga
PyTaH 64 ± 4.2 34±3.7
npoBHgHH 41 ± 6.7 28±4.9
1,2,6-Tpu-0-ra.n.noH.n-ß-D-r.nroKo3a 78 ± 7.8 51.1±4.2
1-0-ra.raoHn-4,6-reKcarHgpoKcHgH$eHoHn-ß- 49.8±3.7 37.2±2.4
^-raroKo3a
EexH 85.5±4.1 62±3.2
PyTaH (cyro.nTHpu.nraH) 89 ± 4.8 108.5±7.8
npoBHgHH (cyro.nTHpu.nraH) 102±4.8 130.7±9.1
1,2,6-Tpu-0-ra.n.noHn-ß-D-r.nroKo3a 124±6.7 142.1±8.4
(cyro^THpunraH)
1-0-ra.n.noHn-4,6-reKcarHgpoKcHgH$eHoHn-ß- 78.2±3.8 102.8±2.1
^-r.nroKo3a (cyro^THpunraH)
Eexu (cyro^THpunraH) 115.7±3.9 138.5±4.9
YpraHHnaeTraH экcтpaкraapнннr консeнтpaцнaсн onguHgaH SepunraH эpнтмagaн 50 MKH HH TamKun Kunagu. 1, 2 Ba 5 HaMyHanap Terumnu эpнтyвннпap (cyB) SunaH 100 MapTa cyronTupungu. 1-pacM. BaKTra KapaS TeKmupunaeTraH ycHMHHK экcтpaкraapнн KymraHga ^OnT HHHr cyBnunu эpнтмacннннг omuK 3HHnurHHHHr Ha3opaTra HucSaraH y3rapumu. 3KcnepuMeHTan MatnyMoraapgaH MatnyM Synumuna, 1, 2 Ba 5-COHHH экcтpaкraap эpкнн paguKarnapHH opraHH3MgaH HHKapuS Tamnam ynyH энг roKopu KoSunuaTra эгa. AffrapagHKan ^aonnuKHH MHKgopuH Saxpnam ynyH Su3 SapKapop paguKan 2,2-gu$eHHn-1-nuKpunrugpasun (^OnT), myHHHrgeK, t50 KypcaTruHnapugaH ^oñganaHguK, ypraHunaeTraH npenaparaap ynyH pagHKanHHHr gacraaSKH кoнтцeнтpaцнacннн KaMaHTupum ynyH 3apyp SynraH BaKT 50% HHruSpnaHum ^aonnurura эгa. ^OnT HHHr 20 oC ga экcтpaкraap SunaH pea^uacuga t50 № 1 HaMyHa ynyH - 64 ± 4,2 c, № 2 HaMyHa ynyH - 41 ± 6,7 c (100 MapTa cyronTHpHnagu), № 3 HaMyHaynyH - 69 ± 4,8 c (100 MapTa cyromupunagu), 5-cohhh HaMyHa ynyH - 254 ± 5,9 c (1-^agBan).
3KCTpaKTnapHH ypraHumga onuHraH экcпepнмeнтaп HaTu^anapHHHr Taxnunu myHH KypcaTguKH, PyTaH, npoBuguH Ba Sexu HaMyHa SomKa HaMyHanap SunaH conumTupraHga эpкнн paguKan ^OnTra HucSaraH энг roKopu APOra эгa.
October, 2022
866
ХУЛОСА
Шундай килиб, усимликлардан олинган экстрактларининг антирадикал фаоллиги урганилди. Энг юкори антирадикал фаоллик сувда топилган (Бехи) экстракти ва (Суммах) ларнинг сувли экстракти танлаб олинган. АРФ механизмини яратиш таркибий кисмларнинг (полифеноллар, флавоноидлар, танинлар, алкалоидлар ва бошкалар) таркиби учун экстрактларнинг сифат ва микдорий таркибини батафсил урганишни талаб килади. Препаратларнинг антиоксидантлик фаоллиги адреналиннинг in vitro шароитида аутооксидланиш реакциясининг ингибитирланиши билан аникланди хамда кислороднинг эркин шаклини хосил булишига тускинлик килди. 1, 2, ва бехи препаратлари стандарт антиоксидант кверцетин хамда гликлазид антиоксидантлари билан солиштирилди.
REFERENCES
1. Ishankhodjaev T. et al. Study on Effects of Liposomal Quercetin on Biochemical Parameters of the Nigrostriatal System of Rats with Experimentally Induced Neurodegenerative Disease //Annals of the Romanian Society for Cell Biology. -2021. - С. 6128-6143.
2. Saatov T. et al. Study on hypoglycemic effect of polyphenolic compounds isolated from the Euphorbia L. plants growing in uzbekistan //Endocrine Abstracts. -Bioscientifica, 2020. - Т. 70.
3. Борисова Г.Г., Ермошин А.А., Малева М.Г., Чукина Н.В.; Основы биохимии вторичного обмена растений: [учеб - метод. пособие, под обш. ред. Г.Г Борисовой]; М-во образования и науки Рос. Федератции, Урал. федер. Ун-т - Екатеринбург: Изд-во Урал. ун-та - 2014. - 128 с.
4. Saatov T. et al. Correction of oxidative stress in experimental diabetes mellitus by means of natural antioxidants //Endocrine Abstracts. - Bioscientifica, 2021. - Т. 73.
5. Saatov T. et al. Antioxidant and hypoglycemic effects of gossitan //Endocrine Abstracts. - Bioscientifica, 2019. - Т. 63.
6. Mukhammadjon M. et al. The effect of ngf on indicators of the antioxidant system in rat brain tissue //Universum: химия и биология. - 2021. - №. 9 (87). - С. 82-86.
7. Тринеева О.В. Методы определения антиоксидантной активности объектов растительного и синтетического происхождения в фармации (обзор). Разработка и регистрация лекарственных средств. -2017; (4). Стр. 180-197.
8. Е.И. Рябинина, Е.Е. Зотова, Е.Н. Ветрова, Н.И. Пономарева, Т.Н. Илюшина. /Новый подход в оценке
антиоксидантной активности растительного сырья при
October, 2022
исследовании процесса аутоокисления адреналина. Химия растительного сырья. 2011. №3. С. 117-121.
9. Мельничук В.А. Экспресс-метод определения антирадикальной активности лекарственных веществ // Хим. Фарм. журн. - 1985. - V.5. - С. 565-567.
10. Seyoum A. Asres K., El-Fiky F.K. Structure-radical scavenging activity relationships of flavonoids // Phytochemistry. - 2006. - V. 67. - P. 2058-2070.
October, 2022
