CC BY
65
аутофлуоресцентная спектроскопия нормального и патологического бронхиального эпителия
н.н. Булгакова1, н.в. Полякова2, в.А. Евтушенко2, И.А. василевский1,
О.в. черемисина2
ИОф им. А.М. прохорова РАН, г. Москва1 НИИ онкологии СО РАМН, г. Томск2 117942, г. Москва, ул. Вавилова, 38, e-mail: nnbulgakova@gmail.com1
Представлены результаты исследований шектров лазер-индуцированной аутофлуоресценции слизистой оболочки бронхиального дерева у больных раком легкого после комбинированного лечения. Измерения спектров были проведены in vivo при возбуждении аутофлуоресценции лазерным излучением с длиной волны 532 нм в ходе контрольной фибробронхоскопии в культе резецированного и контралатерального бронхов. Проведен анализ и сопоставление спектрально-флуоресцентных характеристик с данными морфологического исследования бронхобиоптатов нормальной и патологически измененной слизистой оболочки бронхов. Показана принципиальная возможность аутофлуоресцентной диагностики рецидивов рака в культе резецированного бронха через б мес после комбинированного лечения.
Ключевые слова: рак легкого, аутофлуоресцентная спектроскопия.
AUTOFLUORESCENCE SPECTROSCOPY OF NORMAL AND PATHOLOGICAL BRONCHIAL EPITHELIUM N.N. Bulgakova1, N.V Polyakova2, VA. Yevtushenko2, I.A. Vasilevsky1, O.V Cheremisina2 A.M. Prokhorov General Physics Institute of the RAS, Moscow1 Tomsk Cancer Research Institute, Tomsk2 38, Vavilova Street, 117942-Moscow, e-mail: nnbulgakova@gmail.com1
The results of investigation of laser-induced autofluorescence of normal and pathological bronchial mucosa after combined treatment of lung cancer are presented. The autofluorescence spectra were measured in vivo at 532 nm laser excitation from bronchial mucosa in the stump of operating bronchus and contralateral lung. The two spectral characteristics of laser-induced autofluorescence spectra of normal and pathological changed bronchial mucosa were analyzed and compared with results of morphological analysis. It was shown that autofluorescence detection of the early recurrent malignant lesions in the bronchial stump is possible 6 months after combined treatment.
Key words: lung cancer, autofluorescence diagnosis, autofluorescence spectroscopy.
Актуальной проблемой современной онкопульмонологии является обнаружение центрального рака легкого (ЦРЛ) на бессимптомной стадии в фазе преинвазивного и микроинвазивного опухолевого процесса [2]. Однако незначительные размеры поражения на данной стадии развития процесса значительно затрудняют возможность их обнаружения при обычной фибробронхоскопии (ФБС) в белом свете [10]. Среди методов раннего выявления ЦРЛ наиболее перспективным на сегодняшний день является метод аутофлуоресцентной диагностики (АФД) [4, 12]. В 1991 г. группа ученых из Канады показала, что интенсивность спектров лазер-индуцированной аутофлуоресценции (АФ) нормального и малигнизированного бронхиального эпителия различна [9]. При лазерном возбуждении в синей области спектра (442 нм, Не-Ы лазер) нормальный бронхиальный эпителий интенсивно
флуоресцировал в зеленой области, а интенсивность АФ излучения в очагах малигнизации была намного меньше. Данный эффект лежит в основе АФД раннего ЦРЛ. Для визуализации возникающего эндогенного (аутофлуоресцентного) контраста были разработаны различные модели аутофлуоресцентных бронхоскопов, которые внедрены в клиническую практику [7, 8]. Клинические испытания показали, что использование аутофлуоресцентной бронхоскопии (АФБ) в дополнение к стандартной ФБС значительно (от 2 до
5 раз) повышает возможность выявления дисплазий тяжелой степени, carcinoma in situ (CIS) и ранних раковых изменений бронхиального эпителия [4, 6, 9, 12]. Чувствительность АФБ по данным различных авторов, составляет более 90 %, однако следствием высокой чувствительности является довольно низкая специфичность - от 50 до 70 % [7,
8]. Источниками ложноположительных результатов при АФБ являются грануляционная ткань, воспалительные процессы, предшествующее лечение или предшествующие биопсии. Следует отметить, что при различных патологических изменениях бронхиального эпителия происходят изменения и в его оптических свойствах, которые отражаются на интенсивности АФ и являются причиной неправильной интерпретации аутофлуоресцентных изображений. Как показано в ряде исследований, снизить количество ложноположительных результатов и повысить специфичность АФБ можно при использовании локальной флуоресцентной спектроскопии (ЛФС) [6, 12, 14]. Метод ЛФС основан на неинвазивных точечных измерениях спектров лазер-индуцированной флуоресценции биологических тканей in vivo и позволяет получить количественную информацию об интенсивности и спектральном составе аутофлуоресцентного излучения [4, 12, 13]. В данной работе метод ЛФС был использован для исследования спектров лазер-индуцированной АФ слизистой оболочки культи резецированного бронха в норме и при развитии в ней патологических изменений.
Целью исследования являлось выявление достоверных различий спектрально-флуоресцентных характеристик бронхиального эпителия в норме и при различных патологических изменениях, а также оценка возможности АФД ранних рецидивов рака легкого в культе резецированного бронха после предшествующего лечения.
Материал и методы
В исследование были включены результаты динамического наблюдения 45 пациентов с не-
мелкоклеточным раком легкого, получивших комбинированное лечение (химиотерапия и хирургия) в торакоабдоминальном отделении НИИ онкологии СО РАМН. Наибольшее число больных было в возрасте от 60 до 69 лет. Стадия заболевания устанавливалась после операции в соответствии классификацией Международного противоракового союза по системе TNM. Динамическое наблюдение, при котором в числе прочих обследований выполнялась контрольная ФБС, проводилось регулярно на первом году каждые три месяца, в дальнейшем - один раз в шесть месяцев. ФБС выполнялась с использованием фибробронхоскопов BF 1 Т40, СУ-150, СУ-160 («01утрш», Япония) по стандартной методике. При проведении ФБС тщательно и последовательно осматривались бронхи с двух сторон до ветвей 4-5 порядка, максимально внимательно оценивалось состояние межбронхиальных шпор субсегментарных и сегментарных бронхов, наиболее подверженных поражению при ЦРЛ, и области культи прооперированного бронха.
В ходе ФБС проводились измерения спектров лазер-индуцированной АФ слизистой оболочки бронхов. У всех пациентов спектры измеряли в 3 точках культи (латеральный, медиальный край и центр) по линии резекции бронха и в симметричном участке бронха в контралатеральном легком. После проведения измерений выполнялся забор материала для морфологического исследования. Биопсия бралась из участков слизистой оболочки культи резецированного бронха и бронхов контралатерального легкого, в которых проводились измерения спектров. Среднее число биопсий на одного пациента составило 3,5 фрагмента (табл. 1).
Таблица 1
результаты морфологического исследования бронхобиоптатов в соответствии
с количеством пациентов и изме эенных спектров АФ
Место биопсии Морфология Кол-во пациентов Кол-во спектров АФ
Контралатеральное легкое Норма (п=11) 9 82
Хроническое воспаление (п=5) 4 45
Острое воспаление (п=5) 5 32
Дисплазия II ст. (п=4) 5 4б
Рак (п=4) 4 41
Культя бронха Норма (п=14) 14 107
Хроническое воспаление (п=9) 8 81
Остро е во спаление (п=31) 25 250
Дисплазия II ст. (п=6) б 40
Рак - -
зо
Для проведения ЛФС применяли спектральнофлуоресцентную диагностическую установку «Спектр-Кластер» (ООО «Кластер», Москва). Для возбуждения АФ использовали лазерное излучение с длиной волны 532 нм (твердотельный лазер DPSS, мощность до 5 мВт). Для доставки возбуждающего лазерного излучения к ткани и регистрируемого излучения АФ к фотоприемнику в установке используется совместимый со стандартными эндоскопами Y-образный волоконнооптический диагностический катетер, который вставляли в биопсийный канал бронхоскопа. Спектры АФ регистрировали в диапазоне 550-750 нм, спектральное разрешение при использовании волоконно-оптического катетера составляло <5 нм. Регистрация каждого спектра проводилась в условиях контакта конца катетера с поверхностью слизистой бронха при выключенном освещении бронхоскопа. Пространственное разрешение при измерениях спектров достигало 1 мм. В ходе одного обследования в среднем записывалось 40-50 спектров.
Для анализа результатов клинического исследования на основании измеренных спектров АФ была сформирована исследовательская база данных обследованных больных. Поскольку сформированная база данных была основана на однородной группе пациентов, а её размер был достаточный для углублённого статистического анализа, для её обработки использовался статистический программный пакет SPSS 14-й версии. Был проведен анализ двух спектральных характеристик: максимальное значе-
Рис. 1. Типичные спектры лазер-индуцированной аутофлуоресценции нормального бронхиального эпителия, очагов воспаления и раннего рака при лазерном возбуждении с длиной волны 532 нм
ние спектральной интенсивности (I ) и величина
г v max7
спектрально-флуоресцентного диагностического параметра (DF). Данный параметр относится к характеристикам формы спектра, его величину определяли как отношение интегральных интенсивностей регистрируемого спектра в диапазонах 555585 нм и 620-660 нм соответственно. Таким образом, единицами наблюдения в исследовании явились усредненные значения максимальной спектральной интенсивности АФ (Imax) и диагностического параметра (Df), полученные при измерениях спектров у одного пациента с одновременным забором материала для биопсии. На первом этапе были произведены описательные статистики по указанным спектральным характеристикам. На втором этапе была произведена оценка распределения данных по исследуемым спектральным характеристикам для неоперированного и оперированного бронха по всей выборке. Для оценки различий в изучаемых группах был использован непараметрический U-критерий Манна-Уитни, предназначенный для сравнения независимых выборок с распределением, отличным от нормального [3]. Различия для исследуемых групп признавались значимыми при p<0,05. Для отображения разброса значений использованы коробчатые диаграммы [1].
Результаты и обсуждение
На рис. 1 представлены типичные спектры лазер-индуцированной АФ нормального и малиг-низированного бронхиального эпителия, а также очага воспаления. При лазерном возбуждении в зеленой области спектра (532 нм) нормальный
Рис. 2. Зависимость максимального значения спектральной интенсивности аутофлуоресценции (Ттах) морфологически подтверждённого нормального бронхиального эпителия культи оперированного бронха и симметричных участков бронха контралатерального легкого от времени после операции
эпителий бронха интенсивно флуоресцирует с максимумом в районе 580 нм. В участках малигни-зации регистрировалось резкое (до 10 раз) падение интенсивности АФ с одновременным возрастанием величины спектрально-флуоресцентного диагностического параметра фр). При воспалительных процессах также регистрировались спектры с пониженной, относительно нормального бронхиального эпителия, интенсивностью АФ. В целом, близкие по форме спектры АФ с максимумом в районе 570-580 нм с большим разбросом значений спектральной интенсивности регистрировались при различных патологических изменениях как в культе резецированного бронха, так и в симметричных участках контралатерального легкого. Следует отметить, что наиболее значительный разброс интенсивности АФ регистрировался в культе резецированного бронха в течение первых 6 мес после комбинированного лечения. Вероятно, это связано с процессами восстановления целостности бронхиального эпителия, происходящими в слизистой оболочке культи, которые отражаются на интенсивности АФ излучения. В то же время необходимо отметить, что при проведении спектральных измерений в ходе эндоскопического исследования интенсивность регистрируемого спектра АФ зависит от взаимного расположения торца волоконно-оптического катетера относительно поверхности слизистой оболочки бронха, на которое, в частности, оказывает влияние дыхание пациента. Очевидны и трудности подведения
катетера к определенным точкам бронхиального дерева. Величина относительного параметра фр) подвержена влиянию указанных выше факторов в значительно меньшей степени.
Результаты статистического анализа исследовательской базы для оперированного и неоперирован-ного бронха представлены в табл. 2 и 3. Как видно из представленных таблиц, в данной однородной группе пациентов различные состояния слизистой оболочки бронха имеют значимые различия в спектрально-флуоресцентных характеристиках аутофлуоресцентного излучения.
Для оценки особенностей, связанных со временем, прошедшим от хирургического вмешательства до проведения флуоресцентного исследования, выборка данных по результатам ЛФС была разбита на две группы: до 6 и более 6 мес после резекции легкого. На рис. 2 представлена зависимость максимального значения спектральной интенсивности АФ (!тах) от времени после операции для нормального бронхиального эпителия оперированного бронха и симметричного участка бронха контралатерального легкого. Статистически значимые различия для данной спектральной характеристики (р<0,05) были выявлены для пары «неоперирован-ное легкое» - «оперированное легкое» в первые
6 мес после операции. То есть в данной выборке максимальные значения спектральной интенсивности АФ, регистрируемые в культе резецированного бронха в течение первых 6 мес после операции, были достоверно ниже, чем в симметричных участ-
Таблица 2
результаты статистического анализа характеристик спектров лазер-индуцированной АФ
слизистой оболочки культи бронха
Максимальная спектральная интенсивность (I )
Значимые различия (р<0,05) Незначимые различия (р>0,05)
Норма Острое воспаление Норма Хроническое воспаление
Норма Дисплазия II ст.
Хроническое воспаление Острое воспаление
Хроническое воспаление Дисплазия II ст.
Острое воспаление Дисплазия II ст.
Спектрально-флуоресцентный диагностический параметр фг)
Значимые различия (р<0,05) Незначимые различия (р>0,05)
Норма Дисплазия II ст. Норма Хроническое воспаление
Хроническое воспаление Воспаление
Хроническое воспаление Дисплазия II ст. Норма Острое воспаление
Острое воспаление Дисплазия II ст.
Таблица 3
результаты статистического анализа спектров лазер-индуцированной АФ слизистой
оболочки контралатерального бронха
Максимальная спектральная интенсивность (I )
Значимые различия (р<0,05) Незначимые различия (р>0,05)
Норма Хроническое воспаление Хроническое воспаление Острое воспаление
Норма Острое воспаление
Норма Дисплазия II ст.
Норма Рак
Хроническое воспаление Дисплазия II ст.
Хроническое воспаление Рак
Острое воспаление Дисплазия II ст.
Острое воспаление Рак
Дисплазия II ст. Рак
Спектрально-флуоресцентный диагностический параметр фр)
Значимые различия (р<0,05) Незначимые различия (р>0,05)
Норма Хроническое воспаление Норма Дисплазия II ст.
Норма Острое воспаление
Норма Рак
Хроническое воспаление Острое воспаление
Хроническое воспаление Дисплазия II ст.
Хроническое воспаление Рак
Острое воспаление Дисплазия II ст.
Острое воспаление Рак
Дисплазия II ст. Рак
ках контралатерального легкого. При обследовании через 6 мес после операции значимых различий в максимальных значениях интенсивности АФ нормального бронхиального эпителия в культе бронха и симметричном участке неоперированного бронха не выявлено (р>0,05). Анализ зависимости величины спектрально-флуоресцентного диагностического параметра фр) от времени после операции не выявил значимых различий в величине данного параметра в морфологически подтвержденном нормальном бронхиальном эпителии оперированного и неоперированного бронха как в первые, так и последующие 6 мес после операции.
Выводы
Анализ спектров лазер-индуцированной АФ, измеренных в культе резецированного бронха и симметричном участке контралатерального легкого у больных, получивших комбинированное лечение по поводу рака легкого, позволил выявить значимые различия в спектрально-флуоресцентных характеристиках нормального бронхиального эпителия
и при развитии в нем различных патологических изменений. Полученные результаты показывают, что применение ЛФС может позволить повысить специфичность эндоскопического исследования при мониторинге оперированного бронхиального дерева. Это согласуется с выводами ряда исследователей о перспективности сочетания АФБ и ЛФС в диагностике центрального рака легкого [4, 5, 13, 14]. Статистический анализ полученных результатов не выявил статистически значимых различий в спектрально-флуоресцентных характеристиках АФ излучения нормальной слизистой оболочки неоперированного бронха и культи оперированного бронха через 6 мес после хирургического лечения.
Авторы выражают благодарность РФФИ за частичную поддержку работы в рамках гранта № 09-02-01204.
ЛИТЕРАТУРА
1. Боровиков В.П. Методология и технологии современного анализа данных. Телеком, 2008. 392 с.
2. Лактионов К.К., Давыдов М.И., Полоцкий Б.Е. и др. Прогностические и предсказывающие факторы у больных немелкоклеточным раком легкого // Практическая онкология. 2006. Т. 7, № 3. С. 145-153.
3. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. М.: Медиа Сфера, 2003. С. 109-111.
4. Соколов В.В., Чиссов В.И., БулгаковаН.Н. и др. Флуоресцентная диагностика начального центрального рака легкого // Пульмонология. 2005. № 1. С.107-116.
5. BardM., AmelinkA., SkurichinaM. et al. Optical spectroscopy for the classification of malignant lesions of the bronchial tree // Chest. 2006. Vol. 129. P. 995-1001.
6. Beamis J., Ernst A., Mathur P. et at. A multi-center study comparing autofluorescence bronchoscopy to white light bronchoscopy // Lung Cancer. 2003. Vol. 41. Suppl. 2. S. 49.
7. Haussinger K., Pichler J., Stanzel F. et at. Autofluorescence bronchoscopy: the Dlight system // Interventional Bronchoscopy. 2000. Vol. 30. P. 243-252.
8. Herth F., Becker H. Autofluorescence bronchoscopy-a comparison of two systems (LIFE and D-Light) // Respiration. 2003. Vol. 70 (4). P. 395-398.
9. Hung J., Lam S., Leriche J.C., Palcic B. Autofluorescence of normal and malignant bronchial tissue // Lasers Surg. Med. 1991. Vol. 11. P. 99-105.
10. Kamath A.V., Chhajed P.N. Role of bronchoscopy in early diagnosis of lung cancer // J. Chest Dis. Allied Sci. 2006. Vol. 48 (4). P. 265-269.
11. Kennedy T., Hirsch F., Miller Y. et at. A randomized study of fluorescence bronchoscopy versus white light bronchoscopy for early detection of lung cancer in high risk patients // Lung Cancer. 2000. Vol. 29 (1). Suppl. 1. P. 244-245.
12. Lam S., ZengН., McWilliams A. Optical Spectroscopy and Imaging for Early Lung Cancer Detection: A Review // Photodiagnosis and Photodynamic therapy. 2004. Vol. 1, Issue 2. P. 111-122.
13. Zellweger M., Grosjean P., Goujon D. et al. Autofluorescence spectroscopy to characterize the histopathological status of bronchial tissue in vivo // J. Biomed. Opt. Vol. 2001.Vol. 6 (1). P. 41-52.
14. Zeng H., PetekM., Zorman M.T. et al. Integrated Endoscopy System for Simultaneous Imaging and Spectroscopy for Early Lung Cancer Detection // Optics Letters. 2004. Vol. 29. P. 587-589.
Поступила 15.09.11
