CC BY
33
УДК 612.816:612.822.2
ATP уменьшает вход ионов кальция в нервную терминаль, блокируя кальциевые каналы L-типа
Э. Ф. Хазиев1,2,3, Д. В. Самигуллин1,2,3, А. Н. Ценцевицкий1,2*, Э. А. Бухараева1,2, Е. Е. Никольский1,2
1Казанский институт биохимии и биофизики - обособленное структурное подразделение Федерального исследовательского центра «Казанский научный центр Российской академии наук», 420111, Казань, а/я 30
2Казанский (Приволжский) федеральный университет, 420008, Казань, ул. Кремлевская, 18
3Казанский национальный исследовательский технический университет им. А.Н. Туполева,
420111, Казань, ул. К. Маркса, 31/7
*E-mail: atsen@list.ru
Поступила в редакцию 16.10.2017
Принята к печати 09.04.2018
РЕФЕРАТ В нервно-мышечном соединении ATP, активируя пресинаптические Р2Y-рецепторы, подавляет вызванную и спонтанную квантовую секрецию ацетилхолина, уменьшая входящий кальциевый ток. С использованием специфического кальций-чувствительного флуоресцентного красителя Oregon Green Bapta 1 на нервно-мышечном синапсе лягушки показано, что экзогенная ATP снижает амплитуду кальциевого транзиента, отражающую изменение входа кальция в ответ на нервный стимул. Этот эффект ATP на тран-зиент предотвращается блокадой Р2-рецепторов сурамином. Специфический блокатор пресинаптических потенциал-зависимых кальциевых каналов L-типа нитрендипин, снижая per se амплитуду транзиента, значительно ослаблял эффект ATP на кальциевый сигнал. С другой стороны, предварительное воздействие ATP на нервно-мышечный препарат полностью устраняло угнетающее действие нитрендипина на кальциевый ответ. Полученные данные свидетельствуют о том, что в подавляющем действии ATP на амплитуду кальциевого транзиента в нервном окончании лягушки есть существенный компонент, обусловленный снижением входа кальция через потенциал-зависимые кальциевые каналы L-типа. КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА ATP, кальциевый транзиент, кальциевые каналы, нервно-мышечное соединение.
ВВЕДЕНИЕ
В нервно-мышечном соединении ATP уменьшает амплитуду многоквантовых токов концевой пластинки (ТКП), активируя пресинаптические Р2Y-рецепторы
[1]. Угнетающее действие ATP на амплитуду пост-синаптических токов является пресинаптическим эффектом и может быть обусловлено изменением активности кальциевых каналов, вход кальция (Са2+) через которые запускает процесс экзоцитоза синап-тических везикул. Действительно, ATP обратимо снижала Са2+ ток в перисинаптическом отделе аксона
[2] и уменьшала амплитуду Са2+-транзиента, зарегистрированного в различных отделах нервной терми-нали лягушки [3]. Изменение амплитуды транзиента отражает изменение концентрации свободных ионов Са2+ внутри терминали [4, 5], и ее снижение при действии ATP может свидетельствовать о влиянии этого пурина на активность пресинаптических кальциевых
каналов. На нервной терминали лягушки функционируют несколько типов потенциал-зависимых кальциевых каналов [4]. Активность каналов какого типа изменяется при действии ATP неизвестно. Данные о влиянии ATP на потенциал-зависимые кальциевые каналы L-типа достаточно противоречивы. На различных объектах показано, что ATP способна как усиливать вход ионов кальция через каналы L-типа [6], так и ингибировать эти каналы [7]. В настоящей работе, используя флуоресцентный метод регистрации Са2+-транзиента в нервной терминали лягушки, мы выясняли, участвуют ли пресинапти-ческие потенциал-зависимые кальциевые каналы L-типа в подавлении амплитуды Са2+-транзиента ATP. Установлено, что снижение амплитуды тран-зиента при активации пуринорецепторов частично обусловлено уменьшением входа ионов Са2+ через кальциевые каналы L-типа.
100 | ACTA NATURAE | ТОМ 10 № 2 (37) 2018
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Исследование выполнено на изолированном нервно-мышечном препарате m. cutaneus pectoris лягушек Rana ridibunda. Относительное изменение уровня Ca2+ в нервной терминали (Са2+-транзиент) оценивали при помощи флуоресцентного красителя Oregon Green Bapta 1. Подробно методика загрузки красителя через культю нерва, протоколы регистрации и обработки флуоресцентных сигналов представлены в работе [8]. Использовали следующий протокол экспериментов. После загрузки флуоресцентного красителя в нервные терминали препарат помещали в ванночку объемом 3 мл, через которую со скоростью 3 мл/мин протекал перфузионный раствор. Для предотвращения сокращений мышечных волокон при стимуляции двигательного нерва использовали раствор Рингера с пониженным содержанием ионов Са2+ и повышенным Mg2+: NaCl - 113.0 мМ, KCl - 2.5 мМ, NaHCO3 - 3.0 мМ, MgCl2 - 6.0 мМ, CaCl2 - 0.9 мМ (pH 7.2-7.3, температура 20.0 ± 0.3°C). Эксперименты проводили в соответствии с этическими принципами и нормативными документами, рекомендованными Европейским научным фондом (ESF) и Декларацией о гуманном отношении к животным. В каждой серии экспериментов использовали 6-21 синапс от 3-5 животных.
Стимуляцию двигательного нерва прямоугольными импульсами длительностью 0.2 мс с частотой 0.5 имп/с осуществляли стимулятором (A-M Systems 2100) при помощи «всасывающего» suction электрода. Со всей длины выбранной нервной терминали в контрольных условиях регистрировали 60 последовательных флуоресцентных сигналов, после чего в перфузионный раствор добавляли исследуемое вещество. Регистрацию 60 сигналов с той же терми-нали, что и в контроле, начинали спустя 20-25 мин после аппликации вещества. При необходимости в перфузионный раствор в присутствии первого вещества подавали следующее исследуемое соединение, и сигналы все с той же нервной терминали вновь регистрировали через 20-25 мин. Предварительно были проведены эксперименты, результаты которых свидетельствуют о том, что амплитудно-временные параметры флуоресцентного сигнала в ответ на редкую стимуляцию двигательного нерва не претерпевают изменений в течение 3-4 ч.
Регистрацию флуоресцентных сигналов в ответ на нервный стимул осуществляли c помощью фотометрической установки на базе микроскопа Olympus BX-51 с водно-иммерсионным объективом Х60 в программе Turbo-SM. В качестве источника освещения использовали монохроматор Polyhrom V (Till Photonics, Munich, Германия), настроенный на длину волны возбуждения красителя - 488 нм.
Флуоресцентный сигнал выделяли с использованием следующего набора фильтров: 505DCXT дих-роическое зеркало, E520LP эмиссия (Chroma). Для уменьшения фонового свечения область освещения ограничивали при помощи диафрагмы. Данные анализировали с использованием программного обеспечения камеры Neuro CCD и ImageJ. В программе ImageJ выбирали области терминали и фона. Из всех значений свечения области терминали вычитали значение свечения фоновой области. Данные представляли как отношение: (AF / F0 - 1) х 100%, где AF - интенсивность флуоресценции в ответ на стимул, а F0 - интенсивность флуоресценции в состоянии покоя. F0 регистрировали перед каждой записью флуоресцентных сигналов в ответ на нервный стимул.
Статистическую значимость различий между выборками оценивали с использованием t-критерия Стьюдента и критерия Манна-Уитни. Различия между выборками считали статистически значимыми при р < 0.05 (n - количество исследованных синапсов).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Экзогенная ATP в концентрации 10 мкМ вызывала снижение амплитуды Са2+-транзиента в ответ на нервный стимул в среднем на 13.2 ± 1.9% (р = 0.0003, n = 8; рис. 1А,В). Увеличение концентрации ATP до 100 мкМ не повлияло на выраженность эффекта - Са2+-транзиент снижался на 13.6 ± 1.4% (р = 0.000003, n = 21) относительно контрольных значений (рис. 1В).
Сурамин - неселективный антагонист Р2-рецепторов - в дозе 300 мкМ увеличивал величину Са2+-транзиента в среднем на 20.5 ± 9.0% (р = 0.037, n = 8; рис. 1В) относительно значений в контрольных условиях. Добавление 100 мкМ ATP в среду, содержащую сурамин, не приводило к значимому изменению Са2+-транзиента, которое составило лишь 3.4 ± 3.1% (р = 0.27, n = 5; рис. 1Б,В). Таким образом, влияние ATP на амплитуду Са2+-транзиента связано с активацией Р2-рецепторов.
Специфический блокатор кальциевых каналов L-типа нитрендипин в концентрации 5 мкМ снижал амплитуду Са2+-транзиента на 12.4 ± 3.6% (р = 0.0003, n = 12; рис. 2), что свидетельствует о вкладе каналов L-типа в суммарный кальциевый ток, вызванный потенциалом действия (см. также [4]). Изменение амплитуды Са2+-транзиента под влиянием ATP в условиях блокады каналов L-типа составило всего 4.2 ± 1.1% (р = 0.016, n = 7; рис. 2), что значительно меньше собственного эффекта ATP (критерий Манна-Уитни, р = 0.011). Таким образом, блокада кальциевых каналов L-типа уменьшала сниже-
af/f0,%
10 мкМ 100 мкМ Сур + АТР Сур
АТР
Рис. 1. ATP снижает амплитуду Са2+-транзиента в результате активации Р2-рецепторов. А — снижение амплитуды транзиента при действии 10 мкМ ATP. Б — отсутствие снижения амплитуды Са2+-транзиента под влиянием ATP при наличии в среде сурамина. А, Б — усреднение 60 сигналов. В — влияние 10 и 100 мкМ ATP, сурамина (Сур) и ATP в присутствии сурамина на амплитуду Са2+-транзиента. За 100% приняты значения амплитуды транзиента в контроле (для ATP и сурамина) и при блокировании Р2-рецепторов сура-мином (для Сур + ATP). * p < 0.05
ние амплитуды Са2+-транзиента под действием ATP. Можно предположить, что активация пури-норецепторов ATP приводит к подавлению активности кальциевых каналов L-типа. Если это верно, то уменьшение амплитуды транзиента при действии нитрендипина должно быть менее выраженным в присутствии ATP. И действительно, нитрендипин не влиял на амплитуду Са2+-транзиента после предварительной аппликации ATP - изменение амплитуды составило лишь 2.0 ± 1.9% (n = 6; рис. 2).
Ранее мы показали, что экзогенная ATP в концентрации 100 мкМ уменьшала амплитуду Са2+-транзиента в равной степени в различных участ-
af/f0,%
ATP Нитр + ATP Нитр ATP + Нитр
Рис. 2. ATP снижает амплитуду Са2+-транзиента в результате блокирования каналов L-типа. ATP достоверно слабее уменьшает амплитуду транзиента после предварительной блокады каналов L-типа нитрен-дипином (Нитр + ATP). Нитрендипин per se снижает амплитуду транзиента (Нитр). *p < 0.05. Нитрендипин не влияет на амплитуду Са2+-транзиента в условиях активации Р2-рецепторов ATP (ATP + Нитр). **р<0.05 по критерию Манна—Уитни
ках протяженного нервного окончания лягушки [3]. Уменьшение транзиента при действии ATP соответствует снижению амплитуды вызванных ТКП при нормальном содержании кальция [1] и квантового состава ТКП в условиях сниженной концентрации ионов Са2+ в растворе [9]. Данные об ATP-индуцированном уменьшении входа ионов Са2+ внутрь терминали в ответ на нервный импульс согласуются с результатами работы [2], в которой показано обратимое снижение пресинаптического кальциевого тока под действием ATP.
Экзогенная ATP снижала амплитуду ТКП в результате активации пресинаптических P2Y-рецепторов, поскольку эффект предотвращался предварительной инкубацией препарата в сурами-не [1]. В наших экспериментах снижение амплитуды Са2+-транзиента при действии ATP также предотвращалось сурамином (рис. 1Б,В). При этом сам су-рамин вызывал увеличение Са2+-транзиента (рис. 1). Этот эффект может быть связан с возможностью увеличения концентрации ионов Са2+ в цитоплазме в результате его выхода из саркоплазматического ретикулума [10]. Показано, что сурамин увеличивает не только вероятность открытого состояния, но и проводимость одиночных рианодин-чувствительных каналов [11]. Увеличение амплитуды Са2+-транзиента под влиянием сурамина соответствует данным
102 | АСТА NATURAE | ТОМ 10 № 2 (37) 2018
об увеличении квантового состава ТКП при блокировании Р2-рецепторов [12].
Данные о влиянии ATP на потенциал-зависимые кальциевые каналы L-типа достаточно противоречивы. ATP в микромолярных концентрациях способна обратимо дозо-зависимым образом подавлять ток через Са2+-каналы L-типа в кардиомиоцитах [7]. В то же время активация пуринорецепторов способна усиливать вход ионов Ca2+ через каналы L-типа в перисинаптических глиальных клетках лягушки [6]. Полученные нами результаты показывают, что в снижение амплитуды Са2+-транзиента при действии ATP вносит вклад подавление активности Са2+-каналов L-типа. Об этом свидетельствует значительное снижение эффекта ATP на Са2+-транзиент в присутствии нитрендипина - специфического бло-катора каналов L-типа (рис. 2). Дополнительным под-
тверждением того, что в эффекты АТР вносят вклад Са2+-каналы L-типа, является отсутствие влияния их специфического блокатора нитрендипина на амплитуду транзиента после предварительного действия АТР (рис. 2). В этих условиях, когда активность Са2+-каналов L-типа уже снижена под действием АТР, у нитрендипина не остается мишеней для воздействия.
Результаты нашей работы свидетельствуют, что в угнетающем действии АТР на вход Са2+ в нервное окончание лягушки в ответ на нервный стимул существенную роль играет активность потенциал-зависимых кальциевых каналов L-типа.
Работа частично поддержана грантом РФФИ № 16-04-01051 А.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Sokolova E., Grishin S., Shakirzyanova A., Talantova M., Giniatullin R. // Eur. J. Neurosci. 2003. V. 18. P. 1254-1264.
2. Grishin S., Shakirzyanova A., Giniatullin A., Afzalov R., Giniatullin R. // Eur. J. Neurosci. 2005. V. 21. P. 1271-1279.
3. Khaziev E., Golovyahina A., Bukharaeva E., Nikolsky E., Samigullin D. // BioNanoSci. 2017. V. 7. P. 254-257.
4. Tsentsevitsky A.N., Samigullin D.V., Nurullin L.F., Khaziev E.F., Nikolsky E.E., Bukharaeva E.A. // Frogs: genetic diversity, neural development and ecological implications / Ed. Lambert H. New York: NOVA Pupl., 2014. P. 179-194.
5. Khaziev E., Samigullin D., Zhilyakov N., Fatikhov N., Bukharaeva E., Verkhratsky A., Nikolsky E. // Front. Physiol. 2016. V. 7. P. 621. doi: 10.3389/fphys.2016.00621. eCollection 2016.
6. Robitaille R. // J. Neurosci. 1995. V. 15. P. 7121-7131.
7. Yamamoto T., Habuchi Y., Nishio M., Morikawa J., Tanaka H. // Cardiovascular Res. 1999. V. 41. P. 166-174.
8. Samigullin D.V., Khaziev E.F., Zhilyakov N.V., Bukharaeva E.A., Nikolsky E.E. // J. Vis. Exp. 2017. V. 125. P. 55122.
9. Tsentsevitsky A., Nikolsky E., Giniatullin R., Bukharaeva E. // Neuroscience. 2011. V. 189. P. 93-99.
10. Emmick J.T., Kwon S., Bidasee K.R., Besch K.T., Besch H.R. Jr // J. Pharmacol. Exp. Ther. 1994. V. 269. P. 717-724.
11. Hill A.P., Kingston O., Sitsapesan R. // Mol. Pharmacol. 2004. V. 65. № 5. P. 1258-1268.
12. Sugiura Y., Ko C.P. // Neuroreport. 2000. V. 11. № 13. P. 3017-3021.
