CC BY
407
УДК 531/534: [57+61]
АТОМНО-СИЛОВАЯ МИКРОСКОПИЯ СТРУКТУРНО-МЕХАНИЧЕСКИХ СВОЙСТВ МЕМБРАН ЭРИТРОЦИТОВ
Е.С. Дрозд1, С.А. Чижик1, Е.Э. Константинова2
1 Институт тепло- и массообмена Национальной академии наук Беларуси, Беларусь, 220072, Минск, ул. П. Бровки, 15, e-mail: drozd.elizaveta@gmail.com
2 Республиканский научно-практический центр «Кардиология» Министерства здравоохранения Беларуси, Беларусь, 220036, Минск, ул. Р. Люксембург, 110.
Аннотация. Проведен анализ морфологии и упругих свойств клеток крови методом атомно-силовой микроскопии. Выполнены количественные оценки модуля упругости клеточной мембраны в режиме силовой спектроскопии. Установлены значения модуля упругости эритроцитов в зависимости от локализации области индентирования и времени воздействия зондом на поверхность мембраны. Показана существенная зависимость результатов оценки модуля упругости от скорости воздействия индентором на клеточную мембрану. Обсуждается необходимость регламентирования условий измерений для получения сопоставимых количественных оценок.
Ключевые слова: эритроцит, атомно-силовая микроскопия, силовая
спектроскопия, модуль упругости.
Введение
Атомно-силовая микроскопия (АСМ) является одним из инструментов, обеспечивающих получение пространственного изображения поверхности с разрешением, близким к атомарному. Кроме того, АСМ успешно используется для количественной оценки локальных упругих и адгезионных свойств поверхности [6, 10]. При исследовании биологических объектов с помощью АСМ возникают определенные сложности в реализации методик и интерпретации данных, преодоление которых позволяет получить уникальную информацию о топографии поверхности мембраны и ее механических свойствах, а также об изменениях в структуре цитоскелета во время движения клеток, о перемещениях двигательных белков и других фундаментальных клеточных процессах [9]. В настоящее время получены АСМ-изображения ДНК, РНК, бактерий и вирусов, а также тканей и даже органов [12, 18-20].
В качестве объекта данного исследования были выбраны эритроциты - клетки, имеющие форму двояковогнутого диска диаметром 7,2-7,5 мкм с отклонениями в обе стороны для большинства не более 0,5 мкм и толщиной 2 мкм. Концентрация этих форменных элементов крови и их свойства (деформируемость, склонность к агрегации) относятся к факторам, которые во многом определяют реологические свойства крови. Так, способность эритроцитов к деформации является важнейшим реологическим феноменом, позволяющим данным клеткам доставлять необходимые для жизнедеятельности организма вещества по сосудистой системе, включающей капилляры, диаметр которых достигает 2 мкм [1, 7]. Результаты исследований © Дрозд Е.С., Чижик С. А., Константинова Е.Э., 2009
Дрозд Елизавета Сергеевна, аспирант, Лаборатория нанопроцессов и технологий, Гомель Чижик Сергей Антонович, чл.-корр. НАНБ, д.т.н., завлаб нанопроцессов и технологий, Гомель Константинова Елена Эриховна, к.б.н., завлаб клинической гемореологии и микроциркуляции, Гомель
свидетельствуют о том, что изменения гемореологии приводят к нарушению кровотока и снижению эффективности транспортной функции микроциркуляторной системы. Поэтому оценка реологических свойств клеток крови важна с точки зрения как выявления особенностей течения заболеваний, так и повышения эффективности лечения [16]. В настоящее время в клинической практике для определения деформируемости и способности эритроцитов к агрегации в суспензии используются интегральные методы, которые не позволяют оценить состояние отдельной клетки. Такие оценки возможны с помощью атомно-силовой микроскопии, которая позволяет исследовать форму отдельной клетки, топографию поверхности ее мембраны и эластичность. В частности, при помощи функции силовой спектроскопии можно локально оценить модуль упругости при воздействии индентора на участок клетки площадью вплоть до нескольких нанометров.
Метод оценки упругих свойств материалов в поверхностных слоях заключается в измерении их способности противостоять внедрению с заданной нагрузкой жесткого индентора. Известно, что деформационное поведение эластомеров (вязкоупругих полимерных материалов) в значительной степени определяется временем и скоростью деформирования [2, 8]. Это предопределяет методологические сложности в
определении механических характеристик биологических мембран: трудно создать эталонные образцы, измеряемые значения характеристик биологических объектов зависят от скорости движения индентора при нагружении и времени нахождения индентора в контакте [5].
Выбор эритроцитов в качестве объекта данного исследования обусловлен тем, что данные клетки являются сравнительно простыми и легко доступными и в то же время эритроцитарным мембранам присущи общие принципы организации
биологических мембран [4]. Поэтому их удобно использовать при разработке методик клеточной эластографии в качестве естественной модели для изучения общих
структурно-функциональных характеристик мембран, а также изменений их механических свойств при различных заболеваниях [14].
В связи с вышеизложенным цель настоящей работы - определить особенности применения АСМ для оценки упругих и вязкоупругих свойств биологических мембран красных клеток крови.
Подготовка образцов
Для проведения исследований использовали кровь практически здоровых лиц, обследованных в Республиканском научно-практическом центре «Кардиология» (г. Минск). Каплю венозной крови, предварительно стабилизированной гепарином, фиксировали в пробирке с 1,5% раствором глутарового альдегида. Затем эритроциты отделяли от плазмы путем центрифугирования в течение 3 мин при 1500 об/мин. Полученный эритроцитарный осадок трехкратно отмывали от фиксатора в буферном растворе, а затем три раза - в дистиллированной воде. После этого эритроциты наносили на предметные стекла размером 10*10 мм и высушивали на воздухе при комнатной температуре.
Методы исследования
Исследование геометрии, структуры поверхности и упругих свойств мембраны эритроцитов осуществляли при помощи специализированного экспериментального комплекса (рис. 1), совмещающего функции сканирующей зондовой и оптической микроскопии.
Данный комплекс состоит из атомно-силового микроскопа N1-206 с возможностями микропозиционирования зонда над образцом в пределах площадки
Рис. 1. Экспериментальный комплекс, совмещающий функции атомно-силовой и оптической
микроскопии
Рис. 2. Пространственное АСМ-изображение эритроцитов: а - область сканирования 15*17 мкм;
б - область сканирования 7,4*7,3 мкм
10*10 мм (ОДО «Микротестмашины», Беларусь) и оптической системы (НПРУП «ЛЭМТ» БелОМО, Беларусь). АСМ-сканирование проводили стандартными кремниевыми зондами N501 («MikroMasch» Со., Эстония) в контактном режиме с одновременной регистрацией изображений топографии и латеральных сил. При экспериментальном исследовании первоначально регистрировалось оптическое изображение клеток на стеклянной подложке. Затем с помощью механической системы микропозиционирования при оптическом контроле положения зонда в плоскости образца выбирался участок для АСМ-измерений. Дальнейшее уменьшение участка визуализации объекта в пределах характерных размеров скана от 30 до 0,5 мкм проводилось с помощью пьезоэлектрического сканера АСМ (рис. 2, а, б и рис. 3).
Для оценки упругих свойств мембраны клеток использовался метод статической силовой спектроскопии [21]. Функция силовой спектроскопии является стандартным режимом работы атомно-силового микроскопа. Суть метода состоит в реализации контактного деформирования исследуемого объекта острием зонда и в измерении зависимости силы взаимодействия зонда с поверхностью образца от расстояния между ними [6]. При реализации процедуры статической силовой спектроскопии консоль зонда не совершает вынужденных колебаний и занимает статическое положение в точке закрепления.
1,8 мкм*1,8 мкм*46,6 нм [238x238] ^ нм
1,8 мкм><1,8 мкмх 1 1
2, нм
Л
30 1 5
24
ш
X, мкм
а
X, мкм
б
Рис. 3. Структура поверхности мембраны эритроцита: а - режим топографии; б - режим
латеральных сил
Для определения модуля упругости исследуемого образца используется решение контактной задачи теории упругости. При численном анализе результатов измерения чаще всего применяют модель Герца. Данная модель описывает контакт сферических тел и предполагает, что материалы соприкасающихся тел однородны и изотропны, нагрузка вызывает в зоне контакта только упругие деформации, площадка контакта мала по сравнению с поверхностями контактирующих тел, а силы давления нормальны к поверхности соприкосновения (силами трения пренебрегают) [6, 11].
В контактных задачах используют приведённый модуль упругости Е:
Е =
1 -V
2 Л-
Е
(1)
2 У
где у1, Е1, у2, Е2 - коэффициенты Пуассона и модули упругости материалов исследуемого образца и острия зонда (индентора) соответственно. Если модуль упругости индентора во много раз превышает модуль упругости исследуемого материала (в исследуемом случае примерно на три порядка), то выражение (1) примет вид
Е =
Е
(2)
Таким образом, для расчета локального модуля упругости в точке исследуемой поверхности, исходя из теории Герца, можно использовать следующую формулу [8]:
Е = 3 (1 -V2 ї-^— 4і 'я 7
V
2
defl
, 3/2
(3)
где Я - радиус закругления острия зонда, к - коэфициент жесткости консоли зонда, 2роя -положение зонда относительно начального положения и - величина изгиба консоли зонда.
Процедуру статической силовой спектроскопии выполняли кремниевым зондом после некоторого «затупления» острия. Радиус закругления острия составлял около 60 нм (определялся путем сканирования тестового образца), а коэффициент жесткости консоли - 3 Н/м (согласно спецификации производителя зондов).
Результаты исследования и обсуждение
В результате сканирования образца были получены изображения топографии поверхности мембран эритроцитов, а также пространственной структуры цитоскелета красных клеток крови в контрасте изображения латеральных сил. На рис. 3 представлен участок поверхности мембраны размером 1,8* 1,8 мкм2. Именно при сканировании участков мембраны клетки размером 1-2 мкм существует возможность оценить ее структуру, а также обнаружить приповерхностную структуру цитоскелета клетки. Более отчетливо сетчатая структура цитоскелета проявляется в режиме латеральных сил [3, 13]. Характерный размер ячеек, образуемых элементами цитоскелета, составляет 50-70 нм.
Таким образом, АСМ-изображения позволяют сравнить морфологию клеток, а также оценить структурные особенности их мембран, при некоторых патологиях.
Другой важной возможностью АСМ-анализа клетки является оценка ее локальных механических свойств. Применение методик силовой спектроскопии в данном случае имеет ряд принципиальных особенностей. Одним из факторов, который необходимо учитывать при анализе абсолютных значений модуля упругости, является толщина клетки в точке индентирования. Поэтому при исследовании упругих свойств эритроцитов важно установить, влияет ли выбор области внедрения зонда на определяемые механические свойства клеток, поскольку толщина клетки на периферии значительно превосходит толщину центральной части (для фиксированных на подложке клеток толщина центральной части около 0,5 мкм, в периферической области может превышать 2,0 мкм.). Влияние жесткой подложки на величину оцениваемого модуля упругости зависит от соотношения между глубиной индентирования и толщиной клетки. Считается, что этим влиянием можно пренебречь, если глубина индентирования не превышает 10% от толщины исследуемого объекта [20]. В нашем эксперименте глубина проникновения зонда была сопоставима с толщиной клеточной мембраны и не превышала 7 нм, что составляло 0,4% периферической и 1,4% центральной толщины эритроцита. На рис. 4, а представлена зависимость модуля упругости от глубины внедрения для различных областей клетки. Процедуру силовой спектроскопии проводили на воздухе, спустя один час после приготовления образца. Исследовались эритроциты пяти здоровых лиц, для каждого донора были проведены измерения на десяти различных клетках, по три внедрения зонда в центральную часть и
500 400 с 300 кі 200 100
ш А • Б
0 12 3 4 5 6 7
Глубина внедрения, нм
СЗ
С
-Г*-
0 1
Глубина внедрения, нм
б
Рис. 4. Результаты статической силовой спектроскопии для различных областей эритроцита: а - зависимость модуля упругости от глубины внедрения острия зонда; б - зависимость локального модуля упругости от глубины внедрения острия зонда после статистического осреднения результатов. А - периферическая область, Б - центральная
область эритроцита
а
столько же в периферическую часть клетки. Значение модуля упругости оценивалось при различных глубинах внедрения индентора, последовательно от 1 нм до 7 нм. При статистической оценке локального модуля упругости выбирали реперные точки, для которых находили среднее значение модуля упругости и отклонение от среднего. По выбранным точкам были построены статистически усредненные графики зависимости локального модуля упругости от глубины индентирования для различных областей (рис. 4, б). Установлено, что зависимость модуля упругости от глубины внедрения индентора является нелинейной. При этом в начале деформирования наблюдается более высокое сопротивление клетки воздействию зонда, а затем медленное уменьшение во времени до некоторого фиксированного значения. Сравнительный анализ упругих свойств клеточной мембраны в периферической и центральной областях клетки показывает, что значения локального модуля упругости для различных частей клеточной мембраны достоверно различаются только на глубине внедрения, равной 3,12 ± 0,029 нм (р < 0,02). В целом же можно заключить, что при проведении эксперимента в течение двух часов после приготовления образца, зондом с большим радиусом закругления (более 60 нм) результаты проведения процедуры силовой спектроскопии не зависят от области внедрения зонда.
Рис. 5. График зависимости нагрузки от глубины внедрения для мембраны эритроцита при различных скоростях индентирования: ■ - 3GG нм/с, о - 3G нм/с, + - 15 нм/с, • - 1 нм/с
Л
С
ui
Ой
О
10
10
ю9
108
10
■ 300 нм/с + 15 нм/с
ООО
10
15
20
25
30
о 30 нм/с • I нм/с
35
40
Глубина внедрения, нм
Рис. 6. Результаты расчета модуля упругости для мембраны эритроцита при различных скоростях индентирования: ■ - 3GG нм/с, о - 3G нм/с, + - 15 нм/с, • - 1 нм/с
Для оценки изменений упругости клеток в зависимости от времени нагружения проводилась процедура силовой спектроскопии при различных скоростях движения столика с образцом в направлении к зонду (300, 30, 15 и 1 нм/с). Индентирование выполнялось на воздухе, спустя один час после приготовления образца в периферической области клетки с выбранной скоростью, и при этом регистрировалась величина изгиба консоли. Таким образом, обеспечивалось деформирование образца с различной скоростью.
Было обнаружено, что при уменьшении скорости нагружения эритроцитарной мембраны упругое сопротивление клетки механическому деформированию возрастает, т.е. рассчитанное значение модуля упругости увеличивается, соответственно, уменьшается предельная глубина внедрения зонда (рис. 5, 6), которую можно обеспечить для консоли с выбранной жесткостью. Так, значение модуля Юнга на глубине внедрения 5 нм при скорости перемещения образца, равной 1 нм/с, выше, чем при 30 нм/с и при 300 нм/с в 4,5 и 15,6 раз, соответственно. Таким образом, можно говорить о существовании зависимости упругих свойств от скорости деформирования клетки, т. е. о ее вязкоупругом поведении. Полученные результаты согласуются с данными исследования механических свойств отдельных эритроцитов с помощью оптического пинцета, согласно которым клетки проявляют вязкоупругие свойства при сильной упругой деформации [17].
Результаты оценки структурно-механических свойств красных клеток крови указывают на то, что для данных клеток вопрос выбора области индентирования не является существенным, если при проведении эксперимента исключать влияние подложки. А это возможно, если глубина внедрения зонда не превышает 10 % толщины клетки. Кроме того, существует зависимость модуля упругости от глубины внедрения зонда, которая может быть объяснена неоднородностью свойств исследуемых объектов, а также определенным влиянием изменения латерального натяжения мембраны в зависимости от величины деформирования липидного бислоя. Также для красных клеток крови экспериментально установлена прямая зависимость между значением модуля Юнга и временем нагружения. Однако механизм такого поведения эритроцитарной мембраны до конца неясен.
Следует также отметить, что исследования механических свойств клеток проводились на воздухе, после высушивания на подложке, что, безусловно, приводило к снижению эластичности их мембран, увеличению сопротивления деформированию и, как следствие, увеличению измеряемого модуля упругости. Кроме того, требуется более адекватно использовать модель контактного деформирования, которая бы описывала используемую экспериментальную схему нагружения клетки и учитывала ее «конструкцию» оболочечного типа. Поэтому измеренные значения модуля упругости должны рассматриваться как оценочные, а полученные зависимости в большей степени как качественные, нежели количественные.
Заключение
Проведенные исследования раскрывают методологические особенности применения атомно-силовой микроскопии, и в частности, процедуры статической силовой спектроскопии для оценки локальных механических свойств клетки. Результаты исследований указывают на существенность выбора скорости контактного воздействия индентором на поверхность мембраны эритроцитов при оценке их эластичности. На основании полученных данных можно говорить о том, что оцениваемые свойства мембраны клетки в значительной степени зависят от соотношения продолжительности релаксационных переходов и длительности временного воздействия при испытаниях. Явления вязкоупругого поведения клетки требуют дальнейшего изучения, поскольку обнаруженный механизм прямой
зависимости модуля упругости от скорости нагружения биологической мембраны до конца неясен.
Результаты определения механических свойств мембраны эритроцитов могут значительно отличаться, что вызвано отсутствием единообразия в условиях измерений, и следовательно, затрудняет количественный анализ и сравнение результатов исследований. Для получения сопоставимых результатов необходимо строго придерживаться методологических ограничений по выбору условий эксперимента и обязательного указания методики определения характеристик, согласно которой они были рассчитаны.
Таким образом, при строгом регламентировании условий измерений АСМ позволяет проводить количественную оценку механических свойств клеток, что, в свою очередь, открывает широкие возможности для исследований биологических объектов в нанометровом масштабе и развития новой области биомеханики - клеточной эластографии.
Список литературы
1. Мчедлишвили, Г.И. Микроциркуляция крови / Г.И. Мчедлишвили. - Л.: Наука. 1989.
2. Рудницкий, ВА. Испытание эластомерных материалов методами индентирования / В.А. Рудницкий, П. А. Крень. - Минск: Бел. наука, 2007.
3. Стародубцева, М.Н. Микроскопия латеральных сил клеточных структур / М.Н. Стародубцева, Н.И. Егоренков // Методологические аспекты сканирующей зондовой микроскопии: сб. докл. VII Междунар. семинара, Минск, 8-10 октября 2008. - С.102-107.
4. Черницкий, ЕА. Структура и функции эритроцитарных мембран / Е.А. Черницкий, А.В. Воробей. -Минск: Наука и техника, 1981.
5. Betz, Th. Conformational change of membrane proteins leads to shape changes of red blood cells / Th. Betz // Bioelectrochemistry. - 2007. - Vol. 70, No. 1. - Р. 122-126.
6. Burnham, NA. Measuring the nanomechanical properties and surface forces of materials using an atomic force microscope / N.A. Burnham, R.J. Colton // J. Vac. Sci. Technol. - 1989. - Vol. A7. - P. 2906-2913.
7. Chien, S. What is clinical haemorheology? / S. Chien // Royal Society of Medicine Services Limited. International Congress and Symposium Series: Clinical haemorheology: A new approach to Cerebrovascular disease. - 1986. - Vol. 100. - P. 3-9.
8. Chizhik, SA. Micromechanical properties of elastic polymeric materials as probed by scanning force microscopy / S.A. Chizhik, Z. Huang, V.V. Gorbunov // Langmuir. - 1998. - Vol. 14. - P. 2606-2609.
9. Czajkowsky, DM. Atomic force microscopy in structural biology: from the subcellular to the submolecular / D.M. Czajkowsky, H. Iwamoto, Zh. Shao // Journal of Electron Microscopy. - 2000. - Vol. 49, No. 3. -P. 395-406.
10. Fischer-Cripps, A.C. Nanoindentation / A.C. Fischer-Cripps. - Springer-Verlag: New York, 2004.
11. Hertz, H. Ueber den kontakt elastischer Koerper / H. Hertz // J. fuer die Reine Angewandte Mathematik. -1881. - Vol. 92. - P. 156-164.
12. Kasas, S. Biological applications of the AFM: from single molecules to organs / S. Kasas, N.H. Thomson, B.L. Smith, P.K. Hansma, J. Miklossy, H.G. Hansma // J. of Nanoindentation. - 1997. - Vol. 8. - P. 151161.
13. Kuznetsova, T.G. Atomic force microscopy probing of cell elasticity / T.G. Kuznetsova, M.N. Starodubtseva, M.N. Yegorenkov, S.A. Chizhik, R.I. Zhdanov // Micron. - 2007. - Vol. 38. -P. 824-833.
14. Lee, G.Y.H. Biomechanics approaches to studying human diseases / G.Y.H. Lee, C.T. Lim // Trends Biotechnol. - 2007. - Vol. 25 (3). - P. 111-118.
15. Mathur, A.B. Endothelial, cardiac muscle and skeletal muscle exhibit different viscous and elastic properties
as determined by atomic force microscopy / A.B. Mathur, A.M. Collinsworth, W.M. Reichert, W.E. Kraus,
G.A. Truskey // Journal of Biomechanics. - 2001. - Vol. 34. - P. 1545-1553.
16. Meiselman, H.J. Measures of blood rheology and erythrocyte mechanics // Erythrocyte mechanics and blood flow / H.J. Meiselman, G.R. Cokelet, D.E. Brooks. - Liss: New York, 1980.
17. Mills, J.P. Nonlinear elastic and viscoelastic deformation of the human red blood cell with optical tweezers / J.P. Mills, L. Qie, M. Dao1, C.T. Lim, S. Suresh // Mech. Chem. Biosyst. - 2004. - Vol. 1(3). - P. 169-180.
18. Morris, VJ. Atomic force microscopy for biologists / V.J. Morris, A.R. Kirby, A.P. Gunning. - Imperial College Press, 1999.
19. Ohta, Y. The atomic force microscope: a new tool for artificial organ research / Y. Ohta, H. Okamoto,
T. Okuda, T. Horiuchi // J. of Artificial Organs. - 1999. - Vol. 2. - P. 131-134.
20. Radmacher, M. Studying the mechanics of cellular processes by AFM / M. Radmacher // Methods in Cell Biology. - 2007. - Vol. 83. - P. 91-189.
21. Sirghi, L. Probing elasticity and adhesion of live cells by atomic force microscopy indentation / L. Sirghi, J. Ponti, F. Broggi // Eur. Biophys. J. - 2008. - Vol. 37. - P. 935-945.
ATOMIC FORCE MICROSCOPY OF STRUCTURAL AND MECHANICAL PROPERTIES OF RED BLOOD CELL MEMBRANES
E. Drozd, S.A. Chizhik, E.E. Konstantinova (Minsk, Belarus)
Morphology and elastic properties of blood cells were analyzed using atomic force microscopy. The quantifications of the cell membrane elastic modulus in the force spectroscopy mode were carried out. We measured the elastic modulus of the red blood cells depending on the localization of the indentation area and the time of probe action on the membrane surface. It is shown, that the modulus estimation depends on the velocity of the indenter action on the cell membrane. To obtain comparable quantitative estimations one needs to regulate the measurement conditions.
Key words: red blood cell, atomic force microscopy, force spectroscopy, module of elasticity.
Получено 7 ноября 2009
