CC BY
53
УДК 531/534: [57+61]
СТРУКТУРА И УПРУГИЕ СВОЙСТВА ХРЯЩА НА МИКРО- И НАНОУРОВНЕ
С.А. Чижик1, А.В. Трушко1, К. Вежхольский2
1 Институт тепло- и массообмена им. А.В. Лыкова Национальной академии наук Беларуси, Беларусь, 220072, Минск, ул. П. Бровки, 15, e-mail: chizhiksa@mail.by
2 Department of Basic Engineering, Gdynia Maritime University, Morska 83, PL-81-225, Gdynia, Poland, e-mail: wierzch@pg.gda.pl
Кафедра основ инженерии, Морской Университет г. Гдыни, Гдыня, Польша
Аннотация. Представлены результаты исследования модуля упругости хрящевой ткани методом микро- и наноиндентирования, реализованным на базе атомносилового микроскопа. В качестве объектов исследования использовались макросрезы свиного хряща в радиальном и латеральном направлениях соответственно, с ориентацией коллагеновых волокон в структуре исследуемой ткани. Методами сканирующей электронной микроскопии и атомно-силовой микроскопии визуализирована топография поверхностных слоев цельного хряща и его срезов, которая коррелирует с особенностями ориентационного расположения коллагеновых волокон. Описана методика и проведены количественные оценки значений модуля упругости при использовании микроиндентора (радиус закругления 350 мкм, глубина индентирования до 600 нм) и наноиндентора (радиус закругления 30 нм, глубина индентирования до 120 нм). Обнаружен различный характер деформирования в зависимости от ориентации коллагеновых волокон по отношению к направлению деформирования, а также от масштаба локализации зоны контакта (нано- и микроуровень). Показана высокая стабильность поведения хряща под нагрузкой в том случае, когда в процессе деформирования участвует цельная композиционная структура хрящевой ткани.
Ключевые слова: хрящевая ткань, структура хряща, коллагеновые волокна, методы микроскопии, микроуровень, наноуровень, индентор, модуль упругости.
Введение
Исключительно высокая надежность и долговечность синовиальных суставов как природных элементов передачи давления и трения напрямую определяется их комплексной структурой, обеспечивающей высокую несущую способность и чрезвычайно низкий коэффициент трения [7]. Уникальность свойств хряща привлекает внимание инженеров и ученых как превосходный, хотя пока и недостижимый прототип для материаловедческих решений при проектировании узлов трения в машиностроении и роботостроении, а также искусственных суставов. Механизмы деформирования и трения хряща синовиального сустава широко описаны в научной литературе, однако до настоящего времени единой общепризнанной теории трения не существует [1, 2, 6, 11].
Достаточно подробно исследована сложная структура хрящевой ткани,
© Чижик С.А., Трушко А.В., Вежхольский К., 2008
09806267
Радиальная плоскость Латеральная плоскость
зона
ПТсть
^Тангециальная зона / Промежуточная
Радиальная зона
Линия кальцификации ) Кальцифицированная зона ' Субхондральная зона
Мозговое вещество
а
Ограничение коллагеновой сетки '
Расширение
матрикса
б
Рис. 1. Структура хрящевой ткани: (а) микроуровень с выделением зон неоднородности; (б) расположение наноразмерных компонентов
представляющая собой пористую матрицу из расположенных особым образом коллагеновых волокон и заполненную жидкостью, содержащей компоненты электростатически заряженных протеогликанов и обеспечивающей осмотическое давление в ткани, а также небольшое количество гиалуроновой кислоты с высокими защитными и антифрикционными свойствами (рис. 1). Методами микроскопии показано отчетливо выраженное иерархическое (многомасштабное) и анизотропное строение коллагенового каркаса (рис. 1, а) с нанометровым размером основных конструкционных элементов (диаметр коллагеновых волокон 10-100 нм). В поверхностном слое коллагеновые волокна располагаются параллельно (латерально) поверхности хряща, а во внутренних - расположение близко к перпендикулярному по отношению к кости и поверхности хряща, т.е. радиально (рис. 1, б).
В ненагруженном суставном хряще натяжение коллагеновой сети уравновешено осмотическим давлением протеогликанов. Следовательно, коллагеновый каркас,
выполняя структурную, стабилизирующую функцию по отношению к протеогликанам и воде, а также регулируя степень гидратации хрящевой ткани, обладает большой упругостью по отношению к силам растяжения.
Можно указать ряд работ [8, 10, 12], посвященных исследованию упругого и вязкоупругого деформирования суставного хряща при его сжатии в миллиметровом масштабе. Упругость хрящевой ткани в макроскопическом объеме может оцениваться даже в клинических условиях во время артроскопической операции [9]. Обобщающий анализ результатов [10], полученных в различных работах, показывает существенные различия в значениях модулей упругости, которые объясняются явно выраженной зависимостью вязкоупругих свойств хряща от времени силового воздействия и отмеченной неоднородностью его строения, при условии, что эксперименты проводились как при кратковременных, так при и длительно действующих нагрузках, а также в условиях сжатия, растяжения и сдвига хрящевой ткани.
Для полного понимания механического поведения хряща важно измерить механические свойства основных компонентов его структуры, например коллагеновых волокон диаметром несколько десятков нанометров. Интересным является рассмотрение поведения волокон, встроенных в цельную структуру хряща, в зависимости от их ориентирования в каркасе. Количественная оценка упругости суставного хряща на наноуровне пока не является тривиальной процедурой. По-видимому, наиболее приемлемым способом таких оценок может быть использование метода атомно-силовой микроскопии в режиме силовой спектроскопии [4, 5], при реализации которого существует возможность прикладывать минимальные сжимающие усилия, начиная с нескольких наноньютонов, к площадкам размером в несколько нанометров посредством касания исследуемой поверхности наноиндентором с радиусом закругления 10-50 нм.
Целью работы является качественный анализ процесса деформирования хрящевого материала на наноуровне при ориентировании коллагеновых волокон вдоль и поперек направления локального нагружения в сравнении с деформированием на микроуровне, когда в процесс вовлекается интегральная структура хрящевой ткани. Предполагается, что исследования позволят уточнить механизм влияния наноструктуры хряща на механические свойства и объяснить природу его высокой несущей способности.
Объект и методика исследования
В качестве объекта исследования были выбраны срезы свиного суставного хряща бедренной кости, выполненные в радиальном и латеральном направлениях, а также поверхность скольжения цельного хряща (см. рис. 1, а). Подготовка образцов выполнялась следующим образом. Сначала срезали острым лезвием две пластинки суставного хряща с поверхности бедренной кости (размером 5*5*2 мм). Затем этим же лезвием выполнили латеральные и радиальные срезы одной из пластинок (размером ~5*2*0,5 мм). Готовые образцы некоторое время хранились при температуре -12 °С.
Поверхностная структура образцов хряща контролировалась методами микроскопии: сканирующей электронной (СЭМ) и атомно-силовой (АСМ). Во втором случае кроме пространственной визуализации топографии, коррелирующей с коллагеновой структурой материала в поверхностном слое, АСМ позволяет измерять параметры шероховатости поверхности образца.
Для исследования механических свойств образцов также использовался АСМ НТ-206 (ОДО «Микротестмашины», Беларусь) [14]. На базе стандартной схемы АСМ (рис. 2, а) была реализована процедура статической силовой спектроскопии.
а
І
в г
Рис. 2. Схема реализации методики индентирования на базе АСМ: (а) принципиальная схема АСМ с оптической схемой регистрации отклонений зонда [3]; (б) геометрическая схема расчета модуля упругости; (в) острие-индентор для измерений на наноуровне;
(г) шаровой индентор для измерений на микроуровне
При выполнении процедуры силовой спектроскопии острие зонда, закрепленное на свободном крае гибкой микроконсоли, размещается над исследуемой точкой поверхности образца с высокой точностью (до 10 нм). Далее образец перемещается с помощью сканера вертикально по направлению к зонду с контролем шага перемещения с точностью менее 1 нм (подвод). Затем осуществляется движение образца в обратном направлении (отвод). При режиме статической силовой
спектроскопии консоль зонда не совершает колебательных движений и регистрируется величина изгиба микроконсоли в зависимости от положения зонда 7роя. Данные представляются в виде так называемой кривой подвода-отвода. Изгиб консоли зонда жесткостью к после касания острием образца определяет приложенную силу
Р = к7с1ф . (1)
Глубина деформирования материала в точке индентирования
Н Хро5 - . (2)
Расчет модуля упругости проводится из условия равновесия изогнутой консоли и упруго-деформированного острием зонда материала (рис. 2, б). Учитывая формулы (1) и (2) и предполагая, что материал острия зонда является намного более жестким по сравнению с исследуемым материалом и острие зонда имеет сферическую форму, из модели Герца получим выражение для искомого локального модуля Юнга в точке исследуемой поверхности 1
г 3 (л 2^ к Х
1 = 4( -У ' Я1/2 Т 7 ). ( )
Л \7ро5 7аеА)
Здесь Я - радиус закругления острия, V - коэффициент Пуассона хряща, который принимался равным 0,5.
Конструкция АСМ позволяет провести исследования для двух случаев, которые отличаются лишь заменой зонд-индентора. Для измерений на наноуровне использовался коммерческий зонд СБС-38 с острием из кремния радиусом Я = 30 нм и жесткостью консоли к = 0,08 Н/м (рис. 2, в). Для измерений на микромасштабе в качестве индентора использовался микрошарик из подшипниковой стали (Я = 350 мкм), закрепленный на стальной консоли жесткостью к = 11 Н/м. В первом случае зона контакта составляет несколько нанометров и намного меньше поперечного сечения коллагеновых волокон. Во втором - площадка контакта составляет несколько микрометров и намного превышает характерные размеры наноэлементов структуры хряща.
Результаты исследования и их обсуждение
На рис. 3 приведены результаты исследования топографических структур поверхностей образцов с помощью СЭМ и АСМ. На фоне общего рельефа отчетливо различимы лакуны - места залегания хрящевых клеток (хондроцитов). СЭМ изображения дают панорамное представление о структурном строении поверхности и слоев хряща, АСМ позволяет различить отдельные коллагеновые фибриллы и провести измерения высотных и латеральных размеров. Так, для профильного сечения, обозначенного на АСМ изображении (рис. 3, а), диаметр волокна достигает 100 нм. Результаты АСМ сканирования, по существу, повторяют результаты исследования с помощью СЭМ. На поверхности скольжения цельного хряща мы видим тесно прилежащие друг к другу четкие пучки коллагеновых волокон, которые ориентированы параллельно поверхности хряща.
Расположение пучков этих волокон формирует рельеф поверхности суставного хряща, который имеет регулярную волнистость. Можно отметить, что для поверхности радиального сечения также наблюдается волокнистая ориентированная структура с более плотным залеганием лакун, т.е. хондроцитов. Поверхность латерального сечения
(1) СЭМ данные
а
б
(2) АСМ данные
У, мкм Размеры матрицы 256 х 256
-------
2, нм 40 30 20 10 0 -10 20 30 -40 -50 60 ■70
0 1----
0 1 2 X, мкм
У, мкм Размеры матрицы 256 х 256 2, нм
10 мкм 1 Кассета 2000 X Высота = 8 мм Напряж. = 20 кВ Дата: 30 Марта 2006
Фото № 9589 Время: 10:25:50
1 х
13
9
5
I1
| -11
15
0
1
X, мкм
У, мкм Размеры матрицы 256 х 256
10 мкм 1 1 Кассета 1000 X Высота = 8 мм Напряж. = 20 кВ Дата: 30 Марта 2006 0
Фото № 9588 Время: 10:23:41
2 3 4
X, мкм
Рис. 3. Результаты исследования поверхностей образцов методом СЭМ (столбец 1) и методом АСМ (столбец 2) для различных срезов хряща: а - цельная поверхность; б - радиальный срез; в - латеральный срез. Масштаб для СЭМ изображений имеет значения: а - 100 мкм; б - 10 мкм; в - 10 мкм. Размер поля сканирования для АСМ изображений: а - 2,2*2,2 мкм; б - 1,7*1,7 мкм; в - 5,2*5,2 мкм
значительно отличается от предыдущих случаев. Фоновый рельеф не обнаруживает отчетливой коллагеновой сети и имеет более плотное расположение лакунообразных
в
углублений. Такое соотношение «картин» поверхностей является ожидаемым, поскольку для поверхности цельного хряща и его радиального сечения коллагеновые волокна, согласно схематическому изображению структуры, расположены именно в плоскости анализируемых поверхностей. В третьем случае волокна, ориентированные в плоскости среза, не обнаруживаются. Что касается латеральных срезов, то здесь естественно было бы ожидать увидеть поперечные сечения волокон и фибрилл. Возможно, высокая плотность углублений в данном случае обусловлена не только расположением хондроцитных лакун, а «ямками», образующимися в точке среза волокон из-за различия в растяжении и сжатии участков срезанных волокон и их окружения.
В результате анализа данных микро- и наноиндентирования были получены зависимости модуля Юнга Е от глубины проникновения индентора Н. На рис. 4 представлены результаты исследования цельного хряща наноиндентором (иглой) и микроиндентором (шариком). Предельная глубина микроиндентирования достигала 600 нм, глубина наноиндентирования не превышала 110 нм.
Модуль Юнга в микромасштабе изменяется в малом диапазоне: 0,6-0,7 МПа. Для наномасштаба полученная величина изменяется в процессе нагружения почти на порядок от 1,8 до 0,5 МПа. По мнению авторов, результат уменьшения модуля Юнга в процессе нагружения обусловлен не столько его изменением по глубине залегания материала, сколько вязкоупругим поведением коллагеновых волокон на поверхности, которые с учетом их расположения деформируются путем изгиба. Следует отметить, что полный цикл нагружения в обоих случаях составлял около 10 с. Полученные количественные значения вполне соответствуют литературным данным по исследованию упругости хряща путем растяжения (таблица).
В нашем случае модуль Юнга оценивался с помощью процедуры контактного деформирования. Обнаружилось, что на микроуровне при контактном нагружении вязкое поведение проявляется гораздо слабее.
Для микроуровня упругая реакция хряща на внешнее контактное давление есть результат функционирования композиционной структуры хряща (коллагеновый матрикс-протеогликаны-вода) и она показывает чрезвычайно высокую несущую способность, без заметного изменения упругости от времени. В то же время система игла-наноиндентор дает возможность оценить модуль Юнга только для отдельных компонентов естественного хряща, скорее всего, коллагеновых волокон.
Аналогичный сравнительный анализ при деформировании хряща на микро-и наноуровне проводился в других работах. Однако на этот счет нет единого мнения. Например, в работе [13] были получены результаты для модуля Юнга на микроуровне на порядок больше (Е = 2,60 ± 0,05 МПа) в сравнении с наноуровнем (Е = 0,027 ± 0,003 МПа). Существенное отличие от случая, рассмотренного нами, заключается в том, что радиус микроиндентора в [13] был намного меньше: 2,5 мкм. Это не позволяло вовлекать в работу при контактном деформировании всю композиционную структуру хряща.
На рис. 5 приведены данные сравнения результатов наноиндентирования для различным образом ориентированных срезов хряща. Как видно, характер зависимости модуля Юнга от глубины проникновения индентора (что то же самое - от времени нагружения) практически совпадает для радиального среза хряща и цельного хряща. Для обоих образцов наблюдается существенная временная зависимость модуля упругости. Причем имеет место и количественное совпадение. Значение модуля Юнга для латерального среза на начальном этапе кривой значительно отличается от значений модуля Юнга для радиального среза и цельного хряща на этом же промежутке.
Е, МПа
2,2
2,0
1,8
1,6
1,4
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
• индентирование шариком —индентирование иглой
о
\
о
0
—I— 100
200
400
500
600
300 Н, нм
Рис. 4. Зависимости модуля Юнга цельного хряща от глубины внедрения инденторов на различных масштабах исследования: Е - модуль Юнга, Н - глубина внедрения
Е, МПа
Н, нм
Рис. 5. Зависимости модуля Юнга от глубины внедрения острия АСМ зонда для срезов хряща в различных направлениях: Е - модуль Юнга, Н - глубина внедрения
Значения модуля упругости суставного хряща при растяжении
Модуль упругости Значение, МПа Источник информации
Кратковременный Е0 12,20 [8]
2,35 [1]
Равновесный Еш 7,24 [8]
0,71 [1]
3,67 [9]
Характер деформирования также существенно различается: латеральный срез слабо проявляет поведение, подобное вязкоупругому деформированию. Такое различие может быть объяснено тем, что в первых двух случаях деформирование осуществляется в результате изгиба волокон, в третьем же - в направлении осевого сжатия волокон, т.е. модуль Юнга зависит от направления коллагеновых волокон: тангенциальное расположение коллагеновых волокон обеспечивает более равномерное распределение внешнего давления по поверхности хряща и большую податливость при деформировании на изгиб коллагеновых волокон.
Выводы
Выполненные исследования структуры и упругих свойств хряща на микро- и наноуровне показали, что стабильная несущая способность натурального материала, уменьшенная временная зависимость его упругих свойств проявляется в случае вовлечения в процесс контактного деформирования всей композиционной структуры хрящевой ткани и только при направлении деформирования, соответствующем естественному нагружению в суставе. В этом случае контактное давление перераспределяется более равномерно, а также начинает работать вся система коллагеновый матрикс-протеогликаны-вода, которая препятствует скачкообразному изменению давления и большим значениям деформации в суставе.
Коллагеновые волокна при их изгибе проявляют вязкоупругое поведение и в изолированном состоянии, без взаимодействия в составе хрящевого каркаса, наполненного жидкостью, не способны обеспечить высокие механические свойства, характерные для хрящевой ткани.
Отсюда следует, что только при совместном рассмотрении роли всех компонентов структуры хряща можно объяснить его уникальное поведение по отношению к внешней нагрузке.
Благодарность
Работа выполнена при финансовой поддержке в рамках проекта 4.15 «Механика» Государственной программы Республики Беларуси (в разделе «Биомеханика»), а также Шестой рамочной программы Евросоюза в рамках контракта MTDK-CT-2004-517226 (проект передачи знаний им. Марии Кюри).
Список литературы
1. Вежхольский, К. Трибология клеток хряща в биореакторе / К. Вежхольский // Российский журнал биомеханики. - 2007. - Т. 12, № 2. - С. 50-64.
2. Купчинов, Б.И. Биотрибология синовиальных суставов / Б.И. Купчинов, С.Ф. Ермаков, Е. Д. Белоенко. - Минск: Наука и техника, 1997.
3. Миронов, В.Л. Основы сканирующей зондовой микроскопии / В.Л. Миронов. - Н. Новгород: Изд-во Ин-та физики макроструктур РАН, 2004.
4. Bhushan, B. Applied scanning probe methods / B. Bhushan, H. Fuchs, S. Hosaka. - Springer, 2002.
5. Burnham, N. Measuring the nanomechanical properties and surface forces of materials using an atomic force microscope / N. Burnham, R.J. Colton // J. Vac. Sci. Technol. - 1989. - Vol. A7. - P. 2906-2913.
6. Dowson, D. Bio-tribology of natural and replacement synovial joints / D. Dowson. - New York, Berlin, London, Paris, Tokyo, Hong-Kong: Springer-Verlag, 1990.
7. Dumbleton, J.N. Tribology of natural and artificial joints / J.N. Dumbleton. - Elsevier, 1981.
8. Hayers, W.G. Viscoelastic properties of human articular cartilage / W.G. Hayers, L.F. Mocros // J. Appl. Physiol. - 1971. - Vol. 31. - P. 562-568.
9. Linn, F.C. Lubrication of animal joints. The arthrotripsometer / F.C. Linn // J. Bone Joint Surg. - 1967. -Vol. 49A. - P. 1079-1098.
10. McCutchen, C. W. The frictional properties of animal joints / C.W. McCutchen // Wear. - 1962. - Vol. 5. -P. 1-17.
11. Scherge, M. Bio-micro-nanotribology. Natural solutions / M. Scherge, S. Gorb. - Berlin, Heidelberg, New York, London, Paris, Tokyo, Hong Kong, Barcelona, Budapest: Springer-Verlag, 2000.
12. Sokoloff, L. Elasticity of aging cartilage / L. Sokoloff // Fed. Proceedings. - 1966. - Vol. 25, No. 3. -P. 1089-1095.
13. Stolz, M. Dynamic elastic modulus of porcine articular cartilage determined at two different levels of tissue organization by indentation-type atomic force microscopy / M. Stolz, R. Raiteri, A.U. Daniels, M.R. Van Landingham, W. Baschong, U. Aebi // Biophysical Journal. - 2004. - Vol. 86. - P. 3269-3283.
14. www.microtm.com, 2008.
STRUCTURE AND ELASTIC PROPERTIES OF A CARTILAGE AT MICRO- AND NANOLEVEL
S.A. Chizhik, A.V. Trushko (Minsk, Belarus), K.Ch. Wierzcholski (Gdynia, Poland)
The results of investigation of the elastic modulus of a cartilage tissue via micro- and nano indentation by atomic-force microscope are presented. Macrosections of a pig cartilage in radial and lateral directions, respectively, with orientation of collagen fibres in a structure of the studied tissue are used as objects of investigation. The topography of the surface layers of an unbroken cartilage and its sections that correlates with the characteristic properties of an orientational arrangement of collagen fibres is visualized by the methods of scanning electronic and atomic-force microscopy. The procedure is described; a quantitative estimation is carried out for the values of elastic modulus with the use of microindentor (curvature radius of 350 p,m, indentation depth to 600 nm) and nanoindentor (curvature radius of 30 nm, indentation depth to 120 nm). The different character of deformation is found to depend on the orientation of collagen fibres relative to the deformation direction, as well as on a localization scale of a contact zone (nano- and micro level). The high stability of cartilage behavior under load is shown in the case when unbroken composition structure of cartilage tissue is involved in the deformation process.
Key words: cartillage tissue, cartillage structure, collagen fibers, microscopy, microlevel, nanolevel, indentor, elasticity modulus.
Получено 23 февраля 2008
