CC BY
58
УДК 616.23
АТОМНО-СИЛОВАЯ СПЕКТРОСКОПИЯ КАК МЕТОД ИССЛЕДОВАНИЯ ВЯЗКОУПРУГИХ СВОЙСТВ НЕЙТРОФИЛОВ КРОВИ У ПАЦИЕНТОВ С ХРОНИЧЕСКОЙ ОБСТРУКТИВНОЙ БОЛЕЗНЬЮ ЛЕГКИХ
© В. В. Гайнитдинова1, Л. А. Шарафутдинова2*, И. М. Камалтдинов2,
М. В. Мавлетов2
1Башкирский государственный медицинский университет Минздрава России Россия, Республика Башкортостан, 450000 г. Уфа, ул. Ленина, 3.
2Башкирский государственный университет Россия, Республика Башкортостан, 450076 г. Уфа, ул. Заки Валиди, 32.
*Email: sharafla@yandex.ru
В режиме силовой спектроскопии выполнена количественная оценка модуля упругости (модуля Юнга) клеточной мембраны и силы адгезии нейтрофилов у больных хронической об-структивной болезнью легких. Установлено повышение значения модуля Юнга и силы адгезии нейтрофилов у больных хронической обструктивной болезнью легких.
Ключевые слова: нейтрофилы, модуль Юнга, адгезия, хроническая обструктивная болезнь легких, атомно-силовая микроскопия.
Воспаление дыхательных путей является основным компонентом в патогенезе хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ) [1]. Согласно результатам многочисленных исследований у больных ХОБЛ имеют место изменения структуры и активация нейтрофилов и лимфоцитов периферической крови [2]. При этом наблюдается нарушение функционирования циркулирующих нейтрофилов, что способствует развитию системного воспалительного ответа. Кроме того, нейтрофилы у больных ХОБЛ обладают повышенной хемотаксической реакцией, экспрессией поверхностных клеточных адгезивных молекул и усиленной способностью переваривать соединительную ткань [3].
Известно, что возникновение некоторых патологических состояний сопровождается изменением жесткости тканей [4, 5]. В некоторых случаях причиной этого является изменение упругости внеклеточного матрикса, в других - жесткость тканей меняется из-за изменения твердости клеток [6].
Одним из перспективных методов изучения структурно-механических свойств клеток крови в настоящее время является атомно-силовая микроскопия (АСМ). Использование АСМ открывает новые возможности в цитодиагностике, поскольку метод за короткое время (минуты) позволяет получить изображение рельефа поверхности клеток с пространственным разрешением порядка нескольких нанометров. Важным преимуществами АСМ по сравнению с другими методами исследования клеток крови являются возможность изучения реальной поверхности клетки без применения специальных методов подготовки образцов и использование АСМ в качестве наномеха-нического сенсора, позволяющего изучать механические (упругие) и адгезионные свойства биоматериалов. По мере развития АСМ в диагностике стали появляться новые понятия, такие как «клеточная нано-механика», или «клеточная эластография». Методы визуализации сдвиговых упругих характеристик живых клеток считаются перспективными для медицинской диагностики различных патологий [7]. Так, A. L. Weisenhorn c соавт. показано, что нормальные клетки эпителия человека имеют модуль Юнга, величина которого на порядок превышает модуль Юнга раковых клеток [8]. А при исследовании механических свойств мембраны нейтрофилов у больных ХОБЛ с выраженной гипоксемией до и после двусторонней
пересадки легких [9] выявлено, что жесткость мембраны нейтрофилов у пациентов с ХОБЛ значительно выше, чем в группе здоровых некурящих лиц. После трансплантации ригидность мембраны уменьшилась, однако существенных различий по сравнению с группой здоровых лиц обнаружено не было. В другом исследовании in vitro установлено повышение жесткости мембраны нейтрофилов при их активации до 7 раз [10].
Цель настоящего исследования: оценка упруго-эластических свойства нейтрофилов крови методом атомно-силовой микроскопии у больных хронической обструктивной болезнью легких
Методы исследования
Проведено местное, открытое, сравнительное исследование по изучению структурно-функциональных свойств нейтрофилов периферической крови у 15 больных с тяжелой степенью ХОБЛ в фазе обострения методом атомно-силовой микроскопии. Диагноз ХОБЛ установлен согласно рекомендациям GOLD 2010 г. Средний возраст больных составил 53.3±5.2 лет, средняя продолжительность заболевания составила 8.90 ± 3.9 лет. Индекс курения (ИК) и индекс массы тела (ИМТ) в среднем составляли 26.17±3.74 и 23.89±4.04 соответственно.
В контрольную группу вошли 14 практически здоровых некурящих лиц без патологии органов дыхания в возрасте 40-55 лет. Группа исследования и контроля не различались по возрасту, половой принадлежности. Критериями исключения из исследования были острые формы других инфекционно-воспалительных, нагноительных заболеваний, лихорадка, злокачественные новообразования, сахарный диабет.
В комплекс обязательного обследования входил общий анализ крови в 1 -е сутки поступления пациентов в стационар. ИК и ИМТ высчитывали по общепринятым формулам. Насыщение крови кислородом ^О2) определялось с помощью напалечного пуль-соксиметра MD300C. Спирометрия (ОФВЬ ФЖЕЛ, отношение ОФВ1/ФЖЕЛ) проводилась на оборудовании Master Screen Body (Erich Jaeger, Германия).
Объект исследования - нейтрофилы периферической крови условно здоровых лиц и больных ХОБЛ. Забор крови для исследования проводился в 1-е сутки поступлении пациентов в стационар. Нейтрофилы вы-
ISSN 1998-4812
Вестник Башкирского университета. 2015. Т. 20. №2
441
деляли из гепаринизированной (20 ед./мл) венозной крови доноров на двойном градиенте фиколл-урографина по методике И. В. Подосинникова и др. [11]. Клетки дважды отмывали забуференным изотоническим раствором натрия хлорида и взвешивали в растворе Хенкса (Invitrogen).
Оценка упругих свойств мембраны нейтрофилов проводилась в режиме силовой спектроскопии. В основе метода атомно-силовой спектроскопии лежит регистрация так называемых «силовых кривых», которые отражают отклонение гибкой балки АСМ-зонда при взаимодействии вершины зонда с поверхностью в зависимости от расстояния между ними. Исследования поверхности клеток проводили в жидкостной ячейке на АСМ Agilent 5500 с использованием кремниевых зондов PPP-CONTPt (Nanosensors) и коллоидных V-образных зондов CP-PNPL-SiO-C с круглым наконечником (диаметр 6.62 мкм). Жесткость мембран оценивалась по модулю Юнга, который рассчитывали согласно теории Герца [12].
В серии экспериментов сравнивали показатели жесткости мембраны нейтрофилов, полученных из крови здоровых доноров и больных ХОБЛ. Для этого проводили обзорное сканирование поля размером 60x60 мкм и выбирали для измерения не менее 10-15 клеток. Для визуализации сканируемых объектов использовали программу Pico View 1.10, при дальнейшей обработке данных - программное обеспечение Pico Image Basic 5.1.
Математико-статистическую обработку данных производили в пакете прикладных программ STATISTICA V.7.0 («StatsoftInc», США). Для всех имеющихся выборок проводили анализ соответствия вида распределения количественных признаков закону нормального распределения с помощью критерия Шапиро-Уилка. Поскольку распределение признаков в группах не являлось нормальным, сравнительный анализ групп проводился с помощью непараметрических методов. Для сравнения трех групп использовался ранговый анализ вариаций по Краскеллу-Уоллису. В случае если нулевая гипотеза об отсутствии различий отклонялась, проводили парное сравнение групп с использованием непараметрического теста Манна-Уитни. Количественные данные представлены в виде М ± m, где М - выборочное среднее, m - стандартная ошибка средней. Различия считали статистически значимыми приp < 0.05.
Результаты исследования и их обсуждение
Знание микромеханических свойств нейтрофи-лов поможет лучше понять функции этих клеток в микроциркуляторном русле. Отвечая на инфекционные и воспалительные сигналы, нейтрофилы быстро достигают места инфекции и воспаления за счет микрососудистой, трансэндотелиальной и трансэпителиальной миграции. В ходе этого процесса нейтрофилы подвергаются динамической деформации и восстановлению. Предполагают, что процесс деформации нейтрофилов необходим для того, чтобы регулировать их адгезию к эндотелию и последующую миграцию в поврежденные ткани. Увеличение деформации клеток и площади контакта нейтрофилов с эндотелием сосудов ведет к его повреждению. Таким образом, миграция и адгезия нейтрофилов к эндотелию сосудов опосредована реологией нейтрофилов [10].
С целью получения более полной информации о жесткости мембраны нейтрофилов больных ХОБЛ бы-
ла проведена оценка модуля Юнга нативных клеток. Анализ результатов атомно-силовой спектроскопии упругих деформаций нейтрофилов позволил выявить, что клеточная мембрана нейтрофилов больных ХОБЛ по сравнению с контрольной группой характеризуется более высокими значениями модуля упругости (рис. 1). Установлено, что модуль Юнга мембраны нативных клеток контрольной группы составляет в среднем 15.29±0.05 кПа, тогда как у больных ХОБЛ этот показатель примерно в 2.5 раза выше и равен 38.79±0.32 кПа (р < 0.05). Этот факт свидетельствует о снижении эластичности и вязкости клеточной мембраны и повышении жесткости нейтрофилов больных ХОБЛ.
50
С
и
s 40
£
g 30
20
10
38.79
15.29
0
контроль ХОБЛ
Рис. 1. Модуль Юнга (кПа) нейтрофилов доноров контрольной группы и больных ХОБЛ.
Различия силовых кривых взаимодействия (подвода) зонда с поверхностью нейтрофилов контрольной группы и больных ХОБЛ (б) показаны на рис. 2.
Сила, нН
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4
Расстояние, мкм
Рис. 2. Силовые кривые подвода зонда для нейтрофилов контрольной группы (а) и больных ХОБЛ (б).
Наклон кривой подвода кантилевера определяет упругие свойства образца (клетки). Для «мягких» образцов кривая подвода кантилевера имеет более пологий наклон. На представленном рисунке отчетливо видно, что наклон силовой кривой подвода зонда к поверхности нейтрофилов группы больных ХОБЛ (рис. 2б) более крутой, что свидетельствует о более высокой жесткости мембраны клеток этой группы
больных по сравнению с аналогичным показателем 4.
контрольной группы.
Выводы 5.
Таким образом, использование АСМ позволило установить изменения микромеханических свойств клеточной поверхности нейтрофилов у больных 6.
ХОБЛ. Выявленные особенности нейтрофилов могут дополнить существующие представления о системном воспалении при ХОБЛ, а также могут быть использо- 7
ваны в качестве индикатора степени выраженности воспаления у этой категории больных. 8.
Исследование поддержано грантом Министерства образования РФ 11.G.34.31.0040 9
ЛИТЕРАТУРА
10.
1. Авдеев С. Н. Ингибиторы фосфодиэстеразы-4: новые перспективы противовоспалительной терапии ХОБЛ // Фарматека. 2013. №4. С. 101-111.
2. Emiel F. M. Wouters Local and Systemic Inflammation in 11. Chronic Obstructive Pulmonary Disease // Proc. Am. Thorac. 2005. Vol. 2. Pp. 26-33.
3. Noguera A., Batle S., Miralles C. et al. Enhanced neutrophil 12. response in chronic obstructive pulmonary disease // Thorax. 2001. Vol. 56. No. 6. Pp. 432-437.
Bucala R., Cerami A. Advanced glycosylation:chemistry, biology, and implications for diabetes and aging // Adv. Pharm. 1992. Vol. 23. Pp. 1-34.
Castellani R. J., Harris P. R., Sayere Castellani L. M. Active glycation in neurofibrillary pathology of Alzheimer disease: N (epsilon) - (carboxymethyl) lysine and hexitol - lysine // Free Rad. Biol. Med. 2001. Vol. 31. Pp. 175-180. Goldmann W. H., Galneder R., Ludwig Goldmann M. Differences in elasticity of vinculin-deficient F9 cells measured by magnetometry and atomic force microscopy // Exp. Cell Res. 1998. Vol. 239. Pp. 235-242.
Дрозд Е. Новый метод в биомедицинских исследованиях //
Наука и инновации. 2009. №>10. С. 80.
Weisenhorn A. L., Khorsandi M., Kasa S., Gotzos V., Butt H.
// Nanotechnology. 1993. Vol. 4. Pp. 106.
Navajas D. Nanomechanics of living cells // Book of Abstracts
IV Spanish Portuguese Biophysical Congress. Spain 2010.
Pp. 33.
Roca-Cusachs P. Roca-Cusachs P., Almendros I., Sunyer Raimon Rheology of Passive and Adhesion-Activated Neutro-phils Probed by Atomic Force Microscopy // Biophys. J. 2006. Vol. 91. Pp. 3508-3518.
Подосинников И. В., Нилова Л. Г. Бабичев И. В. Метод определения хемотаксической активности лейкоцитов // Лаб. Дело. 1981. №8. C. 68-70.
Bukharaev A. A., Mozhanova A. A., Nurgazizov N. I., Ovchinnikov D. V. Measuring local elastic properties of cell surfaces and soft materials in liquid by AFM // Physic of low-dimension structures. 2003. Pp. 31-38.
Поступила в редакцию 05.12.2014 г.
ISSN 1998-4812
BeciHHK EamKHpcKoro yHHBepcHTeTa. 2015. T. 20. №2
443
ATOMIC AND POWER SPECTROSCOPY AS THE METHOD OF RESEARCH
OF VISCOELASTIC PROPERTIES OF BLOOD NEUTROPHILS OF PATIENTS WITH THE CHRONIC OBSTRUCTIVE PULMONARY DISEASE
© V. V. Gainitdinova1, L. A. Sharafutdinova2*, I. M. Kamaltdinov2,
M. V. Mavletov2
1Bashkir State Medical University 3 Lenin St., 450000 Ufa, Republic of Bashkortostan, Russia.
2Bashkir State University 32 Zaki Validi St., 450076 Ufa, Republic of Bashkortostan, Russia.
*Email: sharafla@yandex.ru
Results of study elastic properties of blood neutrophils of patients with a chronic obstructive pulmonary disease (COPD) by method of atomic microscopy are given in article. The assessment of elastic properties of membrane of neutrophils was carried out in the mode of power spectroscopy. Researches of a surface of cages were conducted in a liquid cell on ASM Agilent 5500 with use of silicon probes of PPP-CONTPt (Nanosensors) and colloidal V-shaped probes of CP-PNPL-SiO-C with a round tip (diameter of 6.62 microns). Rigidity of membranes was estimated on Young's modulus counted according to the theory of Hertz. The cellular membrane of neutrophils of patients with COPD in comparison with control group is characterized by higher values of the module of elasticity. It is established that the Young's modulus of a membrane of native cages of control group is 15.29 ± 0.05 KPa in average whereas this indicator is about 2.5 times higher for patients with COPD and it is equal 38.79 ± 0.32 KPa (p < 0.05). This fact testifies to decrease in elasticity and viscosity of a cellular membrane and increase of rigidity of neutrophils of patients with COPD. The revealed features of neutrophils can contribute to the existing ideas of a system inflammation at COPD and can be used as the indicator of degree of expressiveness of an inflammation for this category of patients.
Keywords: neutrophils, young's modulus, chronic obstructive pulmonary disease, atomic microscopy.
Published in Russian. Do not hesitate to contact us at bulletin_bsu@mail.ru if you need translation of the article.
REFERENCES
1. Avdeev S. N. Farmateka. 2013. No. 4. Pp. 101-111.
2. Emiel F. M. Proc. Am. Thorac. 2005. Vol. 2. Pp. 26-33.
3. Noguera A., Batle S., Miralles C. Enhanced neutrophil response in chronic obstructive pulmonary disease. Thorax. 2001. Vol. 56. No. 6. Pp. 432-437.
4. Bucala R., Cerami A. Adv. Pharm. 1992. Vol. 23. Pp. 1-34.
5. Castellani R. J., Harris P. R. Free Rad. Biol. Med. 2001. Vol. 31. Pp. 175-180.
6. Goldmann W. H., Galneder R. Exp. Cell Res. 1998. Vol. 239. Pp. 235-242.
7. Drozd E. Nauka i innovatsii. 2009. No. 10. Pp. 80.
8. Weisenhorn A. L., Khorsandi M., Kasa S., Gotzos V., Butt H. Nanotechnology. 1993. Vol. 4. Pp. 106.
9. Navajas D. Book of Abstracts IV Spanish Portuguese Biophysical Congress. Spain 2010. Pp. 33.
10. Roca-Cusachs P. Roca-Cusachs P., Almendros I. Biophys. J. 2006. Vol. 91. Pp. 3508-3518.
11. Podosinnikov I. V., Nilova L. G. Babichev I. V. Lab. Delo. 1981. No. 8. Pp. 68-70.
12. Bukharaev A. A., Mozhanova A. A., Nurgazizov N. I., Ovchinnikov D. V. Physic of low-dimension structures. 2003. Pp. 31-38.
Received 05.12.2014.
