CC BY
69
ISSN 0869-4362
Русский орнитологический журнал 2016, Том 25, Экспресс-выпуск 1338: 3457-3463
Атомно-силовая микроскопия хромосом типа ламповых щёток птиц и амфибий
А.В.Красикова, Т.В.Куликова
Алла Валерьевна Красикова, Татьяна Вадимовна Куликова. Кафедра цитологии и гистологии, биологический факультет, Санкт-Петербургский государственный университет, Университетская набережная, 7/9, Санкт-Петербург, 199178, Россия. E-mail: [email protected]; [email protected]
Поступила в редакцию 7 сентября 2016
Детальное понимание закономерностей функционирования эука-риотического генома требует точных знаний о пространственной организации и упаковке транскрипционно активного и неактивного хроматина и перихроматиновых фибрилл в клеточном ядре. Из-за небольших размеров метафазных хромосом и интерфазных ядер соматических клеток позвоночных исследование организации индивидуальных ядерных структур с высоким разрешением затруднено. Благодаря гигантским размерам и выраженной хромомерно-петлевой морфологии хромосомы типа ламповых щёток (ЛЩ), обнаруживаемые в растущих ооцитах птиц и амфибий, представляют собой удобную экспериментальную систему для анализа структуры и функции мейотических бивалентов, изучения принципов пространственной организации хроматина, а также процессов синтеза и созревания РНК (Morgan 2002; Gaginskaya et al. 2009). Применение таких инновационных методов анализа топографии хромосом, как бионаноскопия, позволяет заполнить некоторые пробелы в сведениях об организации транскрипционно-активных хромосом, полученных с помощью методов световой и электронной микроскопии.
В настоящей работе впервые с использованием методов высокоразрешающей бионаноскопии, а именно атомно-силовой микроскопии, охарактеризована структурная организация хроматина и рибонуклео-протеинового матрикса транскрипционных единиц хромосом типа ламповых щёток из ядер растущих ооцитов птиц и амфибий. Проведён сравнительный анализ тонкого строения РНП-матрикса и его компонентов (РНП-комплексов, РНП-фибрилл и отдельных РНП-частиц) в транскрипционных единицах в простых, глыбчатых, гранулярных и гигантских терминальных петлях хромосом типа ламповых щёток птиц с вертикальным субнанометровым разрешением. В результате предложена модель зависимости стадий упаковки РНП-матрикса в транскрипционных единицах хромосом из ооцитов птиц от природы транс-криптов, макромолекулярного состава РНП-матрикса и этапов процес-синга синтезируемой в этих локусах РНК. В качестве объектов иссле-
дования были выбраны растущие ооциты половозрелых самок домашней курицы Gallus gallus domesticus и сизого голубя Columba livia, а также тритона Карелина Triturus cristatus karelinii которого в настоящее время часто рассматривают в качестве отдельного вида.
Препараты микрохирургически изолированных из ооцитов хромосом типа ламповых щёток готовили по стандартным протоколам с использованием стереомик-роскопа и цитологической центрифуги (Solovei et al. 1994; http://projects.exeter.ac. uk/lampbrush/protocols.htm). Качество препаратов, окрашенных флуоресцентным красителем DAPI, оценивали с помощью микроскопа Leica DM 4000C, оборудованного системой для фазового контраста (фирма Leica Microsystems).
Трёхмерную структуру поверхности хромосом на препаратах исследовали с помощью сканирования в атомно-силовом зондовом микроскопе NTEGRA Aura (фирмы ЗАО НТ-МДТ, г. Зеленоград), оборудованном системой видеонаблюдения. Хромосомы типа ламповых щёток были визуализированы на воздухе. Сканирование проводили в полуконтактном режиме с использованием кремниевых зондов NSG01 или NSG10. Принцип атомно-силовой микроскопии (АСМ) основан на визуализации структур за счёт силового взаимодействия атомов иглы кантилевера (упругой консоли с острым зондом на конце) и объекта (Миронов 2004). Получаемое изображение зависит не только от топографических изменений поверхности хромосомы, но и от взаимодействия наконечника сканирующей иглы с эластичным материалом хромосомы.
Обработка и количественный анализ результатов сканирования поверхности транскрипционных единиц и полученных методом АСМ топографических и фазовых изображений проводили с помощью программного обеспечения NOVA (ЗАО НТ-МДТ). Поверхность РНП-матрикса в участке транскрипционной единицы реконструировали с помощью инструмента «3D-Surface» той же программы.
По сравнению с метафазными хромосомами, в хромосомах-ЛЩ с помощью АСМ легко распознать более плотные хромомеры, простые и сложные латеральные петли и их РНП-матрикс, а также ассоциированные с осью хромосом структуры, не содержащие нити хроматина. Примеры трёхмерных реконструкций поверхности РНП-матрикса в участках транскрипционных единиц простых латеральных петель хромосом типа ЛЩ приведены на рисунке 1. Особый интерес представляют результаты трёхмерного анализа строения РНП-матрикса латеральных петель хромосом типа ламповых щёток с помощью АСМ. Вновь синтезируемые транскрипты, связанные с РНК-полимеразами, взаимодействуют с факторами процессинга РНК, формируя РНП. По данным АСМ, основная структурная единица РНП-матрикса ЛЩ — это гранула размером около 25 нм, представляющая собой РНП-частицу. Эти РНП-частицы имели сходных размер по всей длине транскрипционных единиц простых латеральных петель (рис. 1б). Ранее с помощью сканирующей электронной микроскопии было показано, что структурная единица РНП-матрикса простых латеральных петель представляет собой базовую частицу размером около 30 нм (Bonnenfant-Jais et al. 1986; N'da et al. 1986).
t Рис. 1. Атомносиловая микроскопия хромосом типа ламповых щёток сизого голубя (а, б) и тритона Карелина (в-з). Показаны простые латеральные петли (д-з). Рельеф поверхности РНП-матрикса отдельных транскрипционных единиц (б). Приведены высотные и топографические изображения, а также трёхмерная реконструкция.
Стрелки показывают направление транскрипции.
Проведён количественный анализ распределения комплексов РНП-частиц в зависимости от удаления от промотера. Обнаружено, что РНП-частицы формируют линейные комплексы, которые удлиняются по мере удаления от начала транскрипционной единицы, что свидетельствует об их соответствии перихроматиновым РНП-фибриллам.
Впервые с помощью АСМ визуализирована пространственная организация синтезируемых транскриптов, ассоциированных с матрицей ДНК, показано, что они «окутывают» оси латеральных петель хромосом типа ламповых щёток (рис. 1б). Детальный анализ РНП-матрикса латеральных петель с помощью АСМ позволил выявить в некоторых транскрипционных единицах кольцевые структурные элементы и гранулы размером около 250-350 нм, состоящие из комплексов РНП-частиц, что соответствует более сложной упаковке РНП-матрикса, по всей видимости, спиралевидной укладке транскриптов вокруг ДНК-оси петли.
На хромосомах типа ламповых щёток, помимо простых латеральных петель, также обнаруживают сложные латеральные петли с отличным строением РНП-матрикса, такие как «гранулярные петли» (рис. 2). Размер гранул варьировал от 1 до 2 мкм. Гранулы появлялись в середине РНП-матрикса петли, но отсутствовали в начале транскрипционной единицы. В АСМ гранулярные петли показывают сложное строение рельефа поверхности РНП-матрикса, при этом удалось обнаружить, что отдельные гранулы состоят из комплексов элементарных РНП -частиц сходного размера (около 25 нм) (рис. 2). Это означает, что мат-рикс глыбчатых петель формируется в результате постадийной упаковки транскриптов и агрегации РНП-гранул, как предполагалось ранее (Bonnenfant-Jais et al. 1986). Такая агрегация может осуществляться за счёт взаимодействий белков, входящих в состав РНП частиц, формируемых транскриптами и факторами процессинга РНК.
Особый интерес представляют результаты сканирования поверхности хромосом-ЛЩ с помощью АСМ, которые позволили обнаружить существенные различия трёхмерной структуры РНП-матрикса простых латеральных петель и так называемых «глыбчатых петель», характерных для ряда хромосом. Идентификацию хромосом проводили согласно характерному хромомерно-петлевому рисунку. Полученные результаты позволяют нам предположить, что выявленные с помощью АСМ отличия строения РНП-матрикса в «глыбчатых петлях», формирующихся на хромосоме-ЛЩ 2 курицы, обусловлены необычной природой этих структур, а именно их формированием в результате транскрипции
сателлитной ДНК и наличием в них транскриптов некодирующих белки тандемно повторяющихся последовательностей (Krasikova et al. 2010).
О 10 20 30 40 50 60 70 pm Ol 23456
Рис. 2. Рельеф поверхности гранулярных петель хромосом типа ламповых щеток тритона Карелина.
Фазово-контрастная (а) и атомносиловая микроскопия (б-г). Приведены высотные и топографические изображения. Отдельные глобулы гранулярных петель состоят из комплексов РНП-частиц (г).
В ходе анализа терминальных районов хромосом-ЛЩ с высоким разрешением обнаружены микро-транскрипционные единицы и охарактеризован рельеф поверхности скопления фибриллярных структур, не содержащих ДНК-ось, на самом конце открытой терминальной петли (рис. 3). Такие структуры получили название GITERA (giant terminal RNP aggregates) (Kulikova et al. 2015). Анализ оснований терминальных петель с помощью АСМ показал наличие небольшой транскрипционной единицы, длиной около 1 мкм. Мы предполагаем, что субтерминальные транскрипты, синтезируемые в основании GITERA, накапливаются на концах хромосом и отвечают за агрегацию РНП-комплексов. Морфологические отличия в латеральных петелях хромосом типа ламповых щёток, по всей видимости, связаны с природой син-тезиремых в этих локусах транскриптов.
а 6
# % A 0
1 dfmj д
ж .............,„„
Рис. 3. Рельеф поверхности терминальных петель на концах хромосом типа ламповых щёток домашней курицы. Хромосомы окрашены DAPI (б, д). Фазово-контрастная (а, г), флуоресцентная (б, д) и атомносиловая микроскопия (в, е-м). Приведены топографические изображения и трёхмерная реконструкция. В основании GITERA видны субмикроскопические транскрипционные единицы (ж-и). РНП-матрикс GITERA отличается от РНП-матрикса простых латератльных петель (к-м).
Ассоцированные с хромосомами типа ламповых щёток центромер-ные белковые тела в АСМ выглядят как гладкие сферические тельца без сложного рельефа поверхности. Отличные результаты были получены с помощью низковольтной сканирующей электронной микроскопии, где поверхность белковых тел выглядела как фибриллярные скопления с многочисленными порами и выступами (Kulikova et al.,
in press). Эти различия можно объяснить сложностями в сканировании в АСМ крупных объектов, таких как белковые тела, а также различиями в методах микроскопии.
Авторы выражают благодарность сотрудникам центра коллективного пользования «Хромас» и ресурсного центра «Межфакультетский ресурсный центр микроскопии и микроанализа» Санкт-Петербургского государственного университета. Работа выполнена при поддержке гранта РНФ № 14-14-00131.
Литератур а
Миронов В.Л. 2004. Основы сканирующей зондовой микроскопии. Нижний Новгород: 1110.
Bonnanfant-Jaïs M.L., N'Da E., Penrad-Mobayed M., Angelier N. 1986. Structure of landmark loop RNP matrices in Pleurodeles waltl lambprush chromosomes visualized by scanning electron microscopy // J. Cell Sci. 81: 29-42. Gaginskaya E., Kulikova T., Krasikova A. 2009. Avian lampbrush chromosomes: a powerful tool for exploration of genome expression // Cytogenetics and Genome Research 124, 3/4: 251-267.
Krasikova A., Vasilevskaya E., Gaginskaya E. 2010. Chicken lampbrush chromosomes: transcription of tandemly repetitive DNA sequences // Rus. J. Genetics 46, 10: 1173-1177. Kulikova T., Chervyakova D., Zlotina A., Krasikova A., Gaginskaya E. 2015. Giant poly (A)-rich RNP aggregates form at terminal regions of avian lampbrush chromosomes // Chromosoma: 1-16.
Morgan G.T. 2002. Lampbrush chromosomes and associated bodies: new insights into principles of nuclear structure and function // Chromosome Res. 10, 3: 177-200. N'Da E., Bonnanfant-Jaïs M.L., Penrad-Mobayed M., Angelier N. 1986. Size uniformity of RNP matrix particles in loops of Pleurodeles waltl lampbrush chromosomes visualized by electron microscopy // J. Cell Sci. 81: 17-27. Solovei I., Gaginskaya E.R., Macgregor H.C. 1994. The arrangement and transcription of telomere DNA sequences at the ends of lampbrush chromosomes of birds // Chromosome Res. 2, 6: 460-470.
Ю ^
ISSN 0869-4362
Русский орнитологический журнал 2016, Том 25, Экспресс-выпуск 1338: 3463-3470
Акустический репертуар ушастой совы Asio otus
А.М.Евсеева, А.В.Шариков
Анна Михайловна Евсеева, Александр Викторович Шариков. Московский педагогический государственный университет, ул. Кибальчича, д. 6/5, Москва, 129164, Россия. E-mail: [email protected]
Поступила в редакцию 6 сентября 2016
Ушастая сова Asio otus — один из наиболее обычных видов сов в европейской части России (Пукинский 1977; König at al. 2009). При этом акустический репертуар этого вида в специальной литературе освещён недостаточно полно, например, отсутствует общий перечень всех известных сигналов этого вида (Wendland 1957; Ильичёв 1975; Cramp
