CC BY
22
ORIGINAL ARTICLE
КЛИНИЧЕСКАЯ ИММУНОЛОГИЯ И ИММУНОПАТОЛОГИЯ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2017 УДК 616.72-002.77-039:575.083
Блинова Е.А.1, Кнауэр Н.Ю.1, Кулагина Е.А.3, Абрамова Т.Я.1, Зиннатова Е.В.1, Барковская М.Ш.1, Кляус НА.2, Гришина Л.В.1, Пашкина Е.А.1, Сизиков А.Э.2, Кожевников В.С.1, Козлов В.А.1
ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ ЧЕТВЕРТОЙ ХРОМОСОМЫ В АССОЦИАЦИИ С УКОРОЧЕННОЙ ДЛИНОЙ ТЕЛОМЕР У ПАЦИЕНТОВ С РЕВМАТОИДНЫМ АРТРИТОМ
1ФГБНУ «НИИ фундаментальной и клинической иммунологии», 630099, г Новосибирск, Россия; 2Клиника иммунопатологии ФГБНУ «НИИ фундаментальной и клинической иммунологии», 630047, г. Новосибирск, Россия;
3ФГБОУ ВО «Новосибирский государственный медицинский университет», 630091, г Новосибирск, Россия
Используя количественную флуоресцентную гибридизацию in situ с последующим анализом цифровых изображений метафаз, мы установили, что распределение длины теломер на отдельных плечах индивидуальных хромосом неравномерно как в норме, так и при патологии. Пациенты с ревматоидным артритом характеризовались достоверным укорочением длины теломер на плече p 4-й хромосомы. Для исследования позиционного эффекта теломер выбрали гены, расположенные в разноудаленных регионах 4-й хромосомы, и кодирующие белки, связанные с регуляторными и патогенетическими процессами. Анализ уровня экспрессии генов (мРНК) методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени не выявил достоверных отличий между группами доноров и пациентов. Однако наблюдалась тенденция к увеличению экспрессии гена CTBP1 почти в 2 раза и снижению уровня экспрессии гена IRF2 в 2,5 раза у пациентов с ревматоидным артритом. Мы предполагаем, что увеличение транскриптов CTBP1 может быть связано с ослаблением репрессирующего действия теломерного гетерохроматина, тогда как в изменении экспрессии гена IRF2 задействованы другие эпигенетические механизмы. Пациенты с умеренной активностью заболевания обладали достоверным изменением количества мРНК гена TLR2 и гена IRF2 по сравнению с донорами. Регистрировалась тенденция к увеличению экспрессии CTBP1 в группе пациентов с высокой степенью активности заболевания при сопоставлении с донорскими значениями. Кроме того, активность ревматоидного артрита обратно коррелировала с длиной теломер на p-плече 10-й хромосомы. В данном регионе расположены гены, ассоциированные с предрасположенностью к заболеванию, вовлеченные в процессы дифференцировки и пролиферации T-клеток. Дальнейшие исследования позволят раскрыть полную картину сигнальных путей, ответственных за развитие ревматоидного артрита, и установить новые мишени для терапии заболевания.
Ключевые слова: длина теломер; хромосомы; количественная флуоресцентная гибридизация in situ; экспрессия генов; лимфоциты; ревматоидный артрит.
Для цитирования: Блинова Е.А., Кнауэр Н.Ю., Кулагина Е.А., Абрамова Т.Я., Зиннатова Е.В., Барковская М.Ш. и соавт. Экспрессия генов четвертой хромосомы в ассоциации с укороченной длиной теломер у пациентов с ревматоидным артритом. Иммунология. 2017; 38(1): 27-34. DOI: 10.18821/0206-4952-2017-38-1-27-34
Blinova E.A.1, Knauer N.Y.1, Kulagina E.A.3, Abramova T.Y.1, Zinnatova E.V1, Barkovskaya M.Sh.1, Klyaus N.A.2, Grishina L.v.1, Pashkina E.A.1, Sizikov A.E.2, kozhevnikov VS.1, kozlov v.A.1
THE EXPRESSION OF GENES LOCATED ON 4th CHROMOSOME IN ASSOCIATION WITH SHORT TELOMERE LENGTH IN PATIENTS WITH RHEUMATOID ARTHRITIS
1 Research institute of fundamental and clinical immunology, 630099, Novosibirsk, Russia;
2 Clinic of immunopathology RIFCI, 630047, Novosibirsk, Russia; 3Novosibirsk state medical university, 630091, Novosibirsk, Russia.
Quantitative fluorescent in situ hybridization with subsequent analysis of metaphase chromosomes showed that distribution of telomere length on each arm of individual chromosomes is irregular under normal and pathological conditions. Patients with rheumatoid arthritis were characterized by significantly shorter telomere length on the 4p chromosome.To study the telomere position effect we selected genes located in different regions of the 4 chromosome, which encode proteins associated with regulatory and pathogenic processes. Analysis of gene expression (mRNA) by real-time PCR detected no significant differences between donors and patients groups.However, there was a tendency to increase CTBP1expression almost in 2-fold and to reducelevel of IRF2 gene expression in 2,5 fold in patients with rheumatoid arthritis.We suggested that enlargement of CTBP1 transcripts may be related to the weakening of repressiveproperties of telomeric heterochromatin, while the other epigenetic mechanisms are involved in changing of IRF2 gene expression. In patients with moderate activity of the disease the mRNA amount of TLR2 gene and IRF2 gene differed from those in normal individuals. A tendency to increase in CTBP1 expression was registered in patients with high activity of rheumatoid arthritis compared to donors' values. Furthermore, the activity of rheumatoid arthritis
Для корреспонденции: Блинова Елена Андреевна, канд. биол. наук, ст. науч. сотр. лаборатории клинической иммунопатологии «НИИ фундаментальной и клинической иммунологии», E-mail: blinovaelena-85@yandex.ru
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
was inversely correlated with the telomerelength in p-arm of chromosome10.This area contains genes associated with a predisposition to the disease and involved in differentiation and proliferation of T cells. Further investigation will fully reveal the signaling pathways, which are responsible for development of rheumatoid arthritis, and establish new targets for the treatment of the disease.
Keywords: telomere length; chromosomes; quantitative fluorescence in situ hybridization; gene expression; lymphocytes; rheumatoid arthritis.
For citation: Blinova E.A., Knauer N.Y., Kulagina E.A., Abramova T.Y., Zinnatova E. V., BarkovskayaM.Sh., Klyaus N.A., Grishina L.V., Pashkina E.A., Sizikov A.E., Kozhevnikov V.S., Kozlov V.A. The expression of genes located on 4'h chromosome in association with short telomere length in patients with rheumatoid arthritis. Immunologiya.2017; 38(1): 27-34. DOI: 10.18821/0206-4952-2017-38-1-27-34
For correspondence: Elena A. Blinova, PhD, researcher of the laboratory of clinical immunopathology RIFCI, E-mail:
blinovaelena-85@yandex.ru
Information about authors:
Blinova E.A., http://orcid.org/0000-0003-3327-3630 KnauerN.Y., http://orcid.org/0000-0002-5877-3909 BarkovskayaM.Sh., http://orcid.org/0000-0001-5748-9116 Grishina L. V., http://orcid.org/0000-0002-3868-938X Pashkina E.A., http://orcid.org/0000-0002-4912-5512 Kozlov V.A., http://orcid.org/0000-0002-1756-1782
conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
Acknowledgments. The study was supported by the Russian science Foundation (grant No. 14-15-00346).
Received 03.10.16 Accepted 03.11.16
введение
Ревматоидный артрит (РА) — хроническое аутоиммунное заболевание, характеризующееся тяжелыми системными проявлениями, прогрессирующим полиартритом с деструкцией хрящевой и костной ткани, снижением качества и продолжительности жизни. До сих пор нет однозначного объяснения этиологии и патогенеза аутоиммунных заболеваний. Это обусловливает интенсивный поиск факторов, ответственных за их развитие. В аутоиммунных реакциях против собственных клеток принимают участие генетические, сре-довые, иммунологические, гормональные, инфекционные и другие факторы. Последние исследования показали, что в детерминации РА превалирует вклад генетических факторов. Данная патология обусловлена несовершенством иммуно-регуляторных процессов и характеризуется как генетически гетерогенная [1]. Уже идентифицировано 46 генов, аллель-ные варианты которых ассоциированы с развитием РА, при этом часть из них является общими генетическими маркерами и для других аутоиммунных заболеваний. Многие гены, например HLA-DR, CCR6, CD40, CTLA4, IRAK1, IL6R, CD5, IRF8, GATA3 и TYK2, связаны с функционированием иммунной системы и расположены на различных хромосомах [2].
У пациентов с РА описаны не только нарушения регуляции иммунных реакций, но и такие признаки «раннего» старения иммунной системы, как укорочение длины тело-мер, нарушения в механизме репарации ДНК, олигоклональ-ность вследствие гомеостатической пролиферации (ГП). Под ГП подразумевается активация пролиферативных процессов в условиях лимфопении и стимуляции собственными пептидами в комплексе с молекулами HLA. Как и другие виды пролиферации T-лимфоцитов, ГП приводит к старению T-клеточной популяции и потере костимуляторной молекулы CD28 [3]. Ранее нами уже было показано, что при РА происходит укорочение средней длины теломер [4]. Интересно, что потеря теломерных районов ДНК на концах хромосом установлена не только в активно пролиферирующих T-клетках, но и в В-лимфоцитах, моноцитах, гранулоцитах и гемопоэ-тических предшественниках [3—5]. Существует мнение, что укорочение средней длины теломер может служить предиктором РА [3]. В настоящее время считается, что распределение длины теломерных последовательностей в клетке
является неравномерным и носит наследственный характер. Такое распределение длины теломер на отдельных плечах индивидуальных хромосом получило название теломерно-го профиля [6]. Изучению теломерного профиля посвящено ограниченное число исследовательских работ, в основном в области онкозаболеваний [7, 8].
В настоящее время известно, что активность гена может быть изменена за счет разнообразных эпигенетических событий. В частности, при аутоиммунных и воспалительных заболеваниях выявлены нарушения в метилировании гена FOXP3, что проявляется в виде дисрегуляции иммунных реакций [9]. Так же как это показано для степени метилирования определенных ДНК-локусов, укорочение длины теломер на определенных хромосомах может быть ассоциировано с рядом заболеваний, в том числе с РА, и проявляться в виде измененной экспрессии генов, вовлеченных в патогенез. Известно, что теломеры связаны с транскрипционным сайлен-сингом близрасположенных генов, данный феномен носит название «позиционный эффект теломер» («telomeric position effect» — TPE). Он реализуется за счет блокирования тело-мерным гетерохроматином промоторов генов субтеломерных регионов ДНК, локализованных в пределах одной мегабазы, что приводит к подавлению экспрессии этих генов [10, 11]. Укорочение теломер сопровождается снижением уровня метилирования промоторов многих генов субтеломерного региона, что может приводить к повышению экспрессии этих генов [12].
Цель данного исследования — выявление хромосом с достоверно укороченными теломерными последовательностями и оценка экспрессии генов, расположенных на этих хромосомах, при ревматоидном артрите.
Материал и методы
В исследовании по определению длины теломер на индивидуальных хромосомах использовали мононуклеарные клетки (МНК), выделенные из периферической крови условно здоровых доноров (n = 9; средний возраст 42 ± 4,2 года), а также у пациентов с РА (n = 10; средний возраст 42 ± 4,2 года) со II—III степенью активности заболевания. В эксперимент по исследованию экспрессии генов вошли 10 доноров (средний возраст 49 ± 1,9 года) и 16 пациентов с РА (средний
возраст 50 ± 2,2 года). Все пациенты на момент забора материала находились на лечении в клинике иммунопатологии НИИФКИ, г. Новосибирск, в стадии обострения основного заболевания. Отбор пациентов и доноров в группы производился с их предварительного информированного письменного согласия.
Длину теломерных последовательностей определяли на отдельных плечах индивидуальных хромосом методом количественной флуоресцентной гибридизации in situ (Q-FISH). Для оценки экспрессии генов был использован метод поли-меразной цепной реакции (ПЦР) с обратной транскрипцией.
Количественная флуоресцентная гибридизация in situ
Постановка реакции Q-FISH проводилась на препаратах метафазных хромосом, полученных из ФГА-стимулированной культуры МНК периферической крови [13]. Гипотоническую обработку, фиксацию и распластывание метафаз на стекле проводили по стандартным протоколам [14]. Полученные препараты метафазных хромосом предварительно выдерживали в течение 3 сут при комнатной температуре, качество их контролировали под фазово-контрастным микроскопом. Проведение реакции Q-FISH осуществляли с использованием PNA (Peptide Nucleic Acid) зонда, меченного Cy3 ((CCCTAA)3 Eurogenetec Ltd, Бельгия), в соответствии с методикой, ставшей классической для определения длины тело-мер индивидуальных хромосом [15].
Последующую микроскопию готовых препаратов и регистрацию изображений выполняли на микроскопе «Axioplan 2 Imaging E-mot» (ZEISS, Германия), оснащенном монохромной CCD-камерой «CV M300» (JAI Corporation, Япония), согласно ранее описанному способу [13].
Определение относительной длины теломер на отдельных плечах индивидуальных хромосом
Длина теломер оценивалась по интенсивности флуоресцентного сигнала, полученного в результате гибридизации специфического зонда с теломерными последовательностями. Для измерения интенсивности флуоресцентного сигнала на плечах индивидуальных хромосом цифровые изображения метафазных пластинок обрабатывались в программе «TFL-Telo» (British Columbia Cancer Research Center). Поскольку метафазная хромосома содержит две сестринские хроматиды, то на конце каждого плеча регистрировалось 2 Q-FISH сигнала. Так как метафазная пластинка содержит диплоидный набор хромосом, то гомологичные плечи хромосом были представлены в виде четырех флуоресцентных сигналов. Поскольку материнские и отцовские гомологи не могли быть разделены, то показатель относительной длины теломер вычислялся как отношение среднего значения интенсивности флуоресценции четырех теломер каждого плеча определенной хромосомы к среднему значению интенсивности флуоресценции теломер всех хромосом в метафазе (184 сигнала) и выражался в относительных единицах (о. е.)*. Для каждого индивидуума был осуществлен анализ в среднем пяти метафазных пластинок. Идентификацию хромосом проводили по изображениям инвертированного DAPI-бэндинга, номера присваивали согласно Международной номенклатуре метафазных хромосом человека (An International System for Human Cytogenetic Nomenclature 2013).
выделение суммарной рнК
Суммарную РНК выделяли из МНК (2 млн), которые были предварительно заморожены для стабилизации РНК и ингиби-рования действия РНКаз в растворе Д, состоящем из ацетатного буфера (pH 7,0), гуанидина тиоционата, N-лаурил-саркозина и ß-меркаптоэтанола. Для выделения РНК использовали набор
* относительные единицы (о. е.) — отношение среднего значения интенсивности флуоресценции четырех теломер каждого плеча определенной хромосомы к среднему значению интенсивности флуоресценции теломер всех хромосом в метафазе.
ORIGINAL ARTICLE
«РИБО-золь-А» (ООО «ИнтерЛабСервис», Россия), основанный на кислофенольной экстрации нуклеиновых кислот, согласно прилагаемой инструкции. Чистоту и количество выделенной РНК оценивали на бескюветном спектрофотометре NanoDrop 2000 («Thermo Scientific», США).
реакция обратной транскрипции
Суммарную клеточную РНК в количестве 1 мкг денатурировали в пробирках Эппендорфа объемом 0,2 мл в присутствии 0,5 мкг Random primer «9» (смесь олигонуклеотидов со случайной последовательностью длиной в 9 оснований) при 70 °C в течение 5 мин, затем пробирки переносили на лед. Реакционная смесь содержала 1 мкг РНК, 0,5 мкг Random primer «9», 0,5 мМ смеси dNTP, 20 ед. обратной транскрипта-зы M-MuLV («СибЭнзим», Россия). Реакционный буфер прилагался к обратной транскриптазе и содержал 3мМ MgCl2, 50 мМ трис-HCl (pH 8,3 при 25 °C), 75 мМ KCl, 10 мМ ди-тиотрейтола (ДТТ). Реакционную смесь проводили в объеме 20 мкл в течение 1,5 ч при 37 °C, фермент денатурировали 5 мин при 95 °C.
Анализ экспрессии генов
Подбор праймеров к генам-кандидатам осуществлялся в программе Primer-BLAST (NCBI) согласно требованиям, описанным в статье J. Ye и соавт. [16]. В качестве генов-кандидатов были выбраны гены 4-й хромосомы, разноудаленные от тело-мерных концов. Референсным геном выбран конститутивно экспрессирующийся ген GAPDH. Уровень экспрессии генов выражали в условных единицах (у. е.)** относительно рефе-ренсного гена, при подсчете использовали метод ddCt и программное обеспечение Cycler-iQ5 («Bio-Rad», США).
ПЦР проводили в амплификаторе Cycler-iQ5 («Bio-Rad», США). Реакционная смесь объемом 25 мкл содержала 1 мкл ревретированной РНК, 0,5 мкМ прямого и обратного прай-меров, специфичных к гену, 250 мкМ смеси dNTP, однократный раствор SYBR Green, 3 мМ MgCl2, 2 ед. Hot-start Taq-полимеразы («СибЭнзим», Новосибирск). Реакционный буфер содержал 67 мМ трис-HCl (pH 8,8), 16,6 мМ (NH4)2SO4, 0,01% Tween-20. Режим термоциклирования: 1-й шаг — 3 мин 95 °C, 2-й шаг — амплификация 50 циклов: 20 с 95 °C, 15 с температура отжига праймеров (60 °C для генов GAPDH, TNIP2, CTBP1 и 53 °C для генов TLR-2, IRF2), 20 с 72 °C; 3-й шаг составлял 10 с 15 °C.
Статистическую обработку данных проводили при помощи пакета программ Statistica 6.0 (StatSoft). Поскольку распределение исследуемых показателей не всегда имело вид нормального, согласно критерию Шапиро—Уилка, то для дальнейшего анализа были использованы методы непараметрической статистики. При оценке значимости различий между группами больных и доноров применяли критерий Манна—Уитни. Для исследования корреляционных взаимосвязей использовался коэффициент корреляции Спирме-на. Различия считали достоверными при уровне значимости p < 0,05.
результаты
Индивидуальный теломерный профиль может претерпевать изменения в процессе онтогенеза под негативным влиянием экзогенных факторов, таких как курение, ожирение, оксидативный стресс, нездоровый образ жизни. Однако в лимфоцитах действие эпигенетических и экзогенных факторов на относительную длину теломер по сравнению с другими клетками оценивается как минимальное [6].
Распределение длины теломерных повторов на отдельных плечах индивидуальных хромосом было неравномерным и варьировало в пределах исследуемых групп (рис. 1).
** условные единицы (у. е.) — уровень экспрессии гена относительно экспрессии референсного гена, вычисленный методом ddCt.
Иммунология. 2017; 38(1)
DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0206-4952-2017-38-1-27-34 ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
1р 14 2р 2р Зр 34 4р 4ч 5р 54 6р 6Ч 7р 74 8р 84 Эр 94
РА 1,067145 0,938212 0,958139 0,895858 1,006199 1,024147 0,941809 1,02364 1,146778 0,924274 0,990604 1,121799 0,81942 1,096011 0,962926 0,946292 0,894085 0,902655 Юр 1,001233 ОД 0,930553 11р 1,128327 11Ч 0,934191 12р 0,843969 12ч 1,111639 13р 1,119789 13ч 1,040789 14р 1,050525 14ч 1,142089 15р 1,122484 15ч 0,924341 16р 0,954324 16ч 0,839771 17р 0,865504 17ч 0,910699 18р 0,890631 18ч 1,02599 19р 1,073574 19ч 0,904174 20р 0,984698 20ч 0,712573 21р 1,134108 21ч 0,983472 22р 1,059418 22ч 0,953544 1,119634 0,880786
Хр ХЧ
25% 0,21808 0,060492 0,051346 0,121593 0,095644 0,11905 0,02484 0,035347 0,176059 0,123434 0,058535 0,071948 0,030546 0,101487 0,085192 0,025448 0,122773 0,03441 0,154257 0,099878 0,135827 0,070594 0,069619 0,127986 0,107932 0,092452 0,107513 0,111785 0,138416 0,033984 0,090165 0,057832 0,032449 0,138164 0,127796 0,274146 0,108067 0,100059 0,043119 0,040082 0,16204 0,0827 0,096323 0,034426 0,132296 0,021547
7556 0,091359 0,157705 0,11242 0,265621 0,202865 0,065695 0,045624 0,057141 0,279566 0,062605 0,093668 0,143557 0,334522 0,07422 0,107479 0,090854 0,099615 0,049172 0,106215 0,125056 0,121988 0,050625 0,078971 0,084976 0,091904 0,132004 0,23593 0,138526 0,124434 0,257997 0,064559 0,199927 0,039044 0,109523 0,073944 0,22162 0,245812 0,062885 0,07891 0,056776 0,270742 0,108362 0,042096 0,041771 0,047534 0,161286
Доноры 1,172777 1,037347 1,054498 0,901783 1,223375 0,901379 1,146313 0,978077 1,088919 0,821143 1,081256 0,958928 0,869223 1,062402 0,93585 0,979109 0,9091 0,936081 0,998594 0,995631 0,999498 0,911693 0,837052 1,046671 0,97152 1,034159 1,050458 1,00025 0,966037 0,889361 0,873836 0,967574 0,896691 0,875828 0,841685 1,054126 1,094662 0,749795 1,105998 0,807002 1,12458 0,91448 1,107816 1,04235 1,098266 0,866118
25% 0,169514 0,092767 0,1073 0,014622 0,189489 0,089393 0,128044 0,197421 0,150533 0,024895 0,075887 0,079325 0,015305 0,086563 0,032859 0,196558 0,098149 0,087243 0,07988 0,020532 0,167133 0,098418 0,116267 0,042154 0,12814 0,050231 0,128985 0,018909 0,146983 0,021495 0,162882 0,085215 0,078947 0,059991 0,035283 0,22748 0,153569 0,077189 0,083311 0,131094 0,196987 0,076585 0,20555 0,082024 0,10767 0,079161
75% 0,230556 0,259573 0,286871 0,126194 0,379632 0,188075 0,179614 0,223437 0,185786 0,249429 0,248034 0,187196 0,113363 0,150167 0,070417 0,364463 0,286515 0,153821 0,152847 0,127088 0,315639 0,263854 0,300586 0,135076 0,270152 0,289461 0,288178 0,197609 0,377223 0,135593 0,466989 0,093339 0,136612 0,113487 0,113859 0,356705 0,264093 0,233344 0,089014 0,190019 0,380949 0,143826 0,32905 0,182755 0,16414 0,099532
Рис. 1. Хромосомоспецифическое распределение длин теломер у доноров и пациентов с ревматоидным артритом (данные представлены в виде медианы и интерквартильного размаха: 25-й и 75-й перцентили).
В первую очередь при сопоставлении теломерного профиля доноров и пациентов с РА нас интересовало число хромосом с укороченными теломерами, которые мы определяли как имеющие длину теломерных последовательностей не более 0,9 о. е. Общими в группе хромосом с короткими теломерами для доноров и пациентов были 8 хромосом: 2q, 7р, 12р, 17р, 18р, 19q, 20q, Xq. При этом у доноров в данную группу были отнесены еще 5q, 15q и 17q, а у больных РА — 9р и 16q. Таким образом, теломерный профиль при ревматоидном артрите практически сопоставим с таковым у доноров по числу хромосом с короткими теломерными последовательностями. Минимальная длина теломер выявлена на q-плече 20-й хромосомы в обеих группах. Несмотря на то что для пациентов характерны более короткие теломеры на данной хромосоме, чем у доноров (0,71 и 0,81 о. е. соответственно), достоверных отличий между группами не выявлено.
Однако достоверное укорочение длины теломер выявлено на р-плече 4-й хромосомы (рис. 2). Исходя из этого были подобраны гены, расположенные в различных регионах обоих плеч (4р и 4ф 4-й хромосомы, чтобы установить связь между длиной теломер и уровнем экспрессии генов данной хромосомы (см. таблицу).
Ген СТВР1 кодирует регуляторный белок, способный связываться с сайт-специфичными ДНК-связывающими белками и обеспечивающий «выключение» гена за счет привлечения гистон-модифицирующих ферментов, которые де-активируют гистоны и убирают метки активации. Продукт гена ТМ1Р2 вовлечен в МАР/ЕКК-сигнальный путь и может способствовать ШР1-индуцированному апоптозу. ко-
дируемый одноименным геном, участвует в иммунном ответе на грампозитивные бактерии, стимулирует транскрипционный фактор ОТ-кВ. Как и ряд других рецепторов, экспрессируется на моноцитах, которые играют ключевую роль в прогрессии ревматоидного артрита за счет продукции провоспалительных цитокинов, поддерживают воспаление и привлекают другие клетки иммунной системы в сустав. Продукт гена 1КР2 — транскрипционный фактор, который ин-гибирует опосредованную 1КР1 транскрипционную активацию интерферонов и других генов и способен активировать транскрипцию гистона Н4.
Уровни экспрессии генов ТЖР2 и достоверно не
различались между группами доноров и пациентов с РА (0,61 ± 0,25 и 0,93 ± 0,33; 0,54 ± 0,21 и 0,31 ± 0,08 у. е. соответственно), что может быть связано с их достаточно удаленным от
ORIGINAL ARTICLE
Характеристика генов 4-й хромосомы
Ген Локализация гена* Адресация основной формы (Ref.Seq.) Число изо-форм Число экзо-нов Число вариантов альтернативного сплайсинга Число псевдогенов
CTBP1
TNIP2 (ABIN2)
TLR-2
IRF2
4p16.3 1,21—1,25 МЬ 4p16.3 2,74—2,76 МЬ 4q31.3 153,7—153,71 Mb 4q35.1 184,39-184,47 Mb
NM_001012614.1 NM_001161527.1 NM_003264.3 NM 002199.3
11 3 1 2
19 6 1
17
19 7
1 (Х-хромосома)
Примечание. * — локализация гена представлена по данным Ensemble Homosapience GRCh38.p5.
теломерного района положением и отсутствием значимого влияния теломерного гетерохроматина. Число транскриптов гена CTBP1 в группе пациентов с РА имело тенденцию к увеличению почти в 2 раза (р = 0,08) по сравнению с контрольной группой (рис. 3), что, по нашему мнению, может быть ассоциировано с укорочением теломерной последовательности в р-плече 4-й хромосомы и с близким расположением исследуемого гена к теломерному региону. Также было обнаружено изменение экспрессии гена 1КР2: у пациентов с РА его экспрессия была снижена в 2,5 раза (р = 0,06). В данном случае мы считаем, что изменение экспрессии 1КР2 связано не с длиной теломер, а с реализацией других эпигенетических механизмов, влияющих на экспрессию гена на посттранскрипционном уровне. Ген ШР2 расположен в длинном плече 4-й хромосомы, в котором длина теломер сопоставима у доноров и пациентов.
Корреляционный анализ в группе пациентов с РА не выявил достоверных связей между длиной теломерных последовательностей р-плеча 4-й хромосомы и активностью заболевания, выраженной в индексе DAS28. Однако наблюдалась обратная корреляция между индексом DAS28 и длиной тело-мер на р-плече 10-й хромосомы (г = -0,72; p < 0,05). При этом в регионе 10р15 расположены гены, кодирующие а-цепи рецепторов к ГЬ-2 и ГЬ-15 и транскрипционный фактор GATA-3, которые отвечают за пролиферацию, поддержание и диффе-ренцировку Т-клеток и вовлечены в патогенез РА.
Нами не выявлено корреляций между экспрессией генов 4-й хромосомы и активностью заболевания. При дальнейшем анализе мы разделили пациентов с РА на группы с умеренной (индекс DAS28 в пределах 3,2—5,1 балла) и высокой (индекс DAS28 более 5,1 балла) активностью заболевания. Группы
были сопоставимы по возрасту и числу пациентов (п = 7): средний возраст в группах составил 53 ± 3,3 и 53 ± 2,5 года соответственно. Число транскриптов CTBP1 имело тенденцию к увеличению в группе пациентов с высоким уровнем активности РА по сравнению с донорами (р = 0,06), при этом уровни экспрессии гена CTBP1 между группами пациентов достоверно не отличались (рис. 4). Экспрессия гена в группе пациентов с умеренной активностью РА оказалась достоверно ниже, чем в группах с высокой активностью заболевания и доноров. Более низкая по сравнению с донорами экспрессия гена 1КР2 в мононуклеарных клетках обнаружена в группе пациентов с умеренным течением РА. Отличий по содержанию мРНК '[N№2 между группами пациентов с различной степенью активности заболевания и доноров не выявлено.
Обсуждение
Многие возрастзависимые патологии, включая онкологические, сердечно-сосудистые, нейродегенеративные, аутоиммунные заболевания, связаны с нарушениями функций иммунной системы и преобладанием воспалительных реакций. Была выдвинута концепция, согласно которой состарившиеся клетки имеют тенденцию продуцировать в большом количестве провоспалительные цитокины (Т№а, ГЬ-6, МСР-1 и др.), что приводит к повреждению тканей. Активация экспрессии генов цитокинов, изменения белкового состава могут быть связаны с изменениями в структуре хроматина, наблюдаемыми на последних стадиях старения клеток [17]. Кроме того, наличие повреждений в геномной ДНК или те-ломерных областях может способствовать приобретению клетками ассоциированного со старением фенотипа. Одной из особенностей ревматоидного артрита как раз является
9
Медиана Мах Min 25% 75% РА 0,9 1,03002 0,84377 0,91697 0,98743 0,02484 0,04562
Доноры 1,1 1,23811 0,84913 1,01827 1,19788 0,12804 0,05157
Рис. 2. Длина теломер на коротком р-плече 4-й хромосомы в норме и при ревматоидном артрите (данные представлены в виде медианы и интерквартильного размаха: 25-й и 75-й перцентили). Здесь и на рис. 4: * — достоверное отличие между группой пациентов с РА и группой доноров,р < 0,05.
ai
* 4-, я
Ф 3,5 -
Рис. 3. Нормализованная относительно GAPDH экспрессия генов 4-й хромосомы в норме и при ревматоидном артрите (данные представлены в виде среднего и ошибки среднего).
Иммунология. 2017; 38(1)
DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0206-4952-2017-38-1-27-34 ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
СТВР1 IRF2 TNIP2 TLR2 SECTBP1 SEIRF2
RAI 2,46 0,01 0,73 0,13 1,149440 0,000057
RA 2 3,59 0,31 0,76 0,44 1,081905 0,181131
Donors 1,05 1,18 0,26 0,54 0,342381 0,630937
SETNIP2 SETLR2
0,328716 0,066243
0,271621 0,134199
0,104475 0,205770
(1) я"
1
2
к s
о о а>
CL
с
о *
га
с со г
а.
0
1
5 4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 -1 -0,5 -
СТВР1 IRF2 TNIP2 TLR2
Щ РА ум. акт. \///Л РА выс. акт. Доноры
Рис. 4. Нормализованная относительно GAPDH экспрессия генов 4-й хромосомы у пациентов с умеренной и высокой степенью активности ревматоидного артрита и доноров (данные представлены в виде среднего и ошибки среднего).
# — достоверное отличие между группами пациентов с умеренной и высокой активностью РА, р < 0,05.
присутствие характерных признаков старения иммунокомпе-тентных клеток: снижение способности репарировать двух-цепочечные разрывы ДНК, накопление повреждений ДНК, потеря теломерных повторов на концах хромосом [17].
Несмотря на то что в литературе описано укорочение средней длины теломер различных популяций иммунокомпе-тентных клеток, при исследовании хромосом-специфичной длины теломер в T-лимфоцитах оказалось, что индивидуальный теломерный профиль больных РА достаточно схож с теломерным профилем здоровых доноров и обладает практически сопоставимым количеством теломер с минимальным значением длины. Мы обнаружили достоверное укорочение длины теломер только на коротком p-плече 4-й хромосомы у пациентов с РА, после чего был проведен анализ экспрессии ряда генов, расположенных на этой хромосоме и потенциально вовлеченных в патогенез заболевания. Возможно, на полученные данные повлияли особенности примененного подхода: для анализа длины теломер в метафазных пластинках могут быть использованы только Т-лимфоциты, отвечающие на стимуляцию ФГА. В то же время T-клетки при ревматоидном артрите имеют повышенную чувствительность к актива-ционному апоптозу, поэтому часть клеток с критически укороченными теломерами могла быть утрачена при анализе.
Существует несколько механизмов, баланс которых может объяснить укорочение теломер [18], в том числе на определенных хромосомах при иммунопатологических заболеваниях. Механизм быстрой делеции теломер (TRD, telomere rapid deletion) осуществляет негативную регуляцию длины теломер путем вырезания теломерных повторов на конце сверхдлинных теломер (telomere trimming) по типу внутрих-ромосомной гомологичной рекомбинации [19]. С другой стороны, экспрессия теломеразы, которая достраивает однони-тевой конец теломеры, позволяет обеспечить защиту клетки от репликативного старения. Кроме того, обнаружено, что в нормальных клетках человека может проявляться и механизм негомологичной рекомбинации, напоминающий механизм альтернативного удлинения теломер (ALT, alternative lengthing of telomeres) I типа у дрожжей. При этом наблюда-
ется не увеличение размера теломер, а некоторое укорочение наряду с флуктуацией их размеров [20]. За предотвращение гомологичной и негомологичной рекомбинации теломер, в свою очередь, отвечает специальный защитный комплекс — sheltering. Компоненты этого комплекса также контролируют синтез теломеразой теломерной ДНК, принимают непосредственное участие в поддержании ее структуры, отвечая за формирование t-петли в процессе кэппинга теломер [21].
По нашим данным, активность РА обратно коррелировала с длиной теломер на p-плече 10-й хромосомы, где расположены гены, входящие в генетические локусы предрасположенности к заболеванию [12]. Дальнейшие молекулярные исследования позволили бы установить взаимосвязь между длиной теломер, аллельными вариантами/мутациями и уровнем экспрессии этих генов, степенью активности процесса. Это даст возможность не только расшифровать патогенетическую картину заболевания, но и сосредоточиться на поиске новых подходов к лечению РА, направленных на устранение данных нарушений.
Экспрессия генов 4-й хромосомы, на коротком плече которой выявлено укорочение длины теломер, достоверно не изменялась у пациентов с РА по сравнению с донорами, для генов CTBP1 и IRF2 изменения носили характер тенденции. Учитывая, что ген CTBP1 расположен в регионе 4p16.3, на увеличение его экспрессии при РА могло повлиять ослабление репрессирующего действия теломерного гетерохро-матина вследствие сокращения теломерных повторов. Ген CTBP1 снижает процессы репарации ДНК после различного вида повреждений, однако через репрессию проапоп-тотических белков семейства Bcl-2 он также способствует выживанию клеток [22]. Поэтому усиление экспрессии CTBP1 может ингибировать процесс апоптоза и стимулировать пролиферацию, миграцию, выживание клеток с нестабильным геномом, что может приводить к развитию онко-патологии. CTBP1 принимает участие в деацетилировании, метилировании/деметилировании гистонов, в частности H3, благодаря связыванию с гистоновыми деацетилазами (HDAC) и гистоновыми метилтрансферазами [23]. Известно участие данного белкового фактора в составе корепрес-сорного комплекса (Pc2, Ubc9, HPC2 и PIAS1) в процессе сумоилирования, при этом гистон H4 является одной из мишеней для такого способа подавления транскрипции гена [22]. Последние исследования продемонстрировали роль сумоилирования в прогрессии РА: SUMO-связывающий белок UBC9 активизирует пролиферацию, миграцию и клеточную инвазию фибробластоподобных синовиоцитов в модели in vitro [24].
Мы наблюдали уменьшение количества транскриптов мРНК гена IRF2 в группах пациентов с умеренной и высокой степенью активности РА. Снижение экспрессии IRF2 зарегистрировано также у пациентов с раком желудка и другими заболеваниями, но данный феномен обеспечивался не укорочением длины теломер на 4q-плече, а другим эпигенетическим механизмом регуляции экспрессии генов с помощью микроРНК. MiR-18a связывается с З'-нетранслируемой областью мРНК IRF2 и подавляет экспрессию гена на посттранскрипционном уровне [25]. Однако отсутствуют данные о количестве белка IRF2 в клетках периферической крови больных РА. Доказано, что факторы IRF1 и IRF2 осуществляют позитивную регуляцию транскрипции фактора активации B-клеток семейства TNF (BAFF) как участники IFN I-опосредованного сигналинга [26]. Повышенный уровень BAFF детектируется у пациентов с РА в сыворотке крови и синовиальной жидкости, что может объяснять поддержание аутореактивных клонов B-клеток. Кроме того, было показано, что увеличение экспрессии BAFF приводит к появлению антител к ДНК, ревматоидного фактора и циркулирующих иммунных комплексов, а также коррелирует с активностью аутоиммунных заболеваний [27].
Пациенты с высокой активностью заболевания обладали более высокой экспрессией гена TLR-2 по сравнению с пациентами с умеренной активностью. Недавние исследования показали, что TLR-2 является ключевым медиатором в процессах миграции клеток, а также в инвазивных и деструктивных механизмах, происходящих в суставе при РА [28]. Активация TLR-2 в синовиальных фибробластах у больных РА приводила к увеличению продукции большого количества провоспалительных цитокинов, включая IL-1 ß и TNFa. В исследованиях на культурах клеток была показана связь между активацией TLR-2, -3, -4 и повышенным синтезом матриксных металлопротеиназ, ответственных за разрушение тканей благодаря своей катаболической активности [29]. Кроме того, синовиальные клетки пациентов с РА несут на своей поверхности больше молекул TLR-2 и других TLR по сравнению с донорскими образцами [29]. Поэтому данную молекулу можно рассматривать как наиболее перспективную для таргетной терапии аутоиммунного воспаления.
Белок TNIP2 участвует в TNFa-опосредованной активации митоген-активируемых протеинкиназ (MAPK1/2), стабилизируя киназу Tlp2 [30]. Кроме того, было показано, что TNIP2 способен связываться с Baf60a — субъединицей хроматин-ремодулирующего комплекса SWI/SNF, который в свою очередь позитивно регулирует TLR-4-индуцированные гены в макрофагальных клетках [31]. Однако мы не получили достоверных изменений уровня экспрессии гена TNIP2 у пациентов с РА. Мы предполагаем, что укорочение длины теломер не оказывает значимого влияния на экспрессию данного гена, так как он расположен более чем в 1 Mb от тело-мерных повторов p-плеча.
Заключение
Укорочение длины теломер является одним из триггеров клеточного старения и биомаркером возраст-ассоциированных заболеваний. При ревматоидном артрите выявляются уникальные признаки старения иммунной системы как на клеточном, так и на молекулярном уровне. Мы установили, что теломерный профиль пациентов с РА характеризуется достоверно более короткими теломерами на p-плече 4-й хромосомы. Однако изменения экспрессии исследованных нами генов 4-й хромосомы носили лишь характер тенденции. Увеличение количества мРНК гена CTBP1 может быть связано со снижением репрессирующего действия теломерного гетерохрома-тина вследствие уменьшения числа теломерных повторов. Уменьшение экспрессии гена IRF2, по-видимому, обеспечивается другими эпигенетическими механизмами регуляции транскрипции. Наблюдалась обратная зависимость между активностью заболевания и длиной теломер на p-плече 10-й хромосомы. Учитывая, что укорочение теломер одних хромосом может приводить к потере стабильности других хромосом, можно предположить, что этот феномен может лежать в основе инициации патологического процесса. Дальнейшие исследования позволят раскрыть полную картину сигнальных путей, ответственных за развитие ревматоидного артрита, выявить способы модификации уровня активности данных молекул и установить новые мишени для терапии заболевания.
Финансирование. Исследование выполнено при поддержке Российского научного фонда (грант № 14-1500346).
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
литература
1. Мошнина М.А. Генетика ревматоидного артрита. Научно-практическая ревматология. 2005; 4: 62—8.
2. Eyre S., Bowes J., Diogo D., Lee A. et al. High-density genetic mapping identifies new susceptibility loci for rheumatoid arthritis. Nature Genet. Lett. 2012; 44(12): 1336—40.
ORIGINAL ARTICLE
3. Costenbader K.H., Prescott J., Zee R.Y., DeVivo I. Immunosenes-cence and rheumatoid arthritis: Does telomere shortening predict impending disease? Autoimmun. Rev. 2011; 10(9): 569—73.
4. Борисов В.И., Кожевников В.С., Сенюков В.В. и др.Раннее старение иммунной системы при ревматоидном артрите. Российский иммунологический журнал. 2007; 1(2): 144—9.
5. Schonland S.O., Lopez C., Widmann T. et al. Premature telomeric loss in rheumatoid arthritisis genetically determined and involves both myeloid and lymphoid cell lineages. Proc. Natl. AcadSci. USA. 2003; 100(23): 13471—6.
6. Graakjaer J., Pascoe L., Der-Sarkissian H., Thomas G., Kolvraa S. et al. The relative lengths of individual telomeres are defined in the zygote and strictly maintained during life. Aging Cell. 2004; 3: 97—102.
7. Xing J., Ajani J.A., Chen M. et al. Constitutive short telomere length of chromosome 17 p and 12 q but not 11 q and 2 p are associated with an increased risk for esophageal cancer. Cancer Prev. Res. 2009; 2(5): 459—65.
8. Zheng Y.L., Zhou X., Loffredo C.A., Shields P.G., Sun B. Telomere deficiencies on chromosomes 9p, 15p, 15q and Xp: potential biomarkers for breast cancer risk. Hum. Mol. Genet. 2010; 20(2): 378—86.
9. Huehn J., Polansky J.K., Hamann A. Epigenetic control of FOXP3 expression: the key to a stable regulatory T-cell lineage? Nature Rev. Immunol. 2009; 9(2): 83—9.
10. Baur J.A., Zou Y., Shay J.W., Wright W.E. Telomere position effect in human cells. Science. 2001; 292: 2075—7.
11. Lou Z., Wei J., Riethman H., Baur J.A., Voglauer R. et al. Telomere length regulates ISG15 expression in human cells. Aging (Albany N.Y.). 2009; 1(7): 608—21.
12. Buxton J.L., Suderman M., Pappas J.J., Borghol N., McArdle W. et al. Human leukocyte telomere length is associated with DNA methylation levels in multiple subtelomeric and imprinted loci. Nature Scient. Reps. 2014; 4: 49—54.
13. Blinova E.A., Zinnatova E.V., Barkovskaya M.Sh., Borisov V.I. et al. Telomere length of individual chromosomes in patients with rheumatoid arthritis. Bull. Exp. Biol. Med. 2016; 160(6): 779—82.
14. Bangs C.D., Donlon T.A. Metaphase chromosome preparation from cultured peripheral blood cells. Curr. Protocol. Hum. Genet. 2005; 45: 4.1: 4.1.1—19.
15. Poon S.S., Lansdorp P.M. Quantitative fluorescence in situ hybridization (Q-FISH). Curr. Protocol. Cell. Biol. 2001; 18: 18.4.
16. Ye J., Coulouris G., Zaretskaya I. et al. Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinformat. 2012; 13: 134.
17. Hohensinner P., Goronzy J., Weyand C. Targets of immune regeneration in rheumatoid arthritis. Mayo Clin. Proc. 2014; 89(4): 563—75.
18. Жданова Н.С., Минина Ю.М., Рубцов Н.Б. Биология теломер млекопитающих. Молекул. биол. 2012; 46(4): 1—17.
19. Pickett H., Cesare A., Johnston R., Neumann A., Reddel R. Control of telomere length by a trimming mechanism that involves generation of t-circles. EMBO J. 2009; 28: 799—809.
20. Morrish T.A., Greider C.W.Short telomeres initiate telomere recombination in primary and tumor cells. PLoS Genet. 2009; 5(1): e1000357.
21. de Lange T. Shelterin: the protein complex that shapes and safeguards human telomeres. Genes. Dev. 2005; 19(18): 2100—10.
22. Stankiewicz T.R., Gray J.J., Winter A.N., Linseman D.A. C-terminal binding proteins: central players in development and disease. Biomol. Concepts. 2014; 5(6): 489—511.
23. Shi Y., Sawada J., Sui G., Affar el B., Whetstine J.R., Lan F. et al. Coordinated histone modifications mediated by a CtBP co-repressor complex. Nature. 2003; 422 (6933): 735—8.
24. Li F., Li X., Kou L., Li Y., Meng F., Ma F. SUMO-conjugating enzyme UBC9 promotes proliferation and migration of fibroblast-like synoviocytes in rheumatoid arthritis. Inflammation. 2014; 37(4): 1134—41.
25. Chen Y.-J., Wu H., Zhu J.-M., Li X.-D., Luo S.-W. et al. MicroRNA-18a modulates P53 expression by targeting IRF2 in gastric cancer patients. J. Gastroenter. Hepatol. 2016; 31: 155—63.
26. Sjostrand M., Johansson A., Aqrawi L., Olsson T., Wahren-Herlenius M., Espinosa A. The expression of BAFF is controlled by IRF transcription factors. J. Immunol. 2016; 196(1): 91—6.
27. Wei F., Chang Y., Wei W. The role of BAFF in the progression of rheumatoid arthritis. Cytokine. 2015; 76(2): 537—44.
28. McGarry T., Veale D.J., Gao W., Orr C., Fearon U., Connolly M.
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
Toll-like receptor 2 (TLR2) induces migration and invasive mechanisms in rheumatoid arthritis. Arthr. Res. Ther. 2015; 17: 153.
29. Волков М.Ю. Роль Toll-подобных рецепторов и их эндогенных лигандов в патогенезе ревматоидного артрита. Научно-практическая ревматология. 2016; 54(1): 78—85.
30. Handoyo H., Stafford M., McManus E., Baltzis D., Peggie M., Cohen P. IRAK1-independent pathways required for the interleukin-1-stimulated activation of the Tpl2 catalytic subunit and its dissociation from ABIN2. Biochem. J. 2009; 424(1): 109—18.
31. Gantke Th., Sriskantharajah S., Ley S.C. Regulation and function of TPL-2, an IkB kinase-regulated MAP kinase kinasekinase. Cell res. 2011; 21(1): 131—45.
references
1. Moshnina M.A. Rheumatoid arthritis genetics. Nauchno-Praktiches-kayarevmatologiya. 2005; (4): 62—8. (in Russian)
2. Eyre S., Bowes J., Diogo D., Lee A. et al. High-density genetic mapping identifies new susceptibility loci for rheumatoid arthritis. Nature Gen. Lett. 2012; 44(12): 1336—40.
3. Costenbader K.H., Prescott J., Zee R.Y., DeVivo I. Immunosenes-cence and rheumatoid arthritis: Does telomere shortening predict impending disease? Autoimmun. rev. 2011; 10(9): 569—73.
4. Borisov V.I., Kozhevnikov V.S., Senyukov V.V. et al. Early aging of immune system in rheumatoid arthritis patients. rossiyskiy immuno-logicheskiy zhurnal. 2007; 1(2): 144—9. (in Russian)
5. Schonland S.O., Lopez C., Widmann T. et al., Premature telomeric loss in rheumatoid arthritis is genetically determined and involves both myeloid and lymphoid cell lineages. Proc.Natl. Acad. Sci. USA.. 2003; 100(23): 13471—6.
6. Graakjaer J., Pascoe L., Der-Sarkissian H., Thomas G., Kolvraa S. et al. The relative lengths of individual telomeres are defined in the zygote and strictly maintained during life. Aging Cell. 2004; 3: 97—102.
7. Xing J., Ajani J.A., Chen M. et al. Constitutive short telomere length of chromosome 17 p and 12 q but not 11 q and 2 p are associated with an increased risk for esophageal cancer. Cancer Prev. res. 2009; 2(5): 459—65.
8. Zheng Y.L., Zhou x., Loffredo C.A., Shields P.G., Sun B. Telomere deficiencies on chromosomes 9p, 15p, 15q and Xp: potential biomark-ers for breast cancer risk. Hum. Mol. Genet. 2010; 20(2): 378—86.
9. Huehn J., Polansky J.K., Hamann A. Epigenetic control of FOXP3 expression: the key to a stable regulatory T-cell lineage? Naure. rev. Immunol. 2009; 9(2): 83—9.
10. Baur J.A., Zou Y., Shay J.W., Wright W.E. Telomere position effect in human cells. Science. 2001; 292: 2075—7.
11. Lou Z., Wei J., Riethman H., Baur J.A., Voglauer R. et al. Telomere length regulates ISG15 expression in human cells. Aging (Albany N.Y.). 2009; 1(7): 608—21.
12. Buxton J.L., Suderman M., Pappas J.J., Borghol N., McArdle W. et al. Human leukocyte telomere length is associated with DNA methylation levels in multiple subtelomericand imprinted loci. Nature Scient. rep. 2014; 4: 49—54.
13. Blinova E.A., Zinnatova E.V., Barkovskaya M.Sh., Borisov V.I. et al. Telomere length of individual chromosomes in patients with rheumatoid arthritis. Bull. Exp. Biol. Med. 2016; 160(6): 779—82.
14. Bangs C.D., Donlon T.A. Metaphase chromosome preparation from cultured peripheral blood cells. Curr. Protocol. Hum. Genet. 2005; 45: 4.1: 4.1.1—19.
15. Poon S.S., Lansdorp P.M. Quantitative fluorescence in situ hybridization (Q-FISH). Curr. Protocol. Cell. Biol. 2001; 18: 18.4.
16. Ye J., Coulouris G., Zaretskaya I. et al. Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinformat. 2012; 13: 134.
17. Hohensinner P., Goronzy J., Weyand C. Targets of immune regeneration in rheumatoid arthritis. Mayo Clin. Proc. 2014; 89(4): 563—75.
18. Zhdanova N.S., Minina Yu.M., Rubtsov N.B. Mammalian telomere biology. Molecular biology. 2012; 46(4): 1—17.
19. Pickett H., Cesare A., Johnston R., Neumann A., Reddel R. Control of telomere length by a trimming mechanism that involves generation of t-circles. EMBO J. 2009; 28: 799—809.
20. Morrish T.A., Greider C.W. Short telomeres initiate telomere recombination in primary and tumor cells. PLoS Genet. 2009; 5(1): e1000357.
21. de Lange T. Shelterin: the protein complex that shapes and safeguards human telomeres. Genes. Dev. 2005; 19(18): 2100—10.
22. Stankiewicz T.R., Gray J.J., Winter A.N., Linseman D.A. C-terminal binding proteins: central players in development and disease. Biomol. Concepts. 2014; 5(6): 489—511.
23. Shi Y., Sawada J., Sui G., Affar el B., Whetstine J.R., Lan F. et al. Coordinated histone modifications mediated by a CtBP co-repressor complex. Nature. 2003; 422(6933): 735—8.
24. Li F., Li X., Kou L., Li Y., Meng F., Ma F. SUMO-conjugating enzyme UBC9 promotes proliferation and migration of fibroblast-like synovio-cytes in rheumatoid arthritis. Inflammation. 2014; 37(4): 1134—41.
25. Chen Y.-J., Wu H., Zhu J.-M., Li X.-D., Luo S.-W. et al. MicroRNA-18a modulates P53 expression by targeting IRF2 in gastric cancer patients. J. Gastroenterol. Hepatol. 2016; 31: 155—63.
26. Sjostrand M., Johansson A., Aqrawi L., Olsson T., Wahren-Herlenius M., Espinosa A. The expression of BAFF is controlled by IRF transcription factors. J. Immunol. 2016; 196(1): 91—6.
27. Wei F., Chang Y., Wei W. The role of BAFF in the progression of rheumatoid arthritis. Cytokine. 2015; 76(2): 537—44.
28. McGarry T., Veale D.J., Gao W., Orr C., Fearon U., Connolly M. Toll-like receptor 2 (TLR2) induces migration and invasive mechanisms in rheumatoid arthritis. Arthr. res. Ther. 2015; 17: 153.
29. Volkov M.Yu. Role of Toll-like receptors and their endogenous li-gands in the pathogenesis of rheumatoid arthritis. Nauchno-prak-ticheskaya revmatologiya. 2016; 54(1): 78—85. (in Russian)
30. Handoyo H., Stafford M., McManus E., Baltzis D., Peggie M., Cohen P. IRAK1-independent pathways required for the interleukin-1-stimulated activation of the Tpl2 catalytic subunit and its dissociation from ABIN2. Biochem. J. 2009; 424(1): 109—18.
31. Gantke Th., Sriskantharajah S., Ley S.C. Regulation and function of TPL-2, an IkB kinase-regulated MAP kinase kinasekinase. Cell res. 2011; 21(1): 131—45.
Поступила 03.10.16 Принята в печать 03.11.16
